Sumário

Follistatin (FST), uma folliculogenesis regulação de proteínas, é encontrado em concentrações relativamente elevadas em tecidos ovarianos do sexo feminino. FST actua como um antagonista de Activina, que é muitas vezes elevados no carcinoma do ovário humano, e, assim, podem servir como um alvo potencial para a intervenção terapêutica contra o cancro do ovário. O gene de suscetibilidade ao câncer de mama 1

(BRCA1

) é um gene supressor de tumor conhecido no câncer de mama humana; Contudo o seu papel no cancro do ovário não é bem compreendido. Foram realizadas análises de microarray em linha de células de carcinoma do ovário humano SKOV3 que sobre-expressam de forma estável de tipo selvagem de BRCA1 e em comparação com os clones transfectados com vector vazio correspondente. Descobrimos que a expressão estável de BRCA1 não só estimula a secreção FST mas também inibe simultaneamente expressão Activina. Para determinar a importância fisiológica deste fenômeno, nós investigamos o efeito do BRCA1 celular sobre a secreção FST em imortalizado epiteliais da superfície do ovário células (Iosé) derivada de ambos ovários ou ovários de um paciente com câncer de ovário carregando uma mutação em humanos normais

gene BRCA1

. Knock-down de

BRCA1

em células normais Iosé demonstra down-regulação da secreção FST junto com a simultânea up-regulação da expressão de Activina. Além disso, knock-down de

FST

em linhas celulares, bem como Iosé linha celular SKOV3 mostraram uma redução significativa da proliferação celular e migração das células diminuiu quando comparados com os respectivos controlos. Assim, estes resultados sugerem nova função para o BRCA1 como um regulador de expressão FST e função em células de ovário humano

Citation:. Karve TM, Preet A, Sneed R, Salamanca C, Li X, Xu J, et ai. (2012) BRCA1 regula Follistatin função no cancro do ovário e de superfície do ovário células epiteliais humanas. PLoS ONE 7 (6): e37697. doi: 10.1371 /journal.pone.0037697

editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de julho de 2011; Aceito: 26 de abril de 2012; Publicação: 01 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Karve et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Tapas Saha é grato a American Cancer Society (IRG # 97-152-16-2), Centro de Fisher para Familial Cancer Center, Lombardi Comprehensive Cancer Center, da Universidade de Georgetown para apoio financeiro. Este trabalho foi apoiado, em parte, pela National Institutes of Health Grants 1U56CA101429-01 (ao Dr. Peter Shield, Deepak Kumar e Dr. Carolyn primo). Eliot M. Rosen tem sido apoiado, em parte, pelas bolsas de investigação a partir do USPHS (R01-CA150646), Susan G. Komen for the Cure (KG110580), Living in Pink, eo programa Universidade World Class financiado pelo Ministério da Educação , Ciência e Tecnologia através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (R31-10069). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é um dos principais cânceres ginecológicos nos Estados Unidos com 22,280 novos casos estimados e 15.500 mortes em 2012 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/ovarian; apreciada em fevereiro de 2012). As altas taxas de mortalidade por câncer de ovário são atribuídas principalmente ao diagnóstico fase tardia da doença; quase 60-65% dos casos de cancro do ovário são diagnosticados quando o cancro já com metástase para além dos limites do tecido ovariano. A detecção precoce de câncer de ovário é mostrado aumentar significativamente a expectativa de vida do paciente para tão alto quanto 85% [1]. Assim, existe uma necessidade de desenvolver biomarcadores que podem ser úteis na detecção de cancro do ovário na fase inicial da doença. A maioria dos cancros do ovário ocorrer dentro do epitélio de superfície do ovário (OSE) e, portanto, investigações com células OSE derivadas de ambos os pacientes normais e de cancro do ovário indivíduo são críticas para a elucidação da etiologia do cancro do ovário humano. mutações genéticas Curiosamente, apenas 5-10% das mulheres com câncer de ovário herdaram em genes supressores de tumor, tais como

BRCA1

e

BRCA2

que os predispõe ao câncer de mama e de ovário [2], [ ,,,0],3], [4]. Além disso, um estudo de ligação genética coorte de 214 consistindo de cancro da mama e da mama-cancerosas do ovário famílias combinadas, revelou que 90% dos doentes mutações abrigado na sua

gene BRCA1

[5]. Além disso,

BRCA1

mutação (s) mulheres portadoras têm cerca de 15 vezes maior risco de desenvolver câncer de ovário quando comparados com os seus homólogos do sexo feminino não-portadoras [6], [7].

Follistatin ( FST), uma glicoproteína de cadeia única autócrino, é expresso em quase todos os tecidos humanos, tais como rim, cérebro, útero, da mama e com a maior concentração encontrada no tecido do ovário humano [8]. Madura, forma segregada de proteína FST existe em três isoformas; De Corpo Inteiro, intermediário e menor que consiste em 315, 303 e 288 aminoácidos, respectivamente [9]. FST, inicialmente isolado a partir do fluido folicular foi encontrado para interagir com activina, um membro do factor de crescimento transformante-β (TGF-β) superfamília. Activina tem sido demonstrado que regulam a proliferação celular, a diferenciação, a angiogénese, bem como a apoptose, e, assim, podem ser eventualmente envolvidos na regulação do crescimento do tumor do ovário [10]. Os níveis elevados de Activina são detectados não só na maioria dos tumores de ovário epitelial de origem, mas também em amostras de soro colhidas a partir de pacientes de cancro do ovário epiteliais. Altos níveis de Activina são pensados ​​para ser responsável por promover a progressão da doença e são preditivos de pior prognóstico da doença em pacientes com câncer ovariano [10]. FST se liga a Activina de forma antagônica e expressão elevada de FST celular pode leva ao papel citoproteção em pacientes com câncer de ovário. Um estudo recente demonstrou que a transfecção transiente com o tipo selvagem (wt)

FST

foi demonstrado inibir a metástase em linhas celulares de cancro de pulmão de pequenas células [11]. Em contraste, significativamente mais elevada (P 0,05) as concentrações de FST têm sido relatados em pacientes com cancro do ovário, quando comparado com voluntários saudáveis ​​da mesma idade

Os membros do TGF-ß superfamília têm sido mostrados para modular o crescimento de. células epiteliais do ovário humanos normais

in vitro

[12], [13]. Assim, as mutações nos receptores de TGF-ß ou suas moléculas sinalizadoras intracelulares, tais como proteínas SMAD foram implicados no desenvolvimento de vários cancros [14], [15], [16], [17], [18], incluindo o cancro do ovário humano [19], [20], [21]. Outro membro da superfamília TGF-ß, inibina, é um antagonista funcional da activina e foi mostrado para modular o crescimento de células epiteliais normais de ovário humano [22], [23]. Inibinas, produzidos por gônadas humanos, desempenham papel crucial na atenuação de sinalização de Activina-regulada no sistema gonodal humana [22]. A inibina é activado pela presença de um co-factor, de beta-glicano, que por sua vez competir com activina para se ligar com os receptores de activina (átrios e ActRIIB), antagonizando assim cascata de sinalização de Activina-regulados [24]. Além disso, a inibina total tem sido sugerido como um potencial marcador sérico para epitelial-origem do cancro do ovário humano. Para além disso, relacionada com folistatina proteína do gene (FLRG), que apresenta uma forte homologia com FST, e tem sido mostrado para interagir e bloquear a função dos ligandos da superfamília TGF-ß incluindo Activina, proteína morfogenética óssea (BMP) -2, BMP-6 , BMP-7 e GDF-8. FLRG é expresso principalmente no coração, pulmão, rim e placenta e pode ser estimulada por TGF-ß, Activina e Proteínas Smad [25]. expressão FLRG é relatado para ser altamente variável em várias linhas e tecidos de câncer. Um estudo recente mostrou que a regulação negativa da FLRG inibe o crescimento de tumores de mama humana [26].

Vários estudos têm proposto que as estratégias terapêuticas dirigidas, especificamente mediadores moleculares que down-regulam os níveis de expressão de Activina endógenos podem retardar ou inibem câncer de progressão [27]. Assim, um possível papel do FST como um antagonista Activina na patogênese do câncer de ovário exige uma investigação mais aprofundada. Neste estudo, foram utilizados imortalizado epitélio de superfície do ovário (Iosé) células de ovário humano normal (Iosé 7576 e Iosé 397) e de um paciente com cancro do ovário com

BRCA1

mutação, Iosé 592.oF, para investigar o papel do BRCA1 na mediação da secreção de FST nestas células. Nós também construiu vários clones BRCA1 estáveis ​​na linha de células de adenocarcinoma de ovário SKOV3 que ectopicamente expressar a proteína BRCA1 (

i.

BRCA1-SKOV3). Nós inicialmente realizada uma análise microarray usando clone BRCA1-SKOV3 e controlar clone neo para identificar biomarcadores precoces em cancros do ovário. Em seguida, nós validado nossos resultados usando análise real time-PCR e descobriu que

FST

e

SMAD6

foram regulados positivamente em BRCA1-SKOV3 clone nº 19, bem como em toda a célula Iosé linhas. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a perda ou diminuição dos níveis de secreção FST em células de ovário pode potencialmente servir como um marcador para a carcinogênese de ovário humano.

Métodos

Os vectores de expressão e reagentes

a de tipo selvagem (wt) o plasmídeo de expressão de BRCA1 foi criada por clonagem de ADNc de BRCA1 no vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando artificialmente manipulado 5 ‘

Hind III e

3′

não

I locais [28]. Dimetilsulfóxido (DMSO), de ß-mercaptoetanol, e todos os outros produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra forma.

linhas de células e condições de cultura

linha celular SKOV3 foi obtido a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), aminoácidos não essenciais (100 mM), L-glutamina (5 mM), estreptomicina (100 mg /ml) e penicilina (100 U /ml) (todos de Lonza, Inc., Walkersville, MD). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 e sub-cultivadas duas vezes por semana, utilizando tripsina (Lonza) [29]. clones de BRCA1 de SKOV3 estáveis, bem como transfectadas (neo) clones de vazio por vectores estáveis ​​foram gerados através de transfecção com os vectores correspondente, seguida por selecção com geneticina (Invitrogen).

células imortalizada epitélio de superfície do ovário (Iosé)

as linhas de células imortalizadas (Iosé 7576, Iosé 397 e Iosé 592.oF) foram tipo dom de Dr.Nelly Auersperg da Canadian tecido ovariano Bank (University of British Columbia, Vancouver, Canadá). Resumidamente, as células epiteliais da superfície do ovário foram raspadas a partir de tecido da superfície do ovário humano e cultivadas em meio de 01:01 mistura de 199 (Invitrogen) e MCDB 105 (Sigma) suplementado com FBS a 10%, NaHCO 3 (2,2 g /L), L-Glutamina ( 5 mM), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL) (todos da Invitrogen). As culturas de baixa passagem de células do epitélio da superfície do ovário humano isolados foram então imortalizadas por transfecção com partículas virais de antigénio grande de SV40-T [30]. As características morfológicas e o padrão de crescimento de linhas celulares Iosé foram observados para imitar células epiteliais da superfície dos ovários nas matrizes extracelulares. Além disso, as células Iosé apresentam forte semelhança morfológica com as células ovarianas neoplásicas precoces em seres humanos e, assim, servir como um excelente modelo para o

in vitro

estudos voltados para a carcinogênese de ovário humano [30], [31].

Affymetrix oligonucleotide microarrays

Affymetrix microarrays análises foram realizadas no Lombardi Cancer Center Genómica e epigenomics Recursos Partilhados instalação do núcleo da Universidade de Georgetown. isolamento de ARN, a síntese de cDNA, as hibridações de chips de genes, e análise de dados foram realizadas conforme descrito anteriormente [32]. O vector vazio e o clone de BRCA1 estável em células SKOV3, que foram utilizados para gerar dados de microarray exaustivamente descritas na nossa manuscrito anteriormente [32]. Os chips de genes utilizados para estes experimentos foram Genoma Humano U133 mais 2,0 Matriz. Todos os dados microarray foi Miame (Informações mínimas sobre um experimento Microarray) em conformidade e os dados em bruto foi depositado em Gene Expression Omnibus de banco de dados (GEO) como descrevemos em nosso manuscrito anterior [32]. O número de acesso para esta submissão é GSE30296. agrupamento hierárquico dos genes seleccionados foi feito como anteriormente [32].

transfecções transientes

células em proliferação SKOV3 foram transfectadas durante a noite com os vectores de expressão indicados (4-6 ug de ADN de plasmídeo por poço de uma placa de 6 poços ou de 20-25 ug por placa de 100 mm) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como descrito anteriormente [29], [33]. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS 1X seguido de incubação com meio de cultura fresco para até 24-48 h para a expressão do gene.

interferir pequeno (Si ARN) Tratamentos

células em proliferação foram assincronamente pré-tratadas com siRNA específico do gene (100 nM durante 72 horas) utilizando siPORT amina (Ambion, Foster City, CA). A eficiência de knock-down foi confirmado através de imunotransf erência para a proteína (s) alvo. Seguintes siRNAs foram usados ​​neste estudo: o controle siRNA [ON-TARGET

além

Non-targeting siRNA (Cat # D-001810-01, Dharmacon, Chicago, IL)]; siRNA específico FST foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; -specific siRNA BRCA1 [associação de dois ARNsi sintetizado a partir de costume Dharmacon (sequências 5 ‘→ 3’ CAGCTACCCTTCCATCATA e CTAGAAATCTGTTGCTATG)]. Ambos FST e BRCA1 siRNA foram dirigidas contra o ORF dos respectivos genes

semi-quantitativa da Transcriptase Reversa -. Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), análise

semi-quantitativos Os ensaios de RT-PCR eram realizada como descrito anteriormente [29]. Resumidamente, as células foram tratadas como indicado acima e o ARN total foi extraído utilizando o RNase fácil Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Alíquotas de RNA total (50 ng) foram transcritas inversa utilizando 50 unidades de Superscript III transcriptase reversa (Invitrogen) num volume de reacção de 20 uL. A amplificação por PCR semi-quantitativa foi realizada usando 1 ml alíquota de cada amostra de ADNc transcrita, utilizando a quente iniciar a polimerase Taq (Denville, South Plainfield, NJ). O ADN foi desnaturado, primeiro durante 5 min a 95 ° C, e, em seguida, amplificado utilizando ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 seg a uma temperatura específica de recozimento, e 1 min a 72 ° C, com a final de 10 minutos de incubação a 72 ° C . O número de ciclos foi ajustado de modo a que todas as reacções estavam dentro do intervalo linear da amplificação de produto de PCR. A frente e os iniciadores utilizados, as temperaturas de recozimento e os tamanhos esperados dos produtos de PCR inversa estão apresentados na Tabela 1. A análise quantitativa quer dizer a partir de pelo menos três experiências independentes, está representado, juntamente com o erro padrão das medições (± SEMs).

quantitativo em tempo real-PCR (Q-PCR), análise

o Q-PCR foi realizada pelo sistema ABI PRISM 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando SYBR Green PCR master misture reagente (Applied Biosystems) num volume de reacção de 25 uL. 10 ng de amostras de cDNA com primers específicos de gene apropriado foram usadas para cada análise de PCR. valores limiares do ciclo foram ajustados automaticamente, e as alterações de dobragem para cada par de iniciadores específicos para o gene foram determinados. primers Q-PCR estão listadas na Tabela 1 e foram obtidos a partir Tempo real Primers, LLC., Parques Elkin, PA.

Western blot

As células foram tratadas como indicado e foram preparados lisados ​​de células inteiras tal como descrito anteriormente [34]. Resumidamente, as células pós-tratamento foram lavados com 1X PBS e lisaram-se utilizando um ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão (Roche, Indianapolis, IN) suplementado com Mini completa, cocktail inibidor de protease de comprimido isento de EDTA (Roche) em gelo durante 10 min. As células lisadas foram agitadas a 4 ° C durante 20 min, seguido de centrifugação a 12.000 x g durante 20 min. Alíquotas de proteína (50 ug) em 4X LDS (dodecil sulfato de lítio) de tampão de amostra (Invitrogen) foram analisados ​​nas Bis-Tris (BT) géis pré-moldados de 4-12% (Invitrogen). As proteínas fraccionadas foram transferidas para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA) e bloqueados durante uma hora em 5% de leite magro em 1X PBS-Tween 20. As membranas foram depois incubadas com os anticorpos primários indicados e subsequentemente com peroxidase de rábano específicas da espécie (HRP) -conjugated anticorpo secundário (Santa Cruz). proteínas riscados foram visualizadas utilizando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Santa Cruz). Os anticorpos primários utilizados foram: BRCA1 (C-20, Santa Cruz, 1:200); FST (K-19, Santa Cruz, 1:100); Actina (C-11, Santa Cruz, 1:400) e Activina (ab89307, Abcam, Cambridge MA, 1:1000).

Follistatin Ensaio

Detecção quantitativa dos níveis de FST celulares foi realizada utilizando o kit Quantikine Human FST Immunoassay (R D Systems Inc., Minneapolis, MN) que emprega o método quantitativo imunoensaio sanduíche enzima (ELISA). Resumidamente, uma curva padrão foi feita para quantificar a quantidade de FST nos lisados ​​de células e meio de cultura usando padrões conhecidos FST fornecidos no kit. As células foram tratadas tal como indicado, e o meio a partir das células tratadas foi diluída 10 vezes para o ensaio. Ambos os padrões e as amostras diluídas foram pipetados para os poços pré-revestidas com anticorpo monoclonal FST. O anticorpo imobilizado foi deixada ligar-se a FST presente nas amostras, seguido pela incubação de um anticorpo monoclonal ligado a enzima específica para FST em cada poço. Uma solução de substrato foi adicionada aos poços após a incubação levando a um desenvolvimento de cor em proporção com a quantidade de FST ligado durante o passo de reacção inicial. A intensidade da cor é medida a dois comprimentos de onda (450-540 nm). A quantidade de FST em cada indicado amostras representados como médias ± SEMs.

A migração celular Assay

A migração celular foi testada usando CytoSelect 96 poços Kit de migração celular, 8 mm, Fluorométrica (célula Biolabs, Inc. San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante, que é baseado no método de Boyden Câmara. Resumidamente, as células tratadas /não tratada foram suspensas num meio de cultura isento de soro e depois plaqueadas na câmara de membrana superior da placa de migração celular. A câmara de membrana contendo as células foram então colocados no topo da bandeja de alimentação para facilitar a migração de células através da membrana. A quimio-atrativo utilizado na bandeja de alimentação foi meio de cultura celular completo contendo 10% FCS. O conjunto completo foi incubada a 37 ° C incubadora de cultura de células durante 24 horas. As células migraram de cada amostra foi coletada da bandeja de alimentação; lisadas utilizando um tampão de lise consistindo em CyQuannt fluorescente GR corante, e a fluorescência total das células que migraram foi quantificada utilizando um leitor Victor 1420 de fluorescência de microplacas (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Waltham, MA) a dois comprimentos de onda (480-520 nm ). As unidades de fluorescência (UF) observados são directamente proporcional ao número de células que migraram; Quanto maior a fluorescência observada superior a migração celular. Uma curva padrão foi construída para cada linha celular utilizando uma densidade de célula elementar de acordo com as instruções do fabricante, e os dados obtidos a partir da curva padrão a partir de cada linha celular (tratada /não tratada) estão representados como médias ± SEMs.

celular Ensaio de proliferação de

kit de fluxo com FITC BrdU da BD Pharmingen (San José, CA) foi usado para realizar os ensaios de proliferação de células com as linhas de células Iosé conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, 10 uM de BrdU foi adicionado às células em fase logarítmica de crescimento de modo assíncrono durante uma hora para pulsar as células. As células foram então fixadas e permeabilizadas utilizando BD Cytofix /Cytoperm tampão (fornecido com o kit), e subsequentemente tratado com ADNase para expor BrdU. anticorpo FITC foi então usado para detectar BrdU, e, em seguida, as células foram sujeitas a um citómetro de fluxo FACSort (Becton Dickinson, San José, CA) e os parâmetros foram estabelecidos de acordo com as instruções do fabricante. A análise FACS foi feito na citometria de fluxo e separação de células Recursos Partilhados no Lombardi Cancer Center, da Universidade de Georgetown. Os dados obtidos foram representados como meios SEMs ± das células cento BrdU marcados.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​estatisticamente pelo ‘Uma análise de variância (ANOVA), através de Tukey Test’, que é uma comparação de pares das respostas médias para os diferentes grupos de tratamento utilizando software estatístico SigmaStat (Ver 3 para Windows). Um valor de P 0,05 ou menos foi considerado significativo para todos os experimentos

Resultados

A expressão estável de BRCA1 na linha de células SKOV3

Ao contrário do câncer de mama, não há nenhum bem. orientações -established ligando

BRCA1

mutações e predisposição do indivíduo para desenvolver câncer de ovário. Aqui, utilizamos linhagem humana ovário célula cancerosa (SKOV3) como uma linha de células de cancro do ovário pai e gerou vários clones estáveis ​​que ectopicamente expressas wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) e seu vazio vector fundo, pcDNA3 (Neo). Como se pode ver na Figura 1A, # 4, # 18, e # 19 clones de BRCA1 de SKOV3 demonstraram um aumento significativo na expressão de BRCA1 (P 0,05) em comparação com células SKOV3 parentais correspondentes, bem como clones de Neo. A análise densitométrica das três transferências de Western independentes é mostrado na Figura 1B como médias ± erro padrão de medição (SEMs). Assim, a geração de linhas de células SKOV3 sub-expressão com BRCA1 estável seria ainda ajudar a compreender o efeito do BRCA1 no carcinoma do ovário humano.

várias linhas estáveis ​​(A) foram criadas utilizando a sobre-expressão de BRCA1 e o seu vector de fundo, pcDNA3 em células de carcinoma do ovário SKOV3. Os níveis de expressão de BRCA1 são mostrados em todos os clones de células. Parental indica apenas as células SKOV3 não-transfectadas. A análise densitométrica de três imunoblots independentes é dada em (B). As barras de erro são SEMs. * Representa P 0,05 (em comparação com parental)

expressão gênica diferencial devido à sobre-expressão BRCA1 nas células SKOV3

Com base na expressão BRCA1 de # 19 clone de BRCA1-SKOV3 (. doravante designado como BRCA1-SKOV3 clone # 19) foi selecionado e emparelhado com Nº3 de clone Neo (doravante referida como clone Neo 3 #) para a análise microarray Affymetrix. ARN a partir de três passagens em culturas separadas de BRCA1 de SKOV3 clone # 19 células e Neo clone # 3 células foi isolado e submetido a análise de microarray (ver métodos para detalhes). Em seguida, construiu-se um agrupamento hierárquico da expressão de genes que foram significativamente (P 0,05) alterado nas BRCA1 de SKOV3 O clone # 19 células e comparados com o clone # 3 Neo células. Observamos mais de 10 dobrar-regulação em 274 genes e mais de 4 dobra para baixo-regulação em 279 genes para as células BRCA1-SKOV3 clone # 19, quando comparado com Neo clone # 3 (ver Tabela S1, bem como correspondente mapa de calor na Figura S1 ). Usando esses dados microarray, a análise Ingenuity Pathway revelou que BRCA1 superexpressão em células SKOV3 (BRCA1-SKOV3 clone # 19) modula vários sinalização criticamente importante e vias metabólicas (ver Tabela S2 para os genes regulados positivamente e Tabela S3 para os genes regulados por baixo no BRCA1-SKOV3 clonar # 19). A lista de genes foi posteriormente reduzida para selecionados 40 genes com base em cerca de 3 vezes de mudanças nos níveis de expressão quando comparado com o controle, e com valores significativos p (p 0,05). Os grupos selecionados de genes foram encontrados para ser a principal responsável para o crescimento celular, a progressão do ciclo celular e resposta ao estresse oxidativo, que eram de interesse primário para o estudo atual. agrupamento hierárquico foi refeito com estes 40 genes selecionados conjunto de dados de sobre-regulada (vermelho) ou regulada para baixo (verde) genes devido a wtBRCA1 superexpressão no BRCA1-SKOV3 clone celular # 19 (Figura 2). A resultante dois grupos de genes, juntamente com a sua fold-change e valor de p são fornecidos no painel direito da Figura 2.

Um mapa de calor que mostra mudanças significativas em um grupo de genes selecionados devido à sobre-expressão de wtBRCA1 em SKOV3 células de carcinoma de ovário. Foram realizadas três análises microarray independentes. Dois grupos foram detectados, um devido a infra-regulação dos genes (verde) e outra devido ao aumento da regulação dos genes (vermelho). Fold mudança e p valores dos genes nos clusters são dadas à direita

FST, um antagonista de Activina, é responsável pelo desenvolvimento ovariano precoce.; no entanto, não se sabe muito sobre a regulação celular do FST em tecido ovariano humano. FST nível elevado em células de ovário humanos são sugeridas como sendo citoprotector contra a carcinogénese do ovário. Temos observado 51,6 vezes maior expressão do FST em BRCA1-SKOV3 clone # 19 quando comparado com o Neo clone # 3 células. Inibina também foi encontrado para ser significativamente (p 0,05) células SKOV3 BRCA1 de sobre-regulada (11,6 vezes) em. Vários estudos têm sugerido o papel potencial de inibina como um biomarcador para o cancro do ovário de origem epitelial [35]. Alguns estudos propondo inibina como um marcador sérico na carcinogénese do ovário revelaram que os níveis de inibina são elevados em aproximadamente 70-80% dos pacientes com cancro do ovário tipo mucinoso, e em 15-35% de não-mucinoso tipo epiteliais casos de cancro do ovário [36] , [37]. Estudos mostraram ainda que nas mulheres na pós-menopausa, inibina total pode ser combinado com o CA-125 para o diagnóstico eficiente das carcinogénese epitelial do ovário [35].

Além disso, verificou-se que vários outros membros de TGF- β família, tais como TGF-beta2, TGF-SSR1, TGF-ßR3 e um inibidor SMAD, SMAD6, foram também sobre-regulada em BRCA1 de SKOV3 clone # 19 (Figura 2). Assim, a abordagem de agrupamento hierárquico não só foi capaz de confirmar o número de potenciais marcadores previamente conhecidos no câncer de ovário, mas também revelam vários outros alvos moleculares putativos que podem ser de interesse para a concepção de tratamento específicos para câncer de ovário humano.

Validação Affymetrix de resultados de microarray por semi-quantitativo de RT-PCR

Temos utilizado RT-PCR para validar os resultados obtidos a partir da análise de microarray. Três clones estáveis ​​individuais para cada Neo e linhas celulares de BRCA1 de SKOV3 foram usadas para executar semi-quantitativa por RT-PCR. Encontramos uma correlação significativa (P 0,05) entre o microarray e os resultados de RT-PCR. A Figura 3A mostra expressões de mRNA representativas dos genes indicados em todos os grupos de células. A Figura 3B demonstra a estimativa quantitativa das expressões de ARNm de todos os genes sob investigação com base em pelo menos três experiências independentes. Em todos os casos, a expressão de ARNm de FST foi significativamente (P 0,05) maior em clones de BRCA1 de SKOV3 quando comparado com clones neo, validar os resultados observados na análise de microarray, embora seja necessário notar que o grau de dobragem de mudanças é variável ; possivelmente devido à diferença na sensibilidade das duas técnicas. BRCA1 de SKOV3 clone # 19 demonstrou máxima sobre-regulação de BRCA1 entre as linhas de células estáveis; portanto, todas as futuras experiências foram realizadas utilizando este clone, como mostrado acima, e foi comparado com o clone # 3 Neo. Além disso, a RT-PCR confirmou também a sobre-regulação de SMAD6 no BRCA1 de SKOV3 clone # 19 (Figura 3A). Além disso, foi investigado o efeito da expressão transitória de BRCA1 nas células SKOV3 parentais. Os resultados mostrados na Figura 3C são consistentes com os resultados observados na Figura 3A e 3B. a expressão de ARNm de FST verificou-se ser significativamente (P 0,05) elevado em BRCA1 overexpressed células SKOV3, quando comparado com o vector de fundo transfectadas (pcDNA3), bem como células SKOV3 parentais. Além disso, a expressão de ARNm de SMAD6 também foram elevados nas células que sobre-expressam wtBRCA1 (Figura 3C). Densitometria da expressão dos genes de interesse a partir de pelo menos três experiências independentes são apresentados na Figura 3D.

(A), de proliferação de clones estáveis ​​tanto Neo (pcDNA3-SKOV3) e wtBRCA1 (BRCA1 de SKOV3) foram colhidas para o ensaio semi-quantitativo de RT-PCR como descrito em “Métodos”. As bandas correspondentes aos respectivos genes são indicados no lado direito. (B) As bandas de PCR a partir de três experiências independentes uns dos genes indicados foram quantificadas por densitometria e os níveis de ARNm foram normalizados para a actina. células (C) Proliferating SKOV3 foram transfectadas transientemente quer com wtBRCA1 ou vector pcDNA3 fundo e os ARN isolado foi analisado por semi-quantitativa por RT-PCR. Os resultados foram quantificados como descrito acima e representado pelo diagrama de barras (D). As barras de erro são SEMs. * P . 0.05 (uns em relação aos controlos)

BRCA1 regula a secreção FST em células de carcinoma do ovário SKOV3

FST é secretada por fluido folicular do ovário na região extracelular, e é essencial para o desenvolvimento precoce do ovário [38].

In vitro

experimento com células do ovário em cultura apresentam níveis diferenciais de secreção FST no meio de cultura, dependendo de tratamentos com células e condições de cultura. Assim, uma forma diluída serve uma boa fonte para medir a secreção e a expressão de FST num tipo de célula particular. A Figura 4A demonstra uma curva padrão obtida com a proteína purificada FST, que foi utilizado para quantificar a quantidade de FST segregada nas amostras sob investigação. Os nossos resultados demonstram que a expressão de BRCA1 nas células SKOV3 mostra aproximadamente duas vezes mais elevada segregada FST quando comparado com as células pCDNA3-transfectadas (Figura 4B). Além disso, foi realizado ensaio FST quantitativa similar usando células SKOV3 onde-in BRCA1 foi knocked-down por siRNA específico do BRCA1. A Figura 4C mostrou diminuição%, pelo menos 50 no FST expressão em células de knock-down BRCA1 quando comparada com células tratadas com ARNsi de controlo. Em seguida, foi realizado o mesmo ensaio FST com os clones de células estáveis ​​BRCA1 nas células SKOV3 como descrito anteriormente. BRCA1-SKOV3 clone # 19 células mostraram um aumento da secreção de FST do neo clone # 3, como esperado (Figura 4D). Além disso, também investigou os níveis secretados de FST nas linhas estáveis ​​seguinte sub-regulação de BRCA1 na mesma. A sub-regulação de BRCA1 em qualquer clone # 3 Neo (Figura 4E) ou BRCA1-SKOV3 clone # 19 (Figura 4F) significativamente (P 0,05) inibiu a secreção de FST em meio de cultura de células em comparação com os respectivos controlos. níveis de expressão da proteína BRCA1 em todas as amostras acima são mostrados na Figura 4G. Os dados obtidos a partir deste ensaio quantitativo FST sugere que a indução de níveis de BRCA1 celulares por sua vez, estimula a secreção extracelular FST em células de cancro do ovário humano.

(A) Curva padrão foi gerado com FST humana purificada, tal como indicado nos Métodos de ” , que foi utilizado para quantificar as concentrações FST desconhecidos nas amostras indicadas. células SKOV3 foram transfectadas como antes, quer por sobre-expressão de BRCA1 (B) ou para subexpressão BRCA1 (C), e ensaios de FST (ver métodos) foram realizadas com o meio de cultura diluído. O mesmo ensaio foi realizado com FST os clones estáveis ​​como indicado (D), bem como com as células estáveis ​​em que a expressão de BRCA1 foi derrubado por BRCA1 de siARN (E-F). As barras de erro são SEMs. * P 0,05 (relativo a cada controlo).