Abstract
Fundo
O cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte por cancro em todo o mundo. Radiorresistência de células de câncer de pulmão resulta em taxa inaceitável de falha loco-regional. Embora a radiação é conhecido por induzir a apoptose, o nosso estudo recente mostrou que o knockdown de proteínas pró-apoptóticas Bak e Bax resultou num aumento da morte celular e autophagic radiossensibilidade cancro do pulmão
In vitro
. Para explorar ainda mais o potencial de inibição da apoptose, como forma de sensibilizar o cancro do pulmão para a terapia, testamos M867, um romance química e reversível inibidor da caspase-3, em combinação com radiação ionizante
in vivo
e
In vitro
.
métodos e resultados
M867 reduziu a sobrevivência clonogênica em células de câncer de pulmão H460 (DER = 1,27, p = 0,007) em comparação com as células tratadas tratados com o veículo. Descobrimos que a administração de M867 por radiação ionizante em um
in vivo
rato traseira modelo de cancro do pulmão do membro foi bem tolerada, e produziu um atraso no crescimento tumoral significativa em comparação com somente radiação. A diminuição dramática na vasculatura tumoral foi observado com M867 e radiação usando coloração factor de von Willebrand. Além disso, o Índice de Ki67 mostrou redução de 5 vezes da proliferação tumoral no grupo de terapia de combinação, apesar dos níveis reduzidos de apoptose observados com desoxinucleotidil transferase terminal de dUTP mediada por Nick rotulagem final coloração. Radiosuscetível efeito do M867 através de caspases inibidoras foi validado
usando
caspase-3 /-7 duplo knockout (NSO) do rato modelo de células de fibroblastos embrionárias (MEF). Consistente com o nosso estudo anterior, autofagia contribuiu para o mecanismo de aumento da morte celular, a inibição da apoptose. Além disso, o ensaio de matrigel mostraram uma diminuição na
in vitro
formação de túbulos endotelial durante o /tratamento de combinação de radiação M867.
Conclusões
M867 aumenta os efeitos citotóxicos da radiação no pulmão câncer e sua vasculatura tanto
in vitro
e
in vivo
. M867 tem o potencial para prolongar o atraso do crescimento do tumor por inibição da proliferação do tumor. Os ensaios clínicos são necessários para determinar o potencial desta terapia de combinação em pacientes com câncer de pulmão localmente avançado
Citation:. Kim KW, Moretti L, Lu B (2008) M867, um romance inibidor selectivo da Caspase-3 Melhora a morte celular e se estende Atraso no Crescimento do Tumor em irradiado do cancro do pulmão Models. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10.1371 /journal.pone.0002275
Autor: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, dos Estados Unidos da América
Recebido: 05 de fevereiro de 2008; Aceito: 17 de abril de 2008; Publicado em: 28 de maio de 2008 |
Direitos de autor: © 2008 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte por os EUA National Cancer Institute (NCI) Grant 1R01 CA125842-01A1. Os financiadores não tiveram nenhum papel na concepção e realização do estudo, na coleta de dados, análise e interpretação e decisão de publicar, revisão, aprovação, ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.
Introdução
o câncer de pulmão é o câncer mais prevalente no mundo, e a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer, apesar da terapia multi-modalidade, resultando em 160,390 mortes estimadas em Estados Unidos somente em 2007 [1]. Uma vez que os limites de resistência do tumor eficácia dos tratamentos actuais [2], [3], [4], tais como a radioterapia, a identificação de novas estratégias terapêuticas é crítico para melhorar o resultado. Dos diferentes processos de morte celular envolvidos no tratamento do cancro, a apoptose tem sido o mais bem estudado [5]. Durante a apoptose, os principais mediadores da destruição celular são efectores da caspase-3 e -7, membros da família de proteases de aspartato de cisteína, que clivam proteínas após um resíduo de aspartato [6]. Embora a radiação é conhecido por induzir a apoptose, no entanto, é responsável por uma porção menor de morte celular nos tumores sólidos irradiados [7], e o nosso estudo recente mostrou que o knockdown de proteínas pró-apoptóticas Bak e Bax resultou num aumento da radiossensibilidade cancro do pulmão
in vitro
[8]. Autophagy, um tipo de morte celular não apoptóticas, foi demonstrado que contribui para o mecanismo de aumento da morte celular.
Autophagy é um processo evolutivamente conservadas e um mecanismo de sobrevivência que permita a reciclagem de organelas e proteínas de longa duração [ ,,,0],9], [10]. Autofagia também serve como uma via de suicídio com a auto-digestão completa sob condições de estresse excessivos [11], [12], que é classificado como celular programada Tipo morte 2 [9], [10]. Durante autofagia, a degradação do organelo ocorre através da formação de vacúolos citoplasmáticos de dupla membrana, chamadas autofagossomas com núcleos intactos [13]. regulação autofagia tem sido de interesse crescente, devido à sua implicação na tumorigênese. Além disso, autofagia prolongada pode conduzir à morte de células de cancro, que conduz à hipótese de que a autofagia pode ser explorada como um alvo a terapia do cancro [14], [15], [16], [17].
Para mais explorar o potencial de inibição da apoptose, como forma de sensibilizar o cancro do pulmão para a terapia, testamos M867, um romance química e reversível caspase-3 inibidor [18], em combinação com radiação ionizante
in vivo
e
in vitro
.
Materiais e Métodos
cultura celular
principal do mouse fibroblastos embrionárias (MEFs) foram derivados de tipo selvagem (WT) e Caspase3
– /- /7
– /- (knockout duplo NSO) ratinhos e imortalizadas por transfecção com um plasmídeo que contém o SV40-T-antigénio (fornecido pelo Dr. Richard Flavell, Universidade de Yale, New Haven, CT). MEFs foram cultivadas em DMEM (Invitrogen Corporation) suplementado com 10% de fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina e 0,5 mmol /L 2-mercaptoetanol. células de cancro de pulmão H460 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY) suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C e humidificada com 5% de CO2. As HUVECs foram obtidas em Clonetics e foram mantidas em EBM-2 suplementado com EGM-2 mV aliquotas individuais (BioWhittaker). M867 foi obtido a partir de Merck Co., Inc.
clonogênica Ensaio
H460 células de câncer de pulmão foram tratadas com DMSO ou M867 (1,4 nM, 5 nM e 10 nM para 24 horas); células WT MEFs e caspase 3/7 células NSO MEFs foram tratadas com DMSO ou M867 (5 nM e 10 nM para 24 horas); e MEFs células foram tratadas com ARNsi contra a caspase-3 e-7, ARNsi contra beclin-1 e Atg5, ou controlo. As células foram então irradiadas com 0-6 Gy como indicado, a uma taxa de dose de 1,8 Gy /min, utilizando-se de um
137 Cs irradiador (J. L. Shepherd e Asssociates, Glendale, CA). Após a irradiação, as células foram incubadas a 37 ° C durante 8-10 dias. As células foram fixadas durante 15 min com 3: 1 de metanol: ácido acético e coradas durante 15 min com violeta cristal 0,5% (Sigma) em metanol. Após a coloração, as colónias foram contadas utilizando um limite de exclusão de 50 células viáveis. fracção sobrevivente foi calculada como (média da contagem de colónias) /(células inoculadas) × (plaqueamento eficiência (PE)), em que PE foi definida como (a média da contagem de colónias) /(células inoculadas para os controlos não irradiados). DER foi calculado como a dose (Gy) para a radiação sozinha dividida pela dose (Gy) para a radiação mais M867 (normalizado para a toxicidade M867) necessário para uma fracção sobrevivente de 0,25. Os experimentos foram realizados em triplicado e dizer, SD, e os valores de P foram calculados.
Immunoblotting
Cells (0,5 × 10
6) foram tratados com vários Gy e drogas. Eles foram recolhidos em vários pontos de tempo, e, em seguida, foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, duas vezes antes da adição de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 1% de NP40, 50 mM de NaF, 1 mM de Na3VO4, 1 mM NaMO4 e inibidor de cocktail (Sigma, 5 ul /ml). a concentração de proteína foi quantificado pelo método da Bio-Rad. quantidades iguais de proteína foram carregadas em cada poço e separados por gel de SDS-PAGE a 12,5%, seguido por transferência para PVDF-membranas ( . Bio-Rad) As membranas foram bloqueadas por utilização de leite em pó magro 5% em PBS-T durante 1 h à temperatura ambiente As manchas foram então incubadas com a caspase-3 (sinalização celular);. Caspase-7 (de sinalização celular); LC-3 (Medical Biological Laboratories Co. Ltd); anticorpos e actina durante 1 h a 4; Akt, fosfo-Akt (Ser-473), proteína ribossomal S6, e da proteína ribossómica de fosfo-S6 (Ser-240/244) (Cell Signaling) . ° C de cabra anti-IgG de coelho secundário (1: 5000, Santa Cruse Biotechnologies).. foi incubada durante 45 minutos à temperatura ambiente imunoblots foram desenvolvidas usando o sistema de detecção de quimioluminescência (Perkin Elmer) de acordo com o protocolo e autorradiografia do fabrico
Medição da apoptose
células (2,5 × 10
5) foram semeadas em 10mm pratos para cada ponto de dados. Após 24 h de 37 ° C de incubação, H460 células foram tratadas com M867 (100 nM durante 2 horas) e imediatamente irradiada com 5Gy, 10Gy ou 20 Gy, e WT e Caspase3
– /- /7
– /- NSO as células foram irradiadas com ou 5Gy 10Gy. Depois de 24h, as células foram tratadas com 1 mL de Accutase (mantendo todas as células flutuantes) para 4min e então contado para cada amostra. As células foram centrifugadas e re-suspensas em 1 × tampão de ligação a uma concentração de ~ 1 × 10
6 células /ml. 100 ul da solução (~ 1 × 10
5 células) foram transferidos num tubo de FACS 5 mL, adicionou-se 1,2 ul de Anexina V FITC e 1,2 ul de PI. Após incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro, a 400 uL de 1 x tampão de ligação foram adicionados a cada tubo. A taxa de apoptose foi medida utilizando o kit de detecção de apoptose Anexina V-isotiocianato de fluoresceína I (Pharmingen) com citometria de fluxo.
Autophagy Ensaio
MEFs As células foram transfectadas com 2,5 ug de expressão da GFP-LC3 plasmídeo (oferta do Dr. Norboru Mizushima) [19] utilizando o reagente de Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies). Depois de 24h, as células foram tratadas com 5Gy de radiação, com ou sem dose de M867. Após 24h e 48h, observou-se a fluorescência de GFP-LC3 confocal utilizando fluoroscopia.
Transfection siRNA
ARNsi contra rato caspase-3 e-7, beclin, e ARNsi de controlo foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnologies. siRNA Atg5 (mouse) foi sintetizado por Dharmacon Research. O sentido e anti-sentido foram fios de Atg5 começou no nucleótido, 5′-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 ‘(sentido) e 3′-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5’. (Anti-sentido) As células foram transfectadas com 25 nM de ARNsi utilizando Lipofectamina 2000. As células transfectadas foram utilizados para experiências 24h mais tarde
Célula endotelial ensaio Morphorgenesis:. A formação de túbulos
HUVECs cultivadas para ~ 70% de confluência foram tratados com 5 nM M867, 3Gy, ou terapia de combinação. As células foram então tripsinizadas e contadas. Elas foram semeadas a 48000 por po em placas de 24 poços revestidas com 300 ul de Matrigel (BD Biosciences). Estas células sofrem diferenciação em estruturas tubulares do tipo capilar periodicamente observadas por microscopia. 24h depois, as células foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) e fotografias foram tiradas através de microscópio. O número médio de túbulos foi calculado a partir do exame de três campos separados microscópicas (100 ×) e fotografias representativas foram tomadas.
avaliação de volume de tumor
células cancerosas humanas H460 pulmonares foram usados em um modelo de xenotransplante em ratinhos nus atímicos fêmeas (nu /nu), 5-6 semanas de idade [Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN]). Uma suspensão de 1 × 10
6 células num volume de 50 ul foi injectado subcutaneamente no flanco posterior esquerdo de ratinhos utilizando uma agulha de calibre 27½. Os tumores foram cultivadas para 6-8d até volume médio do tumor atingiu 0,25 centímetros
3. Os grupos de tratamento consistia de controle do veículo (em DMSO), M867, veículo mais radiação e M867 mais radiação. Cada grupo de tratamento continha 5 ratinhos. DMSO ou M867 foi administrado diariamente por injecção intraperitoneal (i.p.) em doses de 2 mg /kg durante 7 dias consecutivos. No caso do tratamento de combinação, droga ou veículo foi dada por 2d antes da primeira dose de irradiação. Os ratos em grupos de radiação foram irradiadas 1h após a droga ou veículo tratamento com frações diárias 2 Gy dadas ao longo de 5 dias consecutivos. Os tumores nos flancos dos murganhos foram irradiados utilizando um irradiador de raios-X (Therapax, Agfa NDT, Inc., Cidade de Lewis, PA). A não portadores de tumor partes dos ratos estavam protegidos por blocos de chumbo. Os tumores foram medidos 2-3 vezes por semana em 3 dimensões perpendiculares utilizando um compasso de calibre de Vernier e o volume foi calculado utilizando a fórmula modificada elipse de volume (volume = (altura x largura x profundidade) /2). atraso de crescimento foi calculada para os grupos de tratamento em relação aos tumores de controlo.
secções histológicas, o vWF, Ki67 e TUNEL coloração
Ratos foram implantados com células H460 e tratada tal como descrito acima nos estudos de volume de tumor. Após tratamentos diários de 7d, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram fixados em parafina. As lâminas de cada grupo de tratamento foram, em seguida, coradas para o factor de von Willebrand (vWF), utilizando o anticorpo anti-vWF policlonal (Chemicon). Os vasos sanguíneos foram quantificadas por selecção aleatória de 400 × campos e contando o número de vasos sanguíneos por campo. Isto foi feito em triplicado e a média dos três contagens foi calculada. Ki67 e desoxinucleotidil-transferase terminal de mediada por fim dUTP nick rotulagem coloração (TUNEL) foram realizadas no laboratório central patologia Vanderbilt University utilizando protocolos padrão. Número de células positivas por campo foram marcados e traçadas pela média de três avaliações repetidas.
A análise estatística
Análise dos resultados dos estudos voltados para testar as diferenças do volume tumoral média entre os grupos de tratamento e horário diferente pontos. A análise dos dados foi completada usando o máximo modelo de efeitos mistos à base de probabilidade /restrito residual para ajustar o efeito intracorrelation para os ratinhos que tinham múltiplas medições. O modelo relatado no jornal foi selecionada com base em critério de Bayesian do Schwarz. Todos os testes de significância foram 2 faces, e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p foi inferior a 0,05. Um pacote estatístico SAS v8.2, foi usado para todas as análises.
Resultados
M867 inibiu a apoptose mas realçou a sensibilidade à radiação em células de câncer de pulmão H460
Para testar o efeito de inibição da caspase-3 na sensibilidade à radiação do cancro do pulmão, H460 células foram tratadas com o novo inibidor reversível M867 em combinação com radiação ionizante. As colónias sobreviventes foram contadas 8 dias mais tarde. ensaio de sobrevivência clonogénica, mostrado na Figura 1A, demonstrou uma diminuição da sobrevivência em vários grupos de dosagem, com 10 nM de M867 resultando no maior melhoramento na sensibilidade à radiação, como comparado com o controlo (DER = 1,27, p = 0,007). O nível de apoptose em células H460 após tratamento foi medida M867 (100 nM durante 2 horas) e a irradiação com 20 Gy de 5Gy, utilizando um ensaio de Anexina-V. Foi previamente mostrado que a Anexina V a ligação foi bloqueada por M867 com um IC
50 80 nM de [20]. Como mostrado na Figura 1B, o nível de apoptose foi progressivamente elevado com o aumento das doses de radiação. 20% de células H460 foram irradiados a 20 Gy apoptótica. Quando M867 foi dada antes da radiação, as células apoptóticas foram diminuídos para metade em ambos os níveis de dose baixa e elevada de radiação. Estes resultados demonstram que a sensibilização de células de cancro de pulmão H460 a radiação ionizante foi associado com a diminuição da apoptose.
células NSCLC H460 (A) foram tratados com controlo de DMSO, M867 (gama de dose 1,4-10 nM, durante 24 horas) com radiação. Após 8 d, as colónias foram coradas e as colônias marcados foram representados graficamente. As curvas de sobrevida para H460 células ± tratamento M867. Pontos, quer dizer; bares, SD (
P
= 0,007). Mostram-se a média +/- o desvio padrão de três experiências separadas repetidas. (B) ensaio de Anexina-V que mostra o nível de apoptose em células tratadas com H460 por qualquer controlo, 100 nM de M867 durante 2 h, a radiação (5, 10 ou 20 Gy), e ambos modalidade. Isto foi feito em triplicado e a média dos três contagens foi calculada. Colunas, média; bares, SD.
Combinado M867 /tratamento de radiação prolonga atraso no crescimento do tumor e é bem tolerado no modelo de xenoenxerto de pulmão
Depois de estabelecer a eficácia
in vitro Compra de radiossensibilização induzida M867 de células de câncer de pulmão, um modelo de xenotransplante membro do mouse traseira foi gerado para explorar a resposta de radiação por M867
in vivo
. células de cancro de pulmão H460 foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos, e os tumores foram deixados crescer durante cerca de 7 dias para produzir um volume tumoral médio de 0,25 centímetros
3 antes da terapia. Os grupos de tratamento consistiram de um veículo de controlo, M867, veículo mais a radiação, e combinação de M867 mais radiação. M867 foi administrado diariamente por injecção intraperitoneal de 2 mg /kg durante 7 dias consecutivos. Hind xenoenxertos tumorais membro H460 em murganhos foram tratados como descrito na secção Materiais e Métodos. atraso de crescimento foi calculada como o número de dias necessários para atingir um volume do tumor de 2 cm
3 para os grupos de tratamento em relação aos tumores de controlo. Como mostrado na Figura 2A, um retardamento do crescimento tumoral significativa foi observada com a terapia de combinação de M867 e de radiação em comparação com a irradiação por si só (26 vs 20 dias, p 0,005), e M867 sozinho tinha também afectar significativamente o crescimento do tumor em comparação com o controlo (~ 4 dias de atraso, p = 0,003). Isto sugere que M867 pode aumentar a resposta do tumor em combinação com radioterapia. Além disso, as alterações de peso corporal foram também monitorados nos ratos para avaliar se o tratamento com M867, radiação, tratamento ou combinação produziu toxicidade sistémica (Figura 2B). Só a perda de peso foi mínima em 10 dias após o tratamento M867 e irradiação combinada. Alterações no peso corporal após este período de tempo refletiu o crescimento do tumor. Como esperado, o grupo de tratamento de combinação, que teve o atraso do crescimento tumoral mais prolongado, teve o menor aumento no peso corporal.
H460 células de câncer de pulmão foram subcutaneamente xenoenxerto em ratinhos atímicos. Após 6-8 dias, os ratinhos foram tratados diariamente durante 7 dias, com o veículo de controlo, M867 (2 mg /kg), e, em seguida, foram tratados uma hora após o tratamento com fármaco 2 Gy de radiação, diariamente durante 5 dias consecutivos. Tumor foi excisado quando atingiram o tamanho de aproximadamente 2,5-3,0 cm
3 e atraso do crescimento do tumor, tal como definido pelo número de dias necessários para atingir um volume do tumor de 2 cm
3 foi medida. Os tumores (A) foram medidos regularmente e atraso de crescimento foi calculada para os grupos de tratamento em relação aos tumores de controlo. A terapia bi-modalidade combinada induziu um atraso no crescimento tumoral marcado quando comparado com radiação sozinha (26 vs 20 dias, p 0,005). (B) Os pesos corporais foram medidos a cada 5 dias e peso corporal rácio foi calculado em relação à medida de referência.
M867 reduz índice de proliferação do tumor apesar acentuada diminuição na apoptose em H460 irradiado xenotransplante rato
para determinar o mecanismo que contribui para o atraso do crescimento do tumor após a terapia de combinação, o índice de proliferação de Ki67 foi examinada utilizando secções de tumor H460 fixos em todos os grupos de tratamento. Como mostrado na Figura 3A, M867 mais a combinação de radiação tratamento resultou em um de 6 vezes (15% vs 92%, p 0,001) e 2 vezes (15% vs 33%, p 0,001) a redução nas células em proliferação em comparação com o controle e sozinho grupos de radiação, respectivamente. A seguir, avaliaram os níveis de apoptose em secções de tumor H460 fixos usando coloração TUNEL. Tal como mostrado na Figura 3B usando coloração TUNEL, combinada M867 e tratamento de radiação resultou em redução de dois terços em apoptose (4,5% vs 15%, p 0,008)., Em comparação com sozinho radiação
cortes histológicos foram obtidos a partir de os tumores dos ratinhos em cada grupo de tratamento a partir do estudo do volume do tumor. Número de células positivas foram marcados e traçadas pela média de três avaliações repetidas. índice proliferativo (a) Média de Ki67 de cada grupo de tratamento foi determinada pela percentagem de células de Ki67-positivas por campo microscópico. Isto foi repetido três vezes. Colunas, quer dizer; Barras, DP. coloração (B) também TUNEL foi realizado em secções de tumores, e índices apoptóticos era semelhante calculada pela percentagem de células positivas TUNEL coradas por campo microscópico. Coluna, quer dizer; bares, SD.
M867 reduz a densidade vascular em modelo de tumor de pulmão irradiado e sensibiliza HUVECs à radiação
Uma vez que a vasculatura do tumor é um alvo para o tratamento do câncer, os ratos foram tratados de modo semelhante aos dos o estudo atraso do crescimento do tumor e as secções de tumor de pulmão fixos foram usadas para determinar os efeitos de M867 e radiação sobre a vasculatura tumoral
in vivo
. As lâminas de cada grupo de tratamento foram analisadas seguinte factor de von Willebrand (vWF) coloração para estudo densidade vascular, como se mostra na Figura 4A. O número de vasos por campo microscópico, foi determinado para cada grupo de tratamento. A terapia de combinação de M867 e radiação (1,3; DP = 0,57) resultou numa redução de 5 vezes dramática no número médio de vasos por campo microscópico em comparação com o controlo (6; SD = 1; p 0,002) e uma ~2- dobrar redução relativa à terapia com radiação sozinha (2,3; DP = 0,57; p 0,007). (Figura 4A)
(a) as secções histológicas foram obtidos a partir dos tumores dos ratinhos em cada grupo de tratamento a partir da
in vivo
tumor estudo volume e coradas para vasos sanguíneos usando um anticorpo para vWF. Os vasos sanguíneos foram quantificadas por selecção aleatória de 400 × campos e contando o número de vasos sanguíneos por campo. Isto foi feito em triplicado e a média dos três contagens foi calculada. Colunas, média; Barras, DP. (B) As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram tratados com 5 nM de M867 e, em seguida, imediatamente irradiada com 0 ou 3 Gy. Seis horas mais tarde, as células foram tripsinizadas e novamente plaqueadas em placas de 24 poços revestidas com Matrigel. Após 24 h, as células foram fixadas e coradas com H E. As lâminas foram examinadas por microscopia (× 100), e os campos representativos são mostrados. (C) túbulos coradas foram então contadas em três campos separados, seleccionadas aleatoriamente. Colunas, número médio de túbulos contados por campo microscópico; bares, SD.
Para investigar mais os efeitos da M867 e radiação sobre formação de vasos sanguíneos, da veia umbilical células endoteliais humanas (HUVECs) foram utilizados para examinar túbulos formação para a função angiogênico
in vitro
. O ensaio de morfogénese de células endoteliais foi realizado para examinar a capacidade de HUVEC tratadas para produzir estruturas tubulares do tipo capilar. Uma imagem representativa e o número médio de tubos contados em três campos separados (x100) estão apresentados na Figura 4B e C, respectivamente. O tratamento com M867 combinada à radiação diminuiu significativamente a formação de túbulos em comparação com a radiação sozinha (5,7 vs 1,7, p 0,001). Sem controle de tratamento teve 13 túbulos (DP = 1,0) por campo microscópico e M867 só tinha 9 túbulos (DP = 1,0), sugerindo um efeito anti-angiogênico do M867, além da rádio-sensibilização
Caspase 3. /7 deficiência promove a sensibilidade à radiação por indução autofagia, na ausência de apoptose
para validar se a inibição de caspases contribuiu para melhorar a terapia de radiação, foram usadas células MEF caspase-3/7 deficiente (NSO). Estas células são capazes de sofrer apoptose, uma vez que falta caspases 3/7, enquanto WT MEFs pode (Figura 5A e 5B). Como mostrado na Figura 5C, MEFs WT tratados com M867 foram mais sensíveis à radiação em comparação com os MEFs WT tratados com DMSO (DER = 1,2 para 5 nM M867, p = 0,017, e DER = 1,62 para 10NM M867, p = 0,001). Não houve diferença significativa na sobrevivência entre as caspases MEFs NSO tratadas com qualquer dose de M867, em comparação com DMSO. Além disso, células transfectadas com WT MEFs caspase-3/7 siRNAs também apresentaram aumento significativo na sensibilidade à radiação, o que sugere que estes resultados não são devidas a variação clonal destas células (dados não apresentados). Com base no nosso estudo anterior, os autores sugerem que o aumento da sensibilidade à radiação em células NSO de caspase pode ser devido a morte celular programada tal como alternativa autofagia [8]. Para testar esta hipótese, WT e caspase 3/7 células NSO foram transfectadas com plasmídeo GFP-LC3. As células com a sinalização ponteada GFP foram contadas como células autofágicos devido à localização lisossomal característica da proteína LC3 durante autofagia [19]. Depois de células WT e caspase NSO foram expostas a 5Gy de radiação, a percentagem de células com punctates GFP foram um aumento de aproximadamente três vezes em células NSO caspase irradiado, em comparação com células irradiadas WT (30% vs 10%, respectivamente) (Figura 6A ). Em 48 h após a radiação, a percentagem de células autofágicos aumentada para ~55% em células NSO de caspase em comparação com 15% no controlo WT. Estes resultados foram também confirmados por avaliação do nível de proteína processada LC3, em que as células NSO caspase apresentaram níveis aumentados de proteínas LC3-I e II seguintes irradiação, em comparação com células WT (Figura 6B). Uma vez que a via mTOR é conhecido por regular a iniciação da autofagia, examinámos sinalização de Akt /mTOR por determinação dos níveis de fosfo-Akt e fosfo-S6, em que as células NSO MEF WT e caspase irradiados. Como mostrado na Figura 6C, os fosfo-proteínas foram aumentados nas células irradiadas WT, enquanto que eles estavam diminuídos no caspase irradiado células NSO MEF. Estes dados sugerem que a sinalização pró-autophagic é sobre-regulada nas células NSO caspase irradiado.
(A) WT e caspase 3/7 NSO MEFs foram incubadas com anexina V-isotiocianato de fluoresceína e de iodeto de propídio 24 h depois irradiação e analisadas por FACScan. Os dados são apresentados como a média de três experiências S.D. clivagem (B) caspase foi determinada por imunotransf erência de caspase-3 clivada após as células NSO MEF WT ou Caspase 3/7 foram tratados com 0, 2,5, 5, 7,5, e 10 Gy. As células foram colhidas após 24. (C) radiossensibilização de WT ou Caspase 3/7 NSO MEFs. As células foram irradiados com as doses indicadas de radiação e tratados com controlo de DMSO ou M867 (gama de dosagem de 5 a 10 nM, durante 24 horas). Após 10 dias, as colónias foram coradas e marcou. Os valores reportados são a média ± D.P.. de três experiências separadas repetidas.
células NSO MEF WT ou Caspase 3/7 GFP-LC3-transfectadas (A) foram tratados com e sem 5 Gy e, em seguida, examinadas por microscopia de fluorescência após 24 h. A percentagem de células com ponteada GFP-LC3 fluorescência foi calculada em relação a todas as células positivas para GFP. As barras de erro são apresentados como média D.P. (B) CL-I e -II de expressão foi determinado por transferência de Western utilizando os lisados de WT e caspase 3/7 células NSO MEF tratados com 0 ou 5 Gy após 24, 48 h. Actina foi sondada para demonstrar o carregamento igual. (C) Também são mostradas as imunotransferências de fosfo-Akt e p-S6, utilizando os lisados de WT e caspase 3/7 células NSO MEF tratados com 0 ou 5 Gy após 30 min. (D) As células NSO MEF WT e caspase 3/7 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi 25 nM dirigidos contra Atg5 e beclin-1 ou (E) transfectada com um vector ou Atg5 e ADNc beclin-1 contendo os plasmídeos. Eles foram, em seguida, irradiada com 0-6 Gy. Após 8 dias, as colónias foram coradas e marcou. Os valores apresentados são a média ± D.P.. de três experiências repetidas separadas.
Autophagy altera a sensibilidade de radiação em caspase 3/7 células deficientes
Para determinar se a autofagia é o mecanismo responsável pela maior radiossensibilidade observada em caspase DKO células, expressão da ATG-5 e beclin-1, duas proteínas autofagia essenciais [21], [22], [23], foram derrubados no tipo selvagem e caspase células NSO. Estudos anteriores mostraram que ARNsi contra beclin-1 e 5-ATG especificamente regulada negativamente a expressão da proteína endógena [8]. Como mostrado na Figura 6D, o tratamento de células NSO de caspase com siRNAs dirigidos contra ATG-5 e beclin-1 aboliu o efeito sensibilizante resultante da eliminação de caspase-3/7 e provocou um aumento significativo na sobrevivência de células clonogénicas, em comparação com o tratamento de controlo ARNsi de caspase As células NSO (DER = 1,34, p = 0,008). Por outro lado, a sobre-expressão de beclin-1 e ATG-5 em células NSO caspase provocou um aumento significativo na morte de células clonogénicas sob o aumento da dose de radiação em comparação com beclin-1 e ATG-5 sobreexpressão em células WT (DER = 1,32, p = 0,008) ( A Figura 6E). Juntos, estes resultados demonstram que o aumento da radiossensibilidade em células NSO caspase é dependente de moléculas-chave autofagia.
Discussão
No presente relatório, primeiro mostrou que o tratamento M867 resultou na radiossensibilização eficaz de pulmão células cancerosas
in vitro
. Os potenciais efeitos terapêuticos por M867 foram então demonstrada em um
in vivo
rato traseira modelo de tumor membro. Além disso, em experiências in vitro mostraram que a caspase-3 células MEF /7-nulos, eram mais sensíveis aos efeitos citotóxicos da radiação, principalmente devido ao aumento da autofagia. Este estudo também sugere que os efeitos sobre a vasculatura M867 pode contribuir para o aumento observado no atraso do crescimento do tumor do pulmão em resposta à radiação.
radioquimioterapia simultânea é um esteio no tratamento de cancro do pulmão avançado, mas o prognóstico desses doentes permanece globalmente pobre. Portanto, novas estratégias são necessárias para melhorar a eficácia do tratamento atual, visando de morte celular não-apoptótica desde apoptose é limitado após a terapia convencional. Recentemente, tem havido uma grande ênfase colocada na autofagia como um alvo a terapia do cancro, em parte, impulsionada por observações de que os tratamentos anti-cancerígenos induzidos autofagia, tais como em células cancerosas irradiadas [17], [24]. Mostrámos recentemente que autofagia pode ser desencadeada por inibir o alvo de mamífero ou de rapamicina (mTOR) via [17] ou por inibição de proteínas pró-apoptóticas Bak /Bax para melhorar os efeitos de radiação
In vitro
[8]. Um alvo muito atraente na via apoptótica é caspase-3, que tem um papel central na apoptose como a caspase efectora dominante envolvido na clivagem proteolítica de substratos de proteínas, incluindo proteínas do citoesqueleto, cinases e enzimas de reparação do ADN. Neste estudo, foram analisados os efeitos potenciais de inibição da caspase-3 em resposta câncer de pulmão à radiação usando o novo inibidor M867. Mostrámos que a administração de M867 em combinação com radiação ionizante diminuiu dramaticamente a sobrevivência das células de cancro de pulmão H460 (Figura 1), de uma forma dependente da dose. De nota, observou-se aumento da citotoxicidade em concentração superior a 10 nM no nosso ensaio clonogênica. No entanto, demonstrou-se que M867 é um potente e reversível da caspase-3 inibidor (IC
50 de 0,0001 | iM), e uma menos potente inibidor da caspase-7 (IC
50 de 0,036 ^ M) [18]. Além disso, verificou-se que o efeito sensibilizador de M867 é dependente da caspase-3 e -7, como foi demonstrado pela ausência do seu impacto sobre a caspase 3/7 células NSO.