Abstract
O julgamento EURTAC demonstrou que a tirosina-quinase inibidor (TKI) erlotinib foi superior à quimioterapia como terapia de primeira linha para câncer de pulmão de células não pequenas avançado (CPNPC) que porto
EGFR
mutações ativadoras em uma população predominantemente caucasiana. Baseado em EURTAC e vários ensaios asiáticos, anti-
EGFR
TKI são padrão de cuidado para
EGFR
mutação-positiva NSCLC. Buscou-se validar um multiplex rápida
EGFR
ensaio de mutação como um ensaio de diagnóstico companheiro para selecionar pacientes para esta terapia. Amostras do ensaio EURTAC foram prospectivamente selecionados para
EGFR
mutações usando uma combinação de testes desenvolvidos em laboratório (TLDs), e testados retrospectivamente com as cobas
EGFR
ensaio de mutação (
EGFR
teste PCR). O
EGFR
resultados do teste de PCR foram comparados com os resultados LDT originais e seqüenciamento Sanger, usando um subconjunto de amostras de pacientes selecionados para o estudo. tecido residual estava disponível a partir de 487 (47%) dos 1044 pacientes rastreados para o ensaio. O
EGFR
teste de PCR mostrou alta concordância com resultados LDT com um acordo global de 96,3%. A evolução clínica de pacientes que foram
EGFR
-mutation detectado pelo teste
EGFR
PCR foi muito semelhante a toda a coorte EURTAC. A concordância entre o
EGFR
teste de PCR e seqüenciamento Sanger foi de 90,6%. Em 78,9% das amostras discordantes, o
EGFR
resultado do teste de PCR foi confirmada por um ensaio de sequenciação profunda sensível. Este estudo retrospectivo demonstra a utilidade clínica do
EGFR
teste de PCR na seleção exata de pacientes para anti-
EGFR
terapia de TKI. O
EGFR
teste de PCR demonstrou um melhor desempenho em relação ao seqüenciamento Sanger
Citation:. Benlloch S, Botero ML, Beltran-Alamillo J, Mayo C, Gimenez-Capitán A, de Aguirre I, et ai. (2014) Validação clínica de um ensaio de PCR para Detecção de
EGFR
Mutações em Non-Small-Cell Lung Cancer: Retrospectiva Testes de Amostras do EURTAC julgamento. PLoS ONE 9 (2): e89518. doi: 10.1371 /journal.pone.0089518
Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de julho de 2013; Aceito: 21 de janeiro de 2014; Publicação: 25 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Benlloch et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Roche. Os financiadores não contribuiu para o desenho do estudo, coleta de dados, análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito
Competir interesses:. BK, MS, WB, DC, GZ, JFP, LW são todos os atuais funcionários da Roche . BK, DC, JFP e LW tem participações em Roche. BK e HJL são ex-funcionários da Roche e HJL tem ações na Roche e tem servido como consultor pago. FS foi um consultor pago para Roche. SB, JBA, CM, AGC são os atuais funcionários de Pangaea Biotech. MLB é um ex-funcionário Pangaea. MT e SRyC tem participações em Pangaea Biotech. IdA, CQ, JLR são os atuais funcionários de Oncologia Médica Service-ICO, Hospital alemães Trias i Pujol. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
A eficácia de muitas novas terapias direcionadas câncer pode ser prevista pela detecção de biomarcadores específicos no tumor. A FDA indicou que, se é necessária a identificação específica de um biomarcador para a administração segura e eficaz de um fármaco, um ensaio de diagnóstico companheiro aprovados pela FDA bem validado é necessário para que a droga. O caminho de recepção óptima para uma nova terapia-alvo e o seu companheiro de diagnóstico é um processo de desenvolvimento clínico paralelo que envolve a ensaios clínicos para o agente experimental, quando o teste de diagnóstico experimental é usado tanto para pacientes selecionados para os ensaios ou para prever a resposta ao tratamento, e as extremidades de preferência com simultânea aprovação da autoridade de saúde da droga e o companheiro de diagnóstico. exemplos bem sucedidos deste incluem o co-desenvolvimento (e co-aprovação) do vemurafenib inibidor BRAF e seu ensaio de mutação companheiro de diagnóstico BRAF V600E para o melanoma metastático BRAF-mutante [1], ea crizotinib inibidor da ALK e seu gene de fusão ALK diagnóstico companheiro teste avançado em pacientes positivos de ALK-fusão cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). [2], [3], [4]
no entanto, em alguns casos, os biomarcadores preditivos para uma terapia-alvo não são reconhecidos até que após o fármaco é primeiro aprovado. Como exemplo, o anti-
EGFR
cetuximab anticorpo foi aprovado pela primeira vez em os EUA para o tratamento de câncer colorretal metastático em 2004. ensaios retrospectivos e prospectivos Numerosos posteriormente revelou que os tumores abrigando
KRAS
mutações eram muito improvável para responder a cetuximab. Em julho de 2009, o FDA exigiu mudanças de rotulagem para cetuximab e outro anti-
EGFR
panitumumab anticorpo exigir que as indicações e uso de estado não havia nenhum benefício do tratamento com os medicamentos para os pacientes cujos tumores tinham
KRAS
mutações no códon 12 ou 13, numa altura em que não havia aprovado pela FDA ensaios de diagnóstico para
KRAS
mutações. [5] Só mais tarde, em julho de 2012, fez um
ensaio de mutação KRAS
receber a aprovação da FDA, com base nos resultados de um estudo prospectivo e randomizado, com destaque para os desafios da retrospectivamente validar um ensaio de diagnóstico companheiro após os testes de drogas cruciais foram concluídos. [6]
O anti-
EGFR
TKI erlotinib foi inicialmente aprovado para todos os pacientes com NSCLC avançado que tinha progredido na quimioterapia de primeira linha. Uma série de estudos posteriores determinaram que pacientes com
EGFR
-mutant NSCLC teve uma alta probabilidade de responder a estes TKI, levando a ensaios no cenário de primeira linha para
EGFR
câncer -mutant. [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13] Quatro estudos clínicos randomizados estudada em populações asiáticas demonstraram que erlotinib e gefitinib resultaram na melhoria da sobrevida livre de progressão em comparação com quimioterapia para o tratamento de primeira linha em pacientes com NSCLC com
EGFR
mutações. [7], [8], [9], [13] Outros estudos clínicos em coortes Mestiça ter concluído, com resultados semelhantes. [10], [12]
o julgamento EURTAC foi uma fase 3 estudo randomizado para avaliar a segurança e eficácia de erlotinib em comparação com a quimioterapia padrão à base de platina para o tratamento de primeira linha de uma população de pacientes com avançada
EGFR
-mutation detectado NSCLC em uma população em grande parte branca dos doentes europeus. pacientes tratados com erlotinib experimentaram melhorias significativas na PFS mediana (9,7 meses vs. 5,2 meses) em comparação com a quimioterapia. Os doentes no braço erlotinib também tinha uma percentagem consideravelmente mais elevada de respostas (58% vs. 15%) na população com intenção de tratar. [11] Este estudo foi submetido à primeira indicação linha de erlotinib em
EGFR
pacientes com NSCLC mutantes.
A maioria de ativar
EGFR
mutações estão localizadas em exons 19 (45%) e 21 (40-45%). [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] Orientações de organizações como ASCO, CAP /AMP e NCCN recomendam o uso de anti-
EGFR TKI
como primeira linha a terapia em pacientes com
EGFR
-mutant NSCLC avançado com base nos resultados destes ensaios clínicos principais. [21], [22], [23] recomendações recentes do CAP /IASLC /AMP aconselhar a identificação de mutações EGFR presente em 1% dos quais Exon 19 supressões e uma conta exão 21 mutação (L858R) para mais de 90% de todas as mutações. [24] Nenhuma das orientações especificam o método de teste a ser utilizado, no entanto, as cobas
EGFR
teste de mutação é CE-IVD aprovado e está recentemente aprovado pela FDA. [25]
Aqui nós apresentamos a análise retrospectiva de um estudo de validação clínica do
EGFR
teste de PCR em um subconjunto de amostras de cancro de pulmão de pacientes selecionados para o estudo EURTAC. O
EGFR
teste de PCR demonstraram melhora o fluxo de trabalho de exemplo em relação aos LDTs utilizados no estudo EURTAC, permitindo
EGFR
mutação triagem em um único ensaio com um dia o tempo de rotação. O
EGFR
teste de PCR mostrou sensibilidade superior e especificidade em comparação com o seqüenciamento Sanger convencional.
Métodos
Os objetivos do estudo principais foram: 1) para correlacionar os resultados clínicos (PFS, BORR ) a partir do subgrupo de amostras disponíveis testados pela
EGFR
teste de PCR com os resultados a partir de toda a população EURTAC, e 2) para comparar o desempenho analítico do
EGFR
teste de PCR, para que de LDT original e seqüenciamento Sanger, usando pyrosequencing massivamente paralelo (MPP) para resolver as discrepâncias observadas entre os outros 3 métodos de ensaio.
no ensaio EURTAC, 1.044 pacientes de hospitais em França, Itália e Espanha foram rastreados usando LDT. Para este estudo, todas as amostras foram analisadas retrospectivamente em fase de aprovação IRB de Copérnico IRB (00.001.313). Site de aprovação IRB específico de cada local clínico e consentimento por escrito de todos os pacientes foi obtido antes da fase de estudo de condução de NCT00446225. [11], [26] Em 487 casos, as amostras residuais estavam disponíveis para o reteste com o
EGFR
teste de PCR (Figura 1). Uma secção de 5 um único com o conteúdo do tumor, pelo menos, 10% a partir de cada uma das 487 amostras foi usada para o
EGFR
teste de PCR. O ADN genómico a partir de eluato existente ou a sua extracção a partir de secções adicionais foi testado em Sanger de sequenciação e MPP. A Tabela 1 apresenta os dados demográficos dos pacientes selecionados para o estudo EURTAC pela LDT, sub-categorizados por pacientes ou não testadas pelo teste
EGFR
PCR. Os pacientes incluídos no estudo EURTAC foram selecionados através de um teste desenvolvido em laboratório, validado pelo Laboratório de Oncologia (ICO-Hospital alemães Trias i Pujol, Badalona, Espanha), constituído por três metodologias. [26] Neste estudo, um único PCR- ensaio baseado na detecção de
foi usada EGFR
mutações. Os detalhes do desempenho analítico deste ensaio foram previamente descritos [27]
amostras E1:. Bloco de tumor não está disponível para análise. E2 amostras: material tumoral suficiente para análise. LDT = teste desenvolvido em laboratório.
Considerações estatísticas
Mutação detectada (MD) foi definida como a presença de qualquer uma deleção do exão 19 ou mutação L858R. Mutação não detectada (MND) foi definida como a ausência de ambos exão 19 supressões e a mutação L858R. software SAS /STAT ® foi utilizado para análise dos dados.
estatísticas do estudo de desfecho clínico
curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram utilizadas para avaliar o PFS pelo método de tratamento (quimioterapia ou erlotinib) entre os pacientes que foram inscritos no estudo EURTAC e rastreados com o LDT, bem como o subgrupo de pacientes que estavam determinados a ser mutação-positivo pelo teste
EGFR
PCR. Teste não paramétrico de log-rank foi realizada para avaliar PFS entre os pacientes que foram randomizados para quimioterapia ou erlotinib. A taxa de risco (quimioterapia vs. erlotinib) em relação ao PFS também foi calculada. Melhor resposta global foi a melhor resposta gravado a partir do início do tratamento até progressão da doença e BORR (a melhor taxa de resposta global) foi sintetizada com limites de confiança de 95% de acordo com os métodos de Pearson-Clopper com base na avaliação dos investigadores para cada grupo de tratamento.
estatísticas de desempenho analítico
Para obter o desempenho analítico, uma análise acordo foi realizado entre o
EGFR
resultado do teste de PCR eo teste LDT. detecção de mutações do exão 19 deleções e mutações L858R foram analisados em conjunto. Separadamente, o
EGFR
teste de PCR também foi comparado ao seqüenciamento Sanger e MPP por um laboratório certificado pela CLIA. Para as análises do acordo, foram calculados o acordo positivo por cento (PPA), concordância percentual negativa (NPA), e acordo por cento do total (OPA) com seus correspondentes intervalos de confiança de 95% (IC). Além disso, 3-way analisa usando MPP como um segundo método de referência foi realizada para resolver os resultados discrepância.
métodos de teste de Mutação
EGFR PCR Teste.
O
EGFR
teste PCR (cobas
EGFR
ensaio de mutação, Roche Molecular Systems, Inc, Branchburg, NJ, EUA) é um CE-IVD multiplex alelo-específico ensaio baseado em PCR projetado para detectar mutações 41 em exons 18, 19, 20 e 21 em amostras FFPET de NSCLC humana. [28] o DNA é isolado utilizando o DNA cobas Kit Preparação de amostras (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). [29] É necessário um mínimo de 150 ng de ADN genómico para a amplificação por PCR, o qual pode tipicamente ser isolado a partir de uma única secção de FFPET 5 uM. O
EGFR
versão do software de teste de PCR utilizada neste estudo foi desenhado para detectar 29 deleções no exão 19 e 2 variantes L858R no exão 21. Macrodissection só é recomendado se o conteúdo do tumor é inferior a 10%; captura de laser microdissecação não é necessária. O teste
EGFR
PCR foi realizada por bula do fabricante e os resultados foram automaticamente analisados e relatados. O limite de detecção foi validado para 5% alelos mutantes. O fluxo de trabalho de isolamento de ADN aos resultados de relatórios podem ser realizadas no período de um de 8 horas. [27]
LDT.
Os doentes no estudo EURTAC foram rastreados usando uma combinação de métodos desenvolvidos pelo Laboratório de Oncology, ICO-Hospital alemães Trias i Pujol, em Barcelona, na Espanha. [11] em suma, EGFR mutações ativadoras em exons 19 e 21 foram inicialmente identificados pelo sequenciamento Sanger e confirmados por análise de comprimento de fragmentos de exão 19 deleções (iniciador marcado-FAM em um prisma 3130 analisador de ADN ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e pelo ensaio TaqMan para o exão 21 (L858R) mutação. Todas as amostras de tumor foram da biópsia inicial feita antes de qualquer tratamento e antes da distribuição aleatória. Realizaram-se ≥ 2 milímetros
2 de tecido obtido a partir de um a três lâminas de secções de tecido de 4 micron que foram submetidas a microdissecação de captura laser para enriquecer para a presença de células tumorais. o DNA foi extraído usando um protocolo padrão de laboratório e testadas em um único sítio na Espanha, em Laboratório de Oncologia para
EGFR
mutações ativadoras no exão 19 e 21 usando um método descrito anteriormente. O tempo médio de resposta foi de aproximadamente 5 dias. [26]
Bi-direcional sequenciamento Sanger.
Todas as amostras testadas pela
EGFR
teste de PCR foram também testados por seqüenciamento Sanger usando DNA a partir de amostras FFPET preparados pelo Kit Preparação de amostras de DNA cobas e sequenciados com 2 × bidirecional sequenciamento Sanger por um laboratório certificado pela CLIA (SeqWright, Houston, TX, EUA), utilizando um protocolo validado. Repetir Sanger de sequenciação foi realizada para comparar a detecção de
EGFR
mutações a partir de secções de tecido adjacentes, para minimizar qualquer impacto da heterogeneidade tecido usado para a
EGFR
PCR de teste em relação aos resultados LDT originais. Além disso, os protocolos de sequenciação pelo laboratório variar em termos do teor percentual de tumor /amostra que requer macrodissection. DNA isolado com o Kit de Preparação de Amostras de DNA cobas e utilizado para a sequenciação necessário conteúdo tumor ≥10%. Tempo médio de resposta para os resultados foi de 7 dias. O limite estimado de detecção é de aproximadamente 20% alelos mutantes. [30]
pyrosequencing massivamente paralelo (MPP).
As amostras com
EGFR resultados válidos teste
de PCR com DNA adequada remanescente da extração inicial foram testadas por um método MPP (454 GS Titanium, 454 Life Sciences, Branford, CT, EUA) por um laboratório certificado pela CLIA (SeqWright, Houston, TX, EUA), utilizando um protocolo validado. [31] Este método é um processo 5-7 dia que envolve a geração de amplicon, pooling, ligadura, emulsão PCR, amplificação e pyrosequencing massivamente paralelo com a análise de dados manual. O limite estimado de detecção para o ensaio é de 1,25% alelos mutantes. [27] O método MPP foi usado para demonstrar o desempenho do teste de PCR para EGFR um método mais sensível e como um mediador dos casos discrepantes observadas entre o LDT ou a repetição de Sanger de sequenciação. A fim de preservar a privacidade do paciente associado com amostras clínicas testadas, os resultados de sequenciamento MPP em bruto foram anônimas e apresentados na Tabela S1.
Resultados
demografia Specimen
487 (47%) de 1.044 espécimes selecionados para o julgamento de EURTAC usando LDTs estavam disponíveis para teste usando o teste
EGFR
PCR. O fluxo de amostras através do estudo é mostrado na Figura 1. Os parâmetros demográficos e características do tumor de base para todos os pacientes por status LDT são apresentados na Tabela 1. Não houve diferenças significativas entre os grupos de pacientes testados e os pacientes não testados pelo
teste EGFR
PCR (p 0,05) para cada status LDT (mutação detectada, a mutação não detectado), com excepção do país de consultório de triagem
os resultados clínicos para pacientes com base nos resultados dos testes EGFR PCR.
dos 174 pacientes incluídos no estudo EURTAC, as amostras de 134 (77%) pacientes estavam disponíveis para teste usando o teste
EGFR
PCR. Excluindo 11 pacientes com
EGFR
resultados dos testes de PCR e 7 pacientes inválidos com um resultado de
EGFR
mutação não detectado, um total de 116 (67%) pacientes foram mutação detectada pelo
EGFR
teste de PCR e avaliáveis para análise de desfecho clínico (57 pacientes no braço quimioterapia e 59 no braço erlotinib). Os resultados clínicos (PFS, Borr, e OS) são apresentados na Tabela 2. Entre
EGFR positivos
teste PCR, aqueles tratados com erlotinib tiveram um PFS significativamente prolongada quando comparado com pacientes tratados com quimioterapia (p 0,0001, teste log-rank); a PFS mediana foi de 10,4 meses (IC 95%: 8,0 a 13,8 meses) e 5,4 meses (IC 95%: 4,4 a 6,8 meses) para os pacientes tratados com erlotinib ou quimioterapia, respectivamente (Figura 2). O HR com base no modelo de riscos proporcionais de Cox foi reduzido em 66% (HR 0,34; [IC 95%: 0,21-0,54]) para pacientes no braço erlotinib contra quimioterapia. Um ano após a randomização, uma percentagem mais elevada de pacientes no erlotinib em comparação com o braço de quimioterapia, foram livre de eventos (45% [95% CI: CI de 32% para 59% versus 6% [95%: 0% a 15%], respectivamente)
BORR foram maiores nos pacientes no braço do erlotinib (59,3% [IC 95%: 45,7% a 71,9%].) em comparação com o braço de quimioterapia (14,0% [95% Cl: 6,3% a 25,8%]). Os doentes no braço erlotinib eram muito mais propensos a responder ao tratamento do que os pacientes no braço de quimioterapia (odds ratio de 8,93, [IC 95%: 3,59 a 22,19])
Não houve diferença significativa na OS entre os dois. os braços de tratamento (25,8 meses no braço erlotinib (IC 95%: 16,1-30,0) e 20,8 meses no braço de quimioterapia (IC 95%: 17,3-29,4) (teste de p-valor-rank log = 0,5381))
resultados da PFS, Borr e mínimos para
EGFR
doentes positivos de testes PCR não diferiu significativamente dos obtidos em todos os pacientes inscritos no estudo EURTAC que sugere que o
EGFR
teste PCR pacientes positivos são representativos de todos EURTAC matriculados pacientes.
Para os 7 casos em que o
EGFR
PCR resultado do teste foi mutação não detectado e discrepantes com a LDT, dois casos resolvidos em favor da LDT pelo MPP, três casos resolvidos em favor do
EGFR
teste de PCR e uma amostra não era válido tanto para Sanger e MPP eo outro estava de acordo entre o
EGFR
teste de PCR e Sanger, mas não MPP (Tabela S2). Curiosamente, 6 dos 7 pacientes foram tratados com erlotinib e apenas um paciente alcançou maior ou igual a PFS mediana baseado no LDT ou o teste de
EGFR
PCR.
Comparação de teste EGFR PCR e os resultados LDT
Entre 432 espécimes com resultados válidos, tanto do
EGFR
teste de PCR e LDT, o PPA, a NPA e OPA foram de 94,2% (146/155, CI: 89,3%, 96,9 %), 97,5% (270/277, CI: 94,9%, 98,8%), e 96,3% (416/432, CI: 94,1%, 97,7%), respectivamente (Tabela 3). Assim, houve uma alta concordância entre o LDT original e
EGFR resultados do teste
PCR. Entre dezasseis amostras com resultados discordantes, o
EGFR
resultado do teste de PCR foi confirmada por MPP em 68,8% (11/16) dos casos (Tabela S3).
Comparação do EGFR PCR resultados do teste com Sanger Sequencing
de 487 espécimes testados usando o
EGFR
teste de PCR e seqüenciamento Sanger, 406 deram resultados válidos por ambos os métodos (38 eram inválidos por ambos os métodos, cinco eram inválidos por
EGFR
teste de PCR e 38 eram inválidos por seqüenciamento Sanger). O PPA, NPA e OPA para
EGFR
teste de PCR em comparação com o seqüenciamento Sanger eram 96,6% (112/116, CI: 91,7%, 98,7%), 88,3% (256/290, CI: 84,1%, 91,5 %), e 90,6% (368/406, CI: 87,4%, 93,1%; Tabela 4), respectivamente. Entre 38 resultados discordantes entre os casos
EGFR
teste de PCR e seqüenciamento Sanger, MPP acordado com o
EGFR
resultado do teste de PCR em 30 (78,9%) (Tabela S4). Seqüenciamento Sanger detectou um L858R não detectado pelo MPP e não conseguiu detectar 22 exão 19 supressões e 7 mutações L858R confirmados pelo MPP. Quatro resultados MPP eram inválidos, e os quatro restantes resultados acordados com Sanger. A gama de por cento alelos mutantes dos casos não atendidas por Sanger foi de 3% a 60%, com vários espécimes (n = 16) abaixo do limite estimado de detecção para Sanger.
Discussão
Este estudo apoia a viabilidade de realizar uma validação clínica retrospectiva de um companheiro de diagnóstico, ensaios clínicos terapêuticos potenciais. O
EGFR
resultados do teste de PCR foram altamente concordantes ( 96%) com os resultados LDT usados para selecionar pacientes para o julgamento de EURTAC. Como consequência, PFS e BORR do subgrupo de doentes com
EGFR
mutações detectadas com o
EGFR
teste de PCR foram comparáveis com o grupo cheio de doentes inscritos no estudo EURTAC, validando o uso do teste
EGFR
PCR para selecionar pacientes para tratamento com anti-
EGFR TKI
tais como erlotinib. sobrevivência PFS mediana foi de 9,7 contra 10,4 meses para o grupo erlotinib e 5,2 contra 5,4 meses para os LDTs e
EGFR
PCR teste, respectivamente. O BORR foi de 58% versus 59,3% meses para o grupo erlotinib e 15% versus 14,0% para os LDTs e
teste EGFR
PCR, respectivamente. Entre as 16 amostras discordantes entre o
EGFR
de teste e LDTs PCR, um terceiro método de teste de mutação acordado com o
EGFR
resultado do teste de PCR em 11 casos. Dos sete casos que foram mutação detectada pelo
test EGFR
PCR e mutação não detectado pelo LDT, 5 foram confirmados por MPP. Estes pacientes poderiam potencialmente beneficiado de anti-
EGFR
terapia de TKI. O
EGFR
teste de PCR teve um número de vantagens técnicas sobre o LDT utilizada no ensaio de EURTAC. O laser de captura microdissection LDT necessária de várias secções de tecido e envolveu 3 ensaios separados com um tempo de resposta média de 4,5 dias. Por comparação, o
EGFR
teste de PCR macrodissection necessário apenas se o conteúdo do tumor era 10% e pode ser realizada em um dia, utilizando uma única secção de 5 um. Além disso, o
EGFR
teste PCR é um ensaio à base de kit disponível comercialmente que proporciona um resultado automatizado, em vez de um processo de sujeito manual para interpretação e que pode ser realizada por qualquer laboratório clínico qualificado.
Mais de 80% das amostras testadas neste estudo eram pequenas amostras de biópsia. A taxa inválida geral para seqüenciamento Sanger foi de 15,6% (76/487) em relação ao
EGFR
ensaio de PCR em 9% (43/487). No entanto, a taxa inválida para o subconjunto de amostras derivadas a partir de amostras de ressecção foi de 0% (0/109) provavelmente devido à disponibilidade de tecido suficiente. Assim, o ensaio é extremamente robusta quando realizada em espécimes de tumor ressecado e tem uma taxa de sucesso de, aproximadamente, 90% em espécimes de biópsia, os quais são muitas vezes a única amostra de tumor disponível para testes em NSCLC.
Sanger de sequenciação tem sido amplamente utilizada para detectar
EGFR
mutações. [30], [32] Semelhante às taxas inválidos geral, para o 134
EGFR
mutação detectada amostras LDT matriculados no julgamento de EURTAC, seqüenciamento Sanger tinha um inválido maior taxa (15,7%) em comparação com 8,2% para o teste
EGFR
PCR. Havia também 30 mutação não resultados detectados para seqüenciamento Sanger (22,4%) e 7 mutação resultados para não detectou o
EGFR
teste de PCR (5,2%). Com 21 resultados inválidos e 30 de mutação resultados não detectados, seqüenciamento Sanger teria erroneamente classificada 38% dos pacientes incluídos no estudo EURTAC. Similares taxas inválidos têm sido relatados em três outros estudos, o que sugere que esta metodologia apresenta limitações quando aplicado a DNA de amostras FFPET. [33], [34], [35] Além disso, de Sanger de sequenciação mostrou pouca sensibilidade em amostras contendo menos de 20-25% alelos mutantes. [35], [36], [37] Quando comparamos o acordo entre resultados válidos para o
EGFR
teste de PCR com seqüenciamento Sanger (n = 406), havia 38 discordantes casos, dos quais 30 foram confirmadas por MPP. Vinte e nove dos 30 casos resultaram em mutação detectada estatuto pela
EGFR
teste de PCR e faria esses pacientes elegíveis para anti-
EGFR
terapia. Pobre sensibilidade do seqüenciamento Sanger explica assim a relativamente baixa NPA em comparação com
EGFR
teste de PCR observada neste estudo.
Dada a criticidade da
EGFR
testes de mutação na seleção de terapias específicas para o câncer com risco de vida, como avançado NSCLC, ensaios robustos e precisos com curtos prazos de entrega são os preferidos. estudos de garantia de qualidade recentes para averiguar o estado de mutação de um painel padrão de tumores têm demonstrado que os laboratórios clínicos diferentes não identificar corretamente o estado de mutação de 100% dos membros do painel, mesmo quando eles estão usando os mesmos ou similares metodologias de teste. [38 ], [39] para os ensaios que envolvem a análise de mutações de amostras de tumores, fatores importantes que contribuem para o desempenho do ensaio incluem a normalização analítica, validação de reagentes e metodologia, experiência de laboratório, ea participação adequada do patologista.
Concluindo, os resultados do presente estudo indicam que as cobas
EGFR
ensaio de mutação é um ensaio de diagnóstico companheiro altamente robusta e de alta precisão para selecionar pacientes para tratamento com anti-
EGFR
terapias, como erlotinib.
Informações de Apoio
Tabela S1.
Listagem do resultado MPP
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s001
(PDF)
Tabela S2.
Resultado de amostras discrepantes entre o cobas teste EGFR PCR e LDT que foram incluídos no ensaio clínico (cobas MND /LDT MD): doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s002
(PDF)
Tabela S3.
resultados concordância entre os testes EGFR PCR e LDT discordantes
DOI: 10.1371. /journal.pone.0089518.s003
(PDF)
Tabela S4.
MPP resulta da análise de resolução de amostras discordantes entre o teste EGFR PCR e seqüenciamento Sanger
doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s004
(PDF)
Reconhecimentos
Nós gostaríamos de agradecer Patrick O’Donnell e Karen Yu por suas contribuições para este estudo.