Abstract
Mitocondrial-núcleo conversas cruzadas e regulação retrógrada mitocondrial pode desempenhar um papel significativo nas propriedades celulares. sistemas cybrid Transmitochondrial (cybrids) são uma excelente ferramenta para estudar os efeitos específicos de mitocôndrias alterados sob um fundo nuclear definido. A maioria dos estudos que utilizaram o modelo cíbrido focado no significado de variações específicas no DNA mitocondrial na função ou tumorais propriedades mitocondriais. No entanto, a maioria destas variantes são polimorfismos benigna sem significado funcional conhecido. De um objectivo de corrigir defeitos mitocondriais em células cancerosas e para estabelecer as mitocôndrias como um alvo potencial droga anticâncer, a compreensão do papel das mitocôndrias funcionais em reverter propriedades oncogênicas sob um fundo nuclear câncer é muito importante. Aqui foi analisada a reversão de propriedades oncogénicas potencial de uma linha de células altamente metastáticas com a introdução de mitocôndrias não-cancerosas. Cybrids foram estabelecidas por fusão das mitocôndrias ADN empobrecido células TK 143B ρ0 a partir de uma linha celular de osteossarcoma agressiva com mitocôndrias a partir de linha de células epiteliais da mama benigna células MCF10A, linha celular de cancro da mama metastático moderadamente MDA-MB-468 e 143B. Apesar de o fundo nuclear canceroso uniforme, como observado com as células doadoras mitocôndrias, cybrids com mitocôndrias benignos mostrou elevadas propriedades funcionais mitocondriais, incluindo o aumento da síntese de ATP, o consumo de oxigénio e actividade da cadeia respiratória, em comparação com cybrids com mitocôndrias cancerosas. Curiosamente, as mitocôndrias benignos poderia reverter diferentes características oncogénicas de 143B TK
– celular, incluindo a proliferação celular, a viabilidade sob condição hipóxica, propriedades anti-apoptóticos, resistência a drogas anti-cancro, invasão, e a formação de colónias em agar mole, e
in vivo
o crescimento do tumor em ratinhos nus. microarrays análise sugeriu que várias vias oncogênicas observados em cybrids com mitocôndrias cancerosas são inibidas em cybrids com mitocôndrias não-cancerosas. Estes resultados sugerem a regulação oncogênico crítico em conversas cruzadas mitocondrial-nuclear e destaques retificação propriedades funcionais mitocondriais como um alvo promissor na terapia do cancro
Citation:. Kaipparettu BA, Ma Y, Parque JH, Lee TL, Zhang Y, Yotnda P, et al. (2013) Crosstalk de não-cancerosas mitocôndrias pode inibir Propriedades Tumor de células metastáticas suprimindo Oncogênicos Pathways. PLoS ONE 8 (5): e61747. doi: 10.1371 /journal.pone.0061747
editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Outubro, 2012; Aceito: 11 de março de 2013; Publicado em: 09 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Kaipparettu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo DOD (W81XWH-11-1-0292), National Institutes of /Instituto de Saúde Nacional do Câncer (NIH /NCI) (U54-CA149196 Projeto piloto) e DLD Cancer Center Projeto piloto para a B. Kaipparettu e NIH /NCI ( R01 CA-100023) subvenção para L. Wong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
as células cancerosas se adaptar a condições hipóxicas durante o crescimento celular tumoral progressivo, deslocando a carga do metabolismo energético a partir de fosforilação oxidativa a glicólise, referido como o efeito Warburg [1]. A regulação da expressão gênica nuclear pelo genoma mitocondrial, através de ‘mitocôndrias sinalização retrógrada’, permite que as organelas coordenar a sua função com o núcleo. As células tumorais continuam a utilizar a glicólise como a principal fonte de energia, mesmo em cultura sob condições de normóxia [2], sugerindo que possíveis alterações genéticas estáveis ou epigenética ter ocorrido em células cancerosas. Além disso, as mitocôndrias câncer sem alterações genéticas detectáveis podem transmitir sinais oncogênicos para o núcleo e iniciar regulação retrógrada mitocondrial levando à comunicação bidirecional entre os dois genomas [3].
A fim de investigar a contribuição mitocondrial específico para tumor propriedades, devem ser excluídos do efeito de genes nucleares. sistema cybrid Transmitochondrial é uma excelente abordagem para atingir esse objetivo [4] – [9]. Vários estudos utilizaram esta tecnologia emocionante principalmente para mostrar o significado funcional e patogênica de mutações ou variantes específicas do DNA mitocondrial (mtDNA) [5], [10]. O mtDNA é conhecido por sofrer mutações com frequência em uma variedade de cânceres, mas a maioria destas alterações do mtDNA, com exceção de alguns, são, sem qualquer relevância funcional conhecido e pode simplesmente refletir a instabilidade genômica de células tumorais. Mesmo sem a presença de mutações de ADNmt conhecidos deletérios, estudos têm demonstrado que as mitocôndrias metastáticos pode melhorar a propriedade do tumor de uma célula de cancro metastático e torná-los [9], [11]. No entanto, de um ponto de vista terapêutico, a fim de orientar mitocôndrias doentes, é importante saber se mitocôndrias funcionais não-cancerosas pode inverter a propriedade oncogénica de células metastáticas. Se assim for, visando mitocôndrias doentes ou retificar o defeito funcional das mitocôndrias normais podem fornecer uma área druggable crítico para a terapia do cancro. Neste estudo, nós pedimos uma pergunta interessante se mitocôndrias não-cancerosas pode reverter as propriedades oncogênicas de uma célula de câncer agressivo. Sob um fundo nuclear canceroso definido, comparamos mitocôndrias de células da mama, moderadamente metastáticos não-cancerosas em um fundo nuclear altamente metastático com mitocôndrias de células de câncer muito agressivo como controle. Mesmo sob o mesmo fundo nuclear, mitocôndrias de células não-cancerosas poderia inibir várias vias oncogénicos, inverter as propriedades oncogénicas e melhorar a resposta terapêutica das células cancerosas. Isso destaca a importância das mitocôndrias como um regulador crítico da propriedade câncer de celular e um alvo potencial para terapia antineoplásica.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética em Experimentação Animal
Todos os animais procedimentos foram aprovados pelo Institutional animal Care e do Comitê Use no Baylor College of Medicine e realizada de acordo com as diretrizes do NIH para o tratamento ético dos animais.
cybrids
imortalizadas células MCF10A epiteliais mamárias não-cancerosas , cancro da mama MDA-MB-468 e células metastáticas derivadas de osteossarcoma 143B TK
– células (143B) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Um protocolo detalhado para a geração de
ρ
0
células e cybrids foi recentemente publicado [3], [6], [8]. Resumidamente, o mtDNA empobrecido 143B ρ
0 células foram utilizadas como dador nuclear. Para gerar cybrids, células doadoras mitocondriais (MCF10A, MDA-MB-468 e 143B tk-) foram enucleados por tratamento durante a noite actinomicina-D e fundido com o 143B ρ
0 células, utilizando 45% de polietileno glicol (MW 1450; Sigma Cat P-5402) durante 60 segundos. Um dia após a fusão, as células foram cultivadas em meio de selecção com bromodesoxiuridina (BrdU), mas sem uridina [3], [12]. 143B controle não fundido ρ
0 células não poderia sobreviver sem células de uridina e doadores mitocôndrias foram mortos por BrdU. Cybrids contendo mitocôndrias derivadas de células MCF10A, MDA-MB-468 e 143B com 143B ρ
0 células como fundo nuclear são nomeados como 10A /143B, 468 /143B e 143B /143B cybrids, respectivamente.
quantificação e Análise de Sequência de mtDNA e Validação de Nuclear DNA
DNA genômico total foi extraído por fenol método /clorofórmio e o genoma mitocondrial de 16,6 kb foi amplificado por 24 pares de primers que se sobrepõem como publicado antes [13] – [ ,,,0],15]. qPCR foi utilizado para quantificar número de cópias do mtDNA para a verificação do
ρ
0
condição e para quantificar o conteúdo mtDNA nas cybrids de acordo com procedimentos publicados [16], [17]. Somente clones cybrid contendo mtDNA comparáveis número de cópias foram utilizados para experimentos. mtDNA genoma inteiro e análise da sequência de DNA nuclear de referência foi realizada utilizando Big Dye terminator (versão 3.1) kit reagente ciclo de sequenciação em um ABI 3730XL DNA Analyzer (Foster City, CA). Os resultados das sequências de ADN foram comparadas com a sequência publicada de referência a partir de Cambridge https://www.mitomap.org. fonte nuclear de cybrids foi confirmada por genotipagem.
Espécie de oxigénio reactivos (ROS) Produção
As células foram semeadas e cultivadas em meio glucose ou galactose durante 24 horas em placas de 24 poços (2 × 10
4 por poço). produção de ROS foi medida 30 minutos após o carregamento com 5 mmol /L 2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) [18]. Após lavagem com tampão de PBS, as células foram tripsinizadas e suspensas em tampão PBS. As medições de fluorescência a comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, foram realizadas com leitor de microplacas Infinito M200® um Tecan (Mannedorf, Suíça).
ATP síntese