Abstract

Redução da sensibilidade do câncer de próstata (PC) células para terapia de radiação representa um desafio significativo na clínica. A activação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), um tipo de receptor do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF1R), e interferência entre estas duas vias de sinalização foram implicados no desenvolvimento da resistência à radiação no PC. Este estudo avaliou os efeitos da segmentação ambos os receptores na regulação da radio-sensibilidade em células PC. Os inibidores específicos de EGFR e do IGF1R, erlotinib e AG1024, bem como siARN segmentação do EGFR e do IGF1R, foram usadas para células PC rádio-sensibilização. Os nossos resultados mostraram que a co-inibir a ambos os receptores de forma significativa humedecido crescimento celular e reparação de danos do ADN, e aumento da rádio-sensibilidade em células PC. Estes efeitos foram realizados através da inibição sinérgica de homólogo de reparação do ADN dirigida por recombinação (FCR), mas não por meio de inibição da extremidade não-homóloga de união (NHEJ). Além disso, a capacidade comprometida HRR foi causado pela redução da fosforilação do substrato do receptor da insulina 1 (IRS1) e a sua subsequente interacção com Rad51. O efeito sinérgico dos inibidores de EGFR e IGF1R também foi confirmada no ensaio de xenoenxerto de ratinho nu. Este é o primeiro teste estudo co-inibir EGFR e IGF1R sinalização no contexto de radio-sensibilidade no PC e pode proporcionar uma abordagem terapêutica adjuvante promissor para melhorar o resultado de pacientes de PC para o tratamento de radiação

Citation.: Wang Y, Yuan JL, Zhang YT, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et ai. (2013) inibição de ambas as EGFR e Células IGF1R sensibilizados do cancro da próstata com radiação pela supressão sinérgica de DNA homóloga recombinação Repair. PLoS ONE 8 (8): e68784. doi: 10.1371 /journal.pone.0068784

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Dezembro, 2012; Aceito: 02 de junho de 2013; Publicação: 12 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Financiado pela concessões do National Natural Science Foundation da China (No. 30.100.185, No. 81.250.036, No. 30.973.000, No. 30.872.583, No. 81.072.116) e da Fundação de Ciência Natural de Shaan’xi Província (2009JQ4003). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PC) é o tumor maligno mais comum ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre os pacientes do sexo masculino [1]. Durante a progressão da doença, o crescimento inicial de células PC é dependente de androgénio, e estas células sofrem apoptose após a depleção de androgénio. Como consequência, a ablação do andrógeno foi considerado o tratamento padrão para PC mais de 50 anos [2]. Muitos pacientes eventualmente desenvolvido uma doença refractário a hormonas, devido ao crescimento de células cancerosas de androgénio-refractária, que leva à falha da terapia de ablação de androgénio e deixa os pacientes com poucas opções terapêuticas [3], [4]. A combinação de terapias locais definitivos, tais como prostatectomia radical, juntamente com radioterapia adjuvante, foi demonstrada para melhorar a sobrevivência de pacientes de PC [5], [6]. No entanto, essa terapia é desafiado pelo surgimento de resistência nas células tumorais. É, portanto, de grande importância no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para superar radiorresistência e melhorar rádio-sensibilidade por segmentação mecanismos moleculares em células PC independente de androgénios.

receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o crescimento do tipo insulina receptor do fator (IGF1R), dois receptores mais importantes da tirosina quinase, desempenham papéis críticos no desenvolvimento e progressão do cancro através da regulação da proliferação celular, apoptose, crescimento independente de ancoragem, invasão, angiogénese, a imunidade câncer e resistência à quimioterapia e /ou radioterapia [7]. Estes dois receptores são frequentemente sobre-expressa numa variedade de cancros humanos incluindo PC [8], [9], [10], e, por conseguinte, pode ser utilizado como candidatos para a terapia do cancro alvo. Na verdade, os inibidores de EGFR e outro membro da família EGFR Her2, incluindo Erlotinib, Lapatinib, Cetuximab e Gefitinib, são as opções mais bem sucedidas no tratamento clínico atual de diferentes cânceres humanos, como esperado no entanto, o desenvolvimento de

de novo

tem sido observada resistência em clínica após a utilização a longo prazo destes medicamentos, o que sugere a existência de mecanismos de desvio no interior das células tumorais [11]. Estudos mecanísticos sobre os eventos celulares e moleculares revelaram que grande diafonia entre o EGFR e sinalização do IGF1R ocorre a múltiplos níveis, e que o bloqueio da sinalização de EGFR leva a respostas melhoradas ao ligando do IGF1R, o IGF [12], [13]. Estes dados implicam que a segmentação de ambos os receptores ao mesmo tempo, pode proporcionar uma melhor eficácia no tratamento do cancro e superar a resistência do tumor ao indivíduo um inibidor, enquanto que a melhoria da sensibilidade dos inibidores individuais para a terapia do cancro. Consistentemente, estudos têm demonstrado que a dupla segmentação de ambos os receptores bloqueia a sua hiperfosforila�o recíproco, inibe a proliferação e induz a apoptose em várias células cancerígenas, incluindo PC e cancro colorrectal [14], [15].

Neste estudo, nós avaliaram os efeitos da segmentação tanto EGFR e sinalização IGF1R nas respostas de células de PC para irradiação y. Os nossos dados demonstram a potência de alvejar ambas as vias na modulação dos comportamentos de células PC após a radioterapia e revelou os mecanismos subjacentes. Este é um estudo seminal que justifica ainda mais o uso combinatória de inibidores de EGFR e vias IGF1R no tratamento da PC.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamento

A células PC independente de androgénio humano DU145, PC3, Arcap

e e Arcap

M e linha de células do epitélio da próstata humana normal PrEC foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). O R503 foi a partir do Centro Experimental animal da Quarta Universidade Médica Militar. As células foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO, como o controlo de veículo), 10 uM erlotinib (inhbibitor EGFR, Eton Bioscience, San Diego, CA) e /ou 10 fiM AG1024 (inibidor do IGF1R, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) (como os grupos experimentais) durante 1 h. As células foram irradiadas, tal como descrito por Liu et al [16]. Em alguns experimentos, as células também foram transfectadas com silenciadores não-controle de siRNAs (NSC) (50 nm, Invitrogen, Xangai, China) de acordo com o protocolo do fabricante.

Para estabelecer sublinhas, células PC irradiação tolerante IRS1 ou foram irradiadas a 2 Gy por dia, 5 dias por semana em um FCC-8000C

60Co irradiador. Depois de seis meses, as sublinhas de DU145 que sobreviveram irradiação ionizada foram estabelecidos e chamado DU145-IIRR. Estes sub-linhas foram então sujeitos a tratamento com fármacos e de novas experiências.

clonogénicas ensaio

A formação de colónias sinérgica a seguir ao tratamento combinado com os inibidores de EGFR e IGF1 e irradiação foi investigada por ensaios clonogénicos em monocamada. As células foram overnight privadas de soro. Cinco mil células foram inoculadas em 10 cm de diâmetro pratos de cultura de tecidos com meio de 10 mL. As células foram tratadas com AG1024 ou erlotinib durante 1 hora e irradiada a dosagem indicada, depois de terem aderido aos pratos. A formação de colónias foi determinado com coloração de violeta de cristal, usando um contador de partículas Coulter no dia 10 após a sementeira de células. fracção sobrevivente foi definida como a eficiência de clonagem de células tratadas por esse divididas das células de controlo. As experiências foram repetidas três vezes.

A citometria de fluxo de ensaio

Para analisar a apoptose celular, as células (1 x 10

4 /poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços. Após 24 h, as células foram privadas de soro durante 24 h, e, em seguida, tratados quer com AG1024 ou erlotinib durante 1 h. As células foram então irradiadas com a dosagem de 2 Gy. Às 4 h após a irradiação, as células foram recolhidas por tripsinização, fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante 2 h e lavou-se em 5 mL de PBS. As células foram então coradas com 1 mL de iodeto de propídio (PI) solução (0,2 mg de ARNase A, 0,02 mg de PI, e 1 mL de Triton X-100). O conteúdo em ADN em diferentes fases do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo FACS (BD Biosciences, San Jose, CA). Para detectar a taxa de apoptose em células tratadas, as células foram coradas com Anexina V e PI, e, em seguida, submetido a citometria de fluxo como descrito [16]. As células de Anexina V-positivos e PI-negativas submetidos a apoptose precoce foram contadas como células apoptóticas. Todas as experiências foram realizadas em duplicado e os dados apresentados são representativos de três experiências independentes.

Extracção de proteínas e Western blotting

Diferentes grupos de células foram lisadas com SDS a 1% de tampão de lise (Beyotime Inc., Pequim, China). Para a extracção de proteínas nucleares, as células foram lavadas com tampão de lise hipotónica (Teknova, Pequim, China), e dounced na douncer célula (Wheaton Ltd, Millville, NJ). Os componentes nucleares foram então separadas a partir de extractos citossólicos por centrifugação, seguida por lise em tampão RIPA (Pierce Inc., Pequim, China).

imunoprecipitação e análise Western blot foram realizados tal como descrito por Liu et al [17 ]. Os anticorpos seguintes foram de Cell Signaling: anti-γH2AX, anti-IRS1, anti-fosfo IRS1 (pY612), anti-IGF1R, anti-fosfo IGF1R, anti-EGFR, EGFR anti-fosfo (Y1068), anti-β-tubulina , anti-ERK, anti-fosfo-ERK, anti-AKT, anti-fosfo AKT (S473), anti-ADN-PK, anti-Ku70, anti-Ku80, e anti-XRCC4. O anticorpo anti-Lamin foi de Abnova (Xangai, China). O anticorpo anti-HP-1α foi de Millipore (Xangai, China). β-tubulina, Lamin e HP-1α foram utilizados como controle de carga.

Imunofluorescência

A formação focos γH2AX e Rad51 foi investigada de acordo com Barber et al [18]. Para a coloração de imunofluorescência para γH2AX e Rad51, as células foram fixadas em paraformaldeído a 1% durante 10 minutos à temperatura ambiente seguido por 70% de etanol durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo 0,1% de Triton durante 10 min, as células foram permeabilizadas com 0,5% de Triton em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. Após três lavagens em PBS, as células foram bloqueadas com albumina 5% de soro de bovino (BSA) em PBS durante 60 min. Em seguida, anti-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) ou anticorpo anti-Rad51 (investigação Oncogene, 1:300) foi adicionado em 5% de BSA em PBS e incubado com as células a 4 ° C durante a noite com agitação suave. Após quatro lavagens em PBS, as células foram incubadas no escuro com um anticorpo secundário marcado com FITC em 5% de BSA a uma diluição de 1:2000 para γH2AX 1:200 e para a detecção de anti-Rad51 durante 1 h à temperatura ambiente. Após mais quatro lavagens em PBS, os núcleos foram coradas no escuro com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 ug /ml, Invitrogen) em PBS durante 5 min, e lamelas foram montadas com Fluoromount G ( Southern Biotech., Birmingham, AL). As lâminas foram examinadas em um microscópio de fluorescência Leica, com imagens captadas por uma câmera CCD e importados para o software de análise avançada de imagem SPOT (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Para cada condição de tratamento, os sinais γH2AX ou RAD51 foram determinados em pelo menos 50 células. Todas as observações foram validados a partir de pelo menos três experiências independentes.

Os ensaios para o reparo do DNA dirigida-HR (FCR) e no final não homóloga juntar (NHEJ)

O quantitativa

in vitro

recombinação homóloga (RH) ensaio foi realizado usando o sistema de recombinação repórter pDR-GFP [19]. Resumidamente, o plasmídeo pDR-GFP expressando GFP dois genes não funcionais foi estavelmente transfectado para células DU145. Um segundo plasmídeo que codifica para a enzima de restrição que Sce-I e um terceiro plasmídeo que expressa a proteína fluorescente vermelha (RFP) com um sinal de localização mitocondrial para indicar a eficiência de transfecção foram transientemente transfectados para células DU145 contendo o plasmídeo pDR-GFP. Quando I-SCEI foi expressa, produziu DNA quebras de cadeia dupla (LAP) dentro do fragmento SceGFP e estimulou HRR para restaurar gene GFP intacta. reparação de ADN por FCR foi avaliada através da contagem de células com ambos sinal GFP nuclear e mitocondrial sinal RFP vs todas as células transf ectadas de forma positiva, isto é, a relação de células com ambos os sinais vermelho e verde para aqueles com apenas sinais vermelhos.

o ensaio NHEJ livre de células foi realizada como descrito anteriormente [20] com extractos nucleares a partir de 1 × 10

7 DU145 células.

In vivo

radioterapia tumor

as experiências com animais foram aprovados pelo Comitê étnico da Quarta Universidade médica Militar (Xi’an, China). 5 × 10

6 DU145 células foram pré-misturados com Matrigel (BD Biosciences) para injecção subcutânea no flanco de ratinhos nus do sexo feminino de 10 semanas de idade. Vinte e dois dias depois (dia 0), os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos, 5 ratinhos por grupo, com base nos tratamentos que receberiam: isto é, o grupo controle recebeu nenhum tratamento; grupo IR recebeu γ-irradiação de diferentes dosagens nos dias 3, 6, 8 e 10, respectivamente; grupo IV + erlotinib recebeu irradiação γ como o grupo de irradiação, mais 100 mg /kg /d de erlotinib via oral durante 10 dias; grupo IV + AG1024 recebeu irradiação γ, plus100 mg /kg /d de AG1024 via oral durante 10 dias; IR + AG1024 e erlotinib recebeu irradiação γ, mais 100 mg /kg /d duas drogas, durante 10 dias. O volume do tumor (V) foi monitorizado de três em três dias durante sete semanas, medindo o comprimento (L) e a largura (W), e calculada como V = 0,5 × L × W

2. O resultado foi expresso como índice de proliferação (PI, PI = tratamento controle V /V).

A análise estatística

O efeito do Erlotinib e AG1024 na inibição da proliferação celular, o crescimento de xenotransplante, sobrevivência clonogênica e ativação de caspase foi analisada estatisticamente usando

t

teste de um não pareado de Student de duas caudas. Todos os dados quantitativos foram apresentados como média ± SD de pelo menos três experiências independentes para

in vitro

experimentos ou de todos os animais dentro do grupo para

In vivo

experimentos. valor P de ≤0.05 foi considerado estatisticamente significativo. * E ** foi marcado para P 0,05 e P . 0,01, respectivamente, em comparação com as células de controlo em todas as figuras

Resultados

A redução da viabilidade das células do tumor e a indução de apoptose pela segmentação de EGFR e /ou IGF1R antes do tratamento de irradiação

neste estudo, nós primeiro avaliaram a sensibilidade induzida das células cancerosas diferentes à radiação

in vitro

. Nós cresceu e tratou-se linhas de células de cancro diferentes com erlotinib (10? M) e /ou AG1024 (10 uM) durante 1 h e, em seguida, irradiada-los com 2 Gy. Os nossos dados mostraram que a viabilidade das células de tumor foi significativamente reduzido e a apoptose de células de tumor aumentado por irradiação com a inibição de ambos o EGFR e do IGF1R, em comparação com o tratamento por irradiação por si só ou mais de irradiação de bloqueio de qualquer um dos receptores (Figura 1A, B). Especificamente, quando em comparação com as células de controlo tratados com veículo, quer AG1024 ou erlotinib reduzida significativamente a viabilidade do tumor celular em linhas celulares PC epiteliais (P 0,05), no entanto, o efeito inibidor do crescimento mais robusto por irradiação foi alcançado com a aplicação simultânea de ambos os inibidores (P 0,05, em comparação com AG1024 ou erlotinib tratamento em DU145, PC3 e Arcap

células e) (Figura 1A). Em contraste, AG1024 e /ou erlotinib pode não rádio-sensibilizar normais linha celular do epitélio da próstata PrEC (Figura 1A). Os nossos dados também mostraram que, em ambas as células DU145 e PC3, AG1024 reduziu significativamente a fosforilação de IGF1R, enquanto erlotinib inibiu drasticamente a fosforilação do EGFR, e não mostrando cruzada actividade no outro receptor, indicando que ambos os inibidores de funcionar de forma potente e, especificamente, (figura S1).

A, ensaio de Radio-sensibilidade das células tratadas com inibidores de EGFR e IGF1R. As células cancerosas de diferentes grupos foram tratadas sem (controlo) ou com AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) ou ambos durante 1 h e, em seguida, submetido a ensaio clonogénico rádio-sensibilidade. Após 10 dias, os clones foram fixadas e coradas. fracção sobrevivente foi calculado de acordo com as contagens de colónias e eficiência de plaqueamento. B, ensaio de rádio-sensibilidade de células tratadas com o EGFR e do IGF1R ARNsi. As células de diferentes grupos foram transfectadas com o controlo não-silenciamento siRNA (NSC-siRNA), EGFR e /ou ARNsi de IGF1R, e, em seguida, submetido a ensaio clonogénico rádio-sensibilidade tal como descrito no painel A. C, a apoptose de células tratadas com o EGFR e do IGF1R inibidores. linhas celulares de cancro da próstata foram pré-tratados com AG1024 ou erlotinib em concentrações indicadas, durante 1 h, e em seguida irradiada durante 2 Gy. Depois de 4 horas, que foram coradas com Anexina V e iodeto de propídio por citometria de fluxo para determinar a percentagem de células apoptóticas. D, a apoptose de linhas celulares de cancro da próstata transfectadas com o EGFR e /ou ARNsi IGF1R. As células de diferentes grupos foram transientemente transfectadas com ARNsi NSC, IGF1R siRNA ou EGFR ARNsi durante 24 h, e, em seguida, irradiada durante 2 Gy. A apoptose foi analisado como no painel C. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, em comparação com as células de controlo

Além células epiteliais de PC, que também avaliou os efeitos de ambos o EGFR e segmentação do IGF1R sinalização em resposta a radio-sensibilização. de células PC-mesenquimais semelhantes. Para este fim, utilizou-se Arcap

M, o homólogo de mesenquimal Arcap

E desenvolvido por Graham et al [21]. Ambas as linhas de células exibem expressão mínima do receptor de androgénio [22]. Consistente com os achados anteriores por Buck et al [14], o tratamento combinado com inibidores do EGFR e IGF1R não poderia sinergicamente inibem o crescimento de células mesenquimais em resposta à irradiação, como fez para o crescimento epitelial (Figura 1A).

Para evitar os efeitos não-específicos associados com pequenos inibidores moleculares, também repetida a experiência na Figura 1A utilizando siRNA específico para EGFR e do IGF1R (Figura 1B). Como mostrado na Figura S2, tanto siARN funcionou eficientemente em derrubar IGF1R e EGFR, respectivamente. Com knockdown único ou duplo de EGFR e /ou do IGF1R por ARNsi, obtivemos resultados semelhantes como na Figura 1A (Figura 1B).

Em seguida, foram caracterizados os potenciais efeitos apoptóticos destes dois inibidores utilizando citometria de fluxo de ensaio. Como mostrado na Figura 1C, DU145, PC3 e Arcap

E apresentaram células reforçada rádio-sensibilidade após doses crescentes de AG1024 e /ou erlotinib, enquanto Arcap

M foi apenas sensível a AG1024, mas não ao erlotinib. tratamento combinado com Erlotinib e AG1024 sinergicamente radio-sensibilizar DU145, PC3 e Arcap

células E, mas não

células Arcap M. Ao comparar células DU145 de células PC3, verificou-se que os primeiros são mais sensíveis ao erlotinib que a última, uma vez que 10 uM erlotinib induziu uma resposta apoptótica robusto ao longo de 1 uM erlotinib em células DU145, embora não muito aumento da apoptose foi observada em PC3 células por as mesmas dosagens de erlotinib. Resultados semelhantes também foram obtidos com siRNA visando EGFR e /ou IGF1R (Figura 1D).

Valorização do radio-sensibilidade por inibidores de EGFR e IGF1R por imparidade de DNA DSB reparar

Para entender o molecular mecanismos subjacentes reforçada rádio-sensibilidade de células de cancro em resposta a AG1024 e /ou erlotinib, determinou-se a capacidade de ADN ruptura de fita dupla (DSB) em células DU145 e PC3, visto que a DSB exerce o efeito mais letal em células induzidas por γ -irradiação. Ao monitorizar o nível de histona fosforilação H2AX proteína no resíduo C-terminal de serina-139, também conhecida como γH2AX, um marcador ORL bem conhecido e sensíveis, que demonstrou que houve uma fosforilação rápida e robusta de H2AX a 1 h após a irradiação em ambos DU145 controlo tratados com veículo e células PC3 (Figura 2A), que rapidamente diminuiu a 4 h, e retornaram ao nível basal às 24 h, o que implica a realização de reparação de DSB. Em contraste, as células tumorais pré-tratadas com AG1024, erlotinib, ou ambos mostraram um pico fosforilação H2AX retardada em quatro horas, e fosforilação H2AX contínuo até 24 horas após a irradiação, o que sugere insuficiência de reparação de DSB após AG1024 e erlotinib (Figura 2A, B ). Além disso, houve uma diferença significativa entre o grupo AG1024 + Erlotinib e grupo AG1024 ou Erlotinib (5 e 10 Gy, P 0,01), indicando um efeito aditivo de co-inhibtion no processo de reparo DSB (Figura 2B)

A, DSB marcador γH2AX curso de tempo de expressão após a irradiação: As células foram privadas de soro durante a noite, em seguida, tratados com 10 mM AG1024 e /ou 10? M erlotinib. Western-blot de células irradiadas, na dose de 2 Gy, e colhidas nos pontos de tempo indicados. proteína HP-1α foi utilizado como um controlo de carga. Os dados foram então quantificados por um software Image J. e expressa como percentagem do controlo. B, a detecção de imunofluorescência de γH2AX focos formação após a irradiação. As células foram tratadas com ou sem AG1024 e /ou erlotinib, durante 1 h, e irradiada a diferentes dosagens. As células foram fixadas após 24 h. As inserções mostram imagens representativas com sinal γH2AX verde e azul coloração nuclear DAPI. C, teste de reparação DSB para HRR. células DU145 privadas de soro, na ausência ou presença de AG1024 (10 uM) ou erlotinib (10 uM) foram transientemente transfectadas com dois vectores, um expressando I-Scel ADNc para gerar LAP de ADNc de GFP, e outra proteína fluorescente vermelha que expressa com um mitocondrial sinal de localização para indicar a eficácia de transfecção. reparação de ADN por FCR foi avaliado pela proporção de células com ambos os sinais vermelho e verde para aqueles com apenas sinais vermelhos. As inserções mostram imagens representativas de células positivas e negativas para o HRR. Os dados foram apresentados como a média ± DP da percentagem de células positivas para a reparação de ADN por FCR a partir de três experiências independentes. D, teste de reparação DSB para NHEJ. células DU145 pré-tratadas com ou sem AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) ou ambos. extractos nucleares correspondentes foram incubadas com o plasmídeo linearizado pBluscript KS (+) num sistema isento de células para medir NHEJ. O DNA de plasmídeo linearizado sem o tratamento com os extractos nucleares (apenas ADN) e o extracto nuclear a partir de células de controlo sem o plasmídeo (extracto nuclear apenas) foram usadas no controlo negativo. extracto nuclear a partir de fibroblastos R503 foi usada como um controlo positivo. As setas indicam as posições de plasmídeo linearizado e dímeros. E, ensaio Western-blot detectar NHEJ proteína relacionada. células DU145 pré-tratadas com ou sem AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM), ou ambos, e, em seguida, irradiada para a proteína nuclear relacionados com NHEJ (DNAPK, K70 /80, a XRCC4). Lamina foi utilizada como um controlo de carga. * P 0,05, ** P 0,01, em comparação com as células de controlo

Efeitos de inibidores de EGFR e IGF1R sobre a deficiência de ORL reparar através da inibição do FCR, mas não da NHEJ

.

para diferenciar se o reparo DSB prejudicada foi devido a um defeito no HRR ou NHEJ, as duas principais vias para o reparo DSB, nós avaliada quantitativamente HRR usando o sistema repórter recombinação pDR-GFP e examinou NHEJ usando um

in vitro ensaio isento de células

[20]. Tal como mostrado na Figura 2C, para células DU145, o tratamento combinado com AG1024 e erlotinib nível HRR potentemente reduzido quando comparado com o controlo do veículo ou cada um dos agentes isoladamente (P 0,05). Em contraste, o extracto nuclear tratado com inibidor individuais ou ambas não foram capazes de alterar o

In vitro

ligação de pBluescript KS (+), quando comparado com o extracto nuclear a partir de células de controlo do veículo (Figura 2D). Para esta análise, o extracto nuclear a partir de células R503 foi utilizado como controlo positivo, tal como demonstrado por Yang et al [23]. Além disso, a expressão de proteínas de reparação de ADN relacionadas com NHEJ, incluindo ADN-PK, Ku70, Ku80 e a XRCC4, não foram afectadas pela AG1024, erlotinib ou tanto em células DU145 (Figura 2E), o que sugere que a inibição destas duas vias de sinalização não fez comprometer-iniciado NHEJ de reparação do ADN DSB, uma das formas mais comuns de reparação de DSB em células de mamíferos.

Supressão de interferência de sinal em múltiplos níveis de inibição de ambos os EGFR e IGF1R

estudos anteriores revelaram extensa diafonia entre o EGFR e o IGF1R via de sinalização em múltiplos níveis de [14]. Nossos dados acima têm demonstrado que a co-inibição do EGFR e IGF1R poderia aditiva radio-sensibilizar células PC através do comprometimento da reparação HRR DSB. Para investigar mais profundamente a forma como a interacção entre os dois receptores afecta reparação de DSB, foi realizada imunoprecipi tacão-Westernblot para examinar a interacção física entre o EGFR e do IGF1R em DU145 e PC3 células seguindo-γ irradiação. Os nossos dados mostraram que sem irradiação, estes dois receptores interagem uns com os outros em ambas as linhas celulares tumorais e que esta associação não foi significativamente alterada em 24 h após a irradiação (Figura 3A). Além disso, determinou-se a transdução de sinal a jusante de um receptor em resposta ao ligando do outro receptor. Tal como mostrado na Figura 3B, para células DU145 e PC3, a fosforilação do EGFR foi aumentada de uma maneira dependente da dose para o tratamento de IGF-I em ambas as células, mas foi significativamente reduzido com a co-tratamento com o inibidor de EGFR, erlotinib. Do mesmo modo, a fosforilação da IRS1, a molécula principal de sinalização do IGF1R, foi aumentada após o tratamento com concentrações crescentes de EGF, mas foi inibido após a adição de AG1024 (Figura 3C). Além disso, verificou-se que o ligando para cada receptor, isto é, o IGF-I e EGF, foi suficiente para activar estes genes alvo em células DU145 e PC3. No entanto, a activação mais robusta foi conseguida com co-tratamento com IGF-I e o EGF, enquanto que o bloqueio destes receptores de sinalização quer com AG1024 ou erlotinib foi capaz de reduzir a activação destes genes alvo, mas a redução mais potente foi observada em DU145 e células PC3 pré-tratados com ambos os inibidores (Figura 3D). Estes dados sugerem que a co-tratamento com EGFR e inibidores IGF1R foi capaz de suprimir o seu crosstalk e por sua vez bloquear a sinalização a jusante, incluindo a via PI3K /AKT e MAPK via.

A, Immunoprecipitation detectar EGFR interação /IGF1R. células DU145 e PC3 foram irradiadas a uma dose de 2 Gy. Em seguida, as proteínas celulares foram extraídos e submetidos a análise de imunoprecipitação detecção de EGFR e interacção do IGF1R. B, o IGF-I activa o EGFR em células DU145 e PC3. As células foram privadas de soro durante a noite, e, em seguida, submetido a estimulação do IGF-I durante 30 min. fosforilação do EGFR foi detectado por Western blot. C, EGF ativa IRS1, o factor-chave da via de sinalização IGF1R em DU145 e células PC3. As células foram privadas de soro durante a noite, e, em seguida, submetido a estimulação EGF durante 30 min. IRS1 fosforilação foi detectado por Western blot. D, MAPK ou AKT ativação depois EGFR e IGF1R simulação de inibição. células DU145 e PC3 foram tratadas com ou sem AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM), AG1024 mais erlotinib; IGF (50 ng /ml), EGF (50 ng /ml), EGF ou mais IGF durante 30 min. Em seguida, a ERK1 /2 e phosphrylation expressão, expressão de AKT e phosphrylation, expressão e IRS1 phosphrylation foi determinada por Western blotting. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga.

Efeitos de inibidores de EGFR e IGF1R sobre supressão de IRS1 /recombinação homóloga Rad51 mediada

Nossos dados atuais sobre AG1024 e Erlotinib IRS1 regulação fosforilação /ativação implicado o envolvimento potencial do IRS1 /HRR Rad51-mediada em resposta a irradiação y em células PC, como estudo anterior também indicou [24]. Com efeito, os nossos dados mostraram que IRS1 fosforilação foi induzida por γ-irradiação com a activação de pico obtida a 4 h após a γ-irradiação nas células DU145 e PC3, enquanto que o pico de IRS1 fosforilação foi atrasada até 8 h após γ-irradiação após o tratamento com AG1024 ou sozinho erlotinib. Em contraste, a co-tratamento com ambos AG1024 e erlotinib reduziu significativamente a activação IRS1 não só ao nível basal (0 h pós-irradiação) mas também em todos os pontos de tempo até 24 horas após a irradiação (Figura 4A).

a, Western blot que mostra o nível de p-IRS1 em diferentes pontos de tempo depois de 2 Gy γ-irradiação de DU145 e células PC3 pré-tratadas com ou sem AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM), ou ambos, durante 24 h. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. A imagem do gel representativo é mostrado na parte superior e quantificação p-IRS1 /rácio β-tubulina de três experiências independentes, mostrados na parte inferior. B, imunoprecipitação que mostra a interacção entre IRS1 e Rad51 no extracto nuclear de células DU145 e PC3. C, A formação de focos Rad51 nuclear, tal como analisado por coloração por imunofluorescência. células DU145 e PC3 foram mantidas com ou sem AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) ou ambos (esquerda quatro barras), transfectadas por simulação (pseudotreated), ou transf ectadas com o controlo não-específica siRNA (NSC siRNA) ou com IRS1 siRNA (direita três bares). As inserções mostram imagens representativas com sinal de Rad51 verde e azul coloração nuclear DAPI. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, em comparação com AG1024 /Erlotinib- células tratadas ou pseudotreated; ** P 0,01, em comparação com AG1024- ou células tratadas com erlotinib. D, Rad51 imunofluorescência de coloração de DU145 e PC3 células tratadas com LY292004, PD98059, ou erlotinib seguido por γ-irradiação. A formação de focos Rad51 nuclear foi determinada na mesma como em C. inserções mostram imagens representativas com sinal de Rad51 verde e azul coloração nuclear DAPI. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. * P . 0,05, em comparação com as únicas células irradiadas

Em seguida, determinou-se a interacção fisica entre IRS1 Rad51 e na fracção nuclear das células seguiram-γ irradiação usando imunoprecipitação. Como mostrado na Figura 4B, o tratamento com veículo, AG1024, erlotinib ou AG1024 mais erlotinib não alterou significativamente os níveis de proteína IRS1 ou Rad51, enquanto que os níveis de-IRS1 associada com Rad51 foram drasticamente reduzida nas células tratadas com AG1024 mais erlotinib, o que é consistente com o nível significativamente reduzido de fosfo-IRS1 nestas células. Estes dados demonstram que AG1024 mais Erlotinib tratamento suprimida interação IRS1 com Rad51, indicando EGFR e IGF1R co-inibição poderia inibir DNA dupla vertente de reparação ruptura pela inibição da HRR.

Além disso, nós também determinou a localização subcelular de Rad51 que formam focos nuclear em locais de lesões de ADN. Os nossos dados mostraram que aproximadamente 15% das células de controlo tratados com veículo foram positivos para focos Rad51 nuclear após a exposição a irradiação y.