Abstract

Background

As células T são conhecidos a participar na resposta às células tumorais e reagir com a toxicidade e a libertação de citoquinas. Ao mesmo tempo tumores estabelecidos mecanismos versáteis para silenciar as respostas imunes. A interação está longe de ser completamente compreendido. Neste estudo mostramos os contactos entre as células tumorais e linfócitos que revelem características inovadoras na interacção de células T e células cancerosas de uma maneira não descrita anteriormente.

Métodos /Apreciação

As experiências são baseadas no utilização de um corante fluorescente que ocorre hidrófilo livre no citosol e, portanto, a transferência de citosol fluorescente de uma célula para a outra pode ser observada utilizando citometria de fluxo. As células de tumor de linhas de células de origem diferente ou células de carcinoma hepatocelular primário (HCC) foram incubados com linfócitos de humano e ratinhos. Esta exposição provocou uma absorção dependente de contacto citosol derivada do tumor por linfócitos – mesmo em CD4

+ células T e células B murinas – o que não poderia ser detectado após a incubação de linfócitos com células saudáveis. A interação foi um direto, não requerendo a presença de células acessórias, mas independente da citotoxicidade e engajamento TCR.

Microscopia Eletrônica divulgado 100-200nm grandes lacunas nas membranas celulares das células conectadas que separavam viável e revelou surpreendente resultado. Enquanto os linfócitos foram induzidas a proliferar de uma forma de longo prazo, as células tumorais foram submetidos a uma interrupção temporária da divisão celular. O

in vitro

resultados foram confirmados

in vivo

utilizando um modelo murino leucemia linfoblástica aguda (ALL). A prisão de proliferação do tumor resultou em uma sobrevivência prolongada significativo de camundongos desafiados.

Conclusões

Os contactos célula-célula relatados revelar novas características isto é, o que permite fluxo de citosol entre as células, incluindo as proteínas biologicamente activas que influenciam o ciclo celular e comportamento biológico das células receptoras. Isso adiciona um aspecto completamente novo no tumor imunologia induzido

Citation:. Hardtke-Wolenski M, Kraus L, Schmetz C, Trautewig B, Noyan F, Vondran FWR, et al. (2013) Troca de citosólico conteúdo entre as células T e células tumorais ativa as células T CD4 e Crescimento Cancer Impede. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10.1371 /journal.pone.0078558

editor: R. Lee Mosley, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de abril, 2013; Aceito: 19 de setembro de 2013; Publicação: 24 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Novartis Pharma GmbH ea concessão HILF da Faculdade de Medicina de Hannover. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este trabalho é financiado pela concessão HILF da Faculdade de Medicina de Hannover e Novartis Pharma. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer é como esconde-esconde entre as células tumorais e a resposta imune . O sistema imunitário quando desafiados por cancro, no entanto, é confrontado com o problema de que as células que expressam MHC de auto-precisa ser controlada na sua malignidade. No entanto, o interruptor de células normais em células tumorais é acompanhada pela expressão de péptidos específicos de tumor capaz de activar células T (revisto por [1]). A maior parte desses péptidos descendente de proteínas não produzidas exclusivamente por células tumorais, mas modificados na sua estrutura. A resposta de células T mantém o tumor em um estado estacionário ou dormente [2,3]. Tem sido uma hipótese aceite que a maioria das respostas anti-tumorais são mediadas por CD8

+ células T e CD4

+ células T são limitados quer para ajudar CD8

+ células T para citotoxicidade eficaz [4, 5] ou células dendríticas primos (DC) para aumentar a resposta de CD8

+ células T [6,7].

Em contraste com este dogma relatórios recentes revelaram participação de CD4

células + T células efetoras como poderosos com capacidade de ação direta contra as células tumorais que conduzem a regressão do tumor [8-10]. Demonstrou-se que a transferência de tumor-antigene específico de CD4

+ células T em desafiados mas ratinhos imunodeficientes pode causar a regressão completa do tumor, sem a necessidade de CD8

+ célula T, a ajuda de células de células ou B NK [10 ]. No entanto, a presunção para todos descritos poderosas respostas de células T é ou uma especificidade transgénicos de receptor de células T (TCR) contra antigénios tumorais ou isolamento e expansão de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) conhecidos.

Assim, a activação da resposta imunitária pode ser observada, mas que no decurso do crescimento do tumor de uma edição da resposta imunológica ocorrer. Isto inclui de equilíbrio e finalmente fuga imune de células de tumor por indução de resistência [11]. Esta evasão imune eficiente de tumores é devido à criação de um microambiente que atrai as células derivadas de mielóides supressoras e células T reguladoras. Além disso, a composição de citoquinas e de quimioquinas, bem como a expressão de certos ligandos sobre as células tumorais pode converter as células efectoras para células reguladoras ou levá-los para a anergia e apoptose (revisto por [11,12]). O conhecimento dessa frente e para trás do sistema imunológico e câncer

in vivo

ainda está cheio de lacunas, assim, cada interação adicional de células T com células tumorais ajuda a entender a resposta e mecanismos de escape.

neste estudo, nós reportamos de uma interação até agora não descrita entre as células tumorais e células T, tanto CD4

+ e CD8

+ T. Isto inclui a formação de contato com diferentes características da sinapse imunológica. A formação da sinapse tem sido extensivamente investigada e envolve diversas fases, incluindo pseudopodia, a formação de microtúbulos e a co-localização de mitocôndria e retículo endoplasmático [13]. Todos esses atributos estão faltando nos contactos que observamos. Em vez disso os contactos que levam à troca citosol entre linfócitos e células tumorais

in vitro

e

in vivo

induzir uma pausa na proliferação das células tumorais. Em contraste com relatos anteriores estes contactos ocorrer independentemente da presença de células apresentadoras de antigénio. Como consequência dessas interações, a divisão celular T em curso é induzida em linfócitos que incorporam derivados do tumor citosol. Este fenómeno específico é um novo aspecto da interação entre o sistema imune com as células tumorais.

Resultados

Contato formação entre as células tumorais e células T induzir o fluxo de citosol não associada com cytotoxocicity

Uma breve nota: As experiências apresentadas na Figura 1 mostra a interação de PBMC humanos com a linha de leucemia de células B porcina L23. Inicialmente, perguntado se células desta linha celular porcina são alvos para as células NK e T citotóxicos humanos e destina-se a analisar presente na citometria de fluxo como já anteriormente realizados usando parasitas como alvos para as células NK [14,15]. Como uma coincidência encontramos a adaptação de fluorescência por células T após exposição a células L23. Descobriu-se ainda que este efeito não é um fenómeno específico xenogénica mas pode ser observado com linfócitos humanos e murinos e vários tumores de origem diferente. No entanto, este modelo revelou os resultados mais significativos e, portanto, é mais adequado para refletir essa nova interação entre células T e células tumorais. Estamos cientes do sistema artificial desde PBMC humanos e células tumorais suína não são susceptíveis de ser encontrados juntos em condições naturais. Assim, nós limitamos os dados usando células de suíno a Figura 1 e, posteriormente, transferido para um modelo de rato.

(A) 2×10

6 PBMC humanos ou purificada CD4

+ células T foram incubados com 2×10

6 CMFDA-L23 marcado células durante 4 h, subsequentemente coradas para CD3, CD4 e CD8 e analisadas em citometria de fluxo, respectivamente. A exposição dos linfócitos às células L23 levou a uma inclusão de fluorescência em numerosas células T.

(B) Síntese de quatro experiências independentes realizadas como descrito acima. A frequência de células T fluorescente verde está relacionado com a população de grandes quantidades de PBMCs.

(C) PBMCs foram pré-incubados com 5 mM de cloreto de estrôncio para induzir a desgranulação antes da exposição a células L23. Adpation da fluorescência foi avaliada em CD4

+ e CD8

+ células T.

(D) 2×10

6 células T purificadas e 2×10

6 L23 foram incubadas durante 4 h em conjunto ou separados por transwells (TW), as células marcadas L23 na parte inferior de uma placa de fundo redondo de 96well e células T colocado nos transwells.

+ células T

(e) purificada foram incubadas com CD4 células L23 para 4 h, fixas e preparadas para microscopia eletrônica (eM). Digitalização (i) e EM transmissão (II-IV) revelou contactos intensos. Na transmissão de fluxo de EM de citosol foi visualizado pelo citosol de electrões denso de linfócitos que distribuído a partir do local de contactos na célula tumoral (setas em (ii) e (iii)). No mais alto ampliação lacunas nas membranas celulares pode ser detectado (setas em IV). As lacunas comprimento dehisced até 200nm permitindo livre fluxo de componentes citosol e solúveis, mas não das estruturas celulares, por exemplo, mitocôndria. No entanto, a agregação de mitocôndrias no domínio da formação de contacto pode ser uma indicação de processos que consomem energia.

células (F) CD4

+ T foram classificados após incubação com CMFDA-rotulados da luciferase-transgeneic L23 células em células T-verdes fluorescentes e não fluorescentes. 5×10

4 separados células T foram subsequentemente incubadas em meio suplementado com 100 ug /ml em luciferina 96well placas de fundo redondo. A luminescência foi determinada após 30 min de incubação utilizando análise IVIS. 5×10

4 transgeneic L23 células serviu como controle da intensidade de luminescência.

Os resultados são apresentados como imagens representativas e dispersam-gramas ou resumindo 4 experimentos independentes como média ± SEM.

para a marcação fluorescente de células foi utilizado CellTracker verde (diacetato de 5-cloro-methylfluorescin [CMFDA]). CMFDA inicialmente é uma molécula não-fluorescente capaz de atravessar a membrana celular. Em células viáveis ​​CMFDA é clivada em forma fluorescente, fortemente hidrofílico construção de uma bainha de água volumoso. Isto evita a sua libertação através da membrana celular intacta de células viáveis. CMFDA pode ser usado como um marcador para a viabilidade uma vez que em caso de lise citotóxica, células marcadas tornar-se não-fluorescente por causa da perda de CMFDA contendo citosol [14]. Uma análise em citometria de fluxo é viável se as células efetoras e de destino diferem marcadamente em tamanho e, portanto, podem ser distinguidos nas declarações prospectivas, sideward-dispersão (Figura S1). No entanto, em vez de perda de fluorescência foi observada uma absorção de fluorescência por linfócitos após a co-cultura de células do tumor com as PBMC indicando uma transferência de moléculas CMFDA de uma célula para a outra (Figura 1A). A adaptação de fluorescência foi quase exclusivamente restrito a células T uma vez que apenas uma fracção muito pequena de CD3

– células tornou-se fluorescente. É de notar que a interacção de células T observada com células tumorais necessária não há células espectadoras, tal como exemplificado pela exposição das células T CD4 altamente purificado

+ células T a células L23. Também esta configuração induzida numa proporção acentuada de células verdes fluorescentes (Figura 1A).

Como o dot blot mostra, essa interação pertencia a um número considerável de células T: Em média 20% do CD4

+ e 7% dos CD8

+ T células entre PBMC em massa tornou-se verde fluorescente (Figura 1B). Este fenómeno pode ser explicado apenas pela absorção de citosol contendo as moléculas CMFDA de uma célula para a outra. É notável que as células NK não revelou sinais de recolha de tumor derivado fluorescente citosol embora eles exibem uma actividade citotóxica forte contra as células de tumor L23 (Figura S2). No entanto, a citotoxicidade parece ser uma explicação razoável para o efeito observado. Foi testada a possibilidade de citotoxicidade sendo responsável pela troca de citosol por tratamento de PBMCs com cloreto de estrôncio (SrCl

2), um reagente que induz a exocitose de grânulos líticos [16]. Assim, o tratamento com SrCl

2 deixa as células citotóxicas ineficaz. No entanto, os linfócitos ainda revelou uma absorção de CMFDA (Figura 1C). Isso explica tanto CD4

+ e CD8

células T +, que é uma indicação de que a citotoxicidade não é o agente para a troca de citosol. Com efeito, embora apenas ligeiramente observou-se um aumento de adaptação fluorescente após SrCl

2 tratamento em ambas as populações de células T. No entanto, a formação de contato era obrigatória para o efeito observado. As células T e as células de tumor foram incubadas quer em co-cultura ou separados por transwells. células T fluorescente verde só podia ser detectado depois da exposição directa às células tumorais, mas não em culturas de Transwell (Figura 1D).

Lacunas nas membranas celulares das células tumorais e linfócitos naive permitir a transferência de citoplasma incluindo moléculas de alto peso molecular e induzir a proliferação de células T

Nós ainda mais focado na interação de CD4

+ células T com células de tumor por visualização da formação de contacto. microscopia eletrônica de varredura (SEM) revelou a natureza intensa dos contactos celulares que levam à polarização dos parceiros tumor de células de linfócitos interagem (Figura 1E i). Além disso, a microscopia electrónica de transmissão (TEM) revelou, mesmo a baixa ampliação, um fluxo de electrões citosol denso a partir da célula T na célula de tumor que surgiu com a maior ampliação para ser activada por lacunas na membrana da célula de ambos os parceiros (Figura 1E II-IV). Estas lacunas áreas entre 100-200nm estendida e, portanto, deve permitir a transferência de mais do que apenas componentes de peso molecular baixo do citosol, mas também moléculas com funções enzimáticas de peso molecular elevado. Em consequência, a passagem da proteína de 30kDa de luciferase foi avaliada por meio de co-cultura de PBMC com luciferase transduzidas retrovirais expressando células L23. L23 células transduzidas foram marcadas com células CMFDA e T foram separadas após a exposição a células tumorais que distinguem o verde-fluorescente do não-fluorescente CD4

+ células T. As células T purificadas foram subsequentemente incubadas com luciferina para avaliar a actividade enzimática. Com efeito, as células T com a absorção de CMFDA revelou luminescência ao passo que as células T não fluorescentes foram negativos para a actividade da luciferase (Figura 1F). Isto mostrou claramente uma transferência de citosol associada com uma troca de moléculas que sofreram actividade biológica na célula receptora. Assim, é do interesse de seguir as consequências de contactos para os parceiros se os componentes citosólicos manter a sua função biológica. Basicamente nós fizemos isso no modelo do rato

in vitro

e

in vivo

mas encontrou apoio dados também com linfócitos humanos e células tumorais suína.

Nós separados fluorescente e não fluorescente CD4

+ células T após exposição a células tumorais marcadas com CMFDA e células isoladas foram cultivadas sem estimulação adicional em meio durante 5 dias. Encontramos proliferação acentuada dessas células T com incorporação de derivados tumor citosol (Figura S3). a expansão das células T pode ser induzida pelo receptor de células T dependente e vias independentes. Tem sido relatado que células T internalizar o TCR após exposição ao anticorpo anti-CD3 monoclonal (mAb) clone OKT3 sob certas condições [17]. Assim, aplicou-se o protocolo nas nossas experiências e verificou o desaparecimento de TCR da superfície celular de células T. No entanto, a absorção da fluorescência não foi abolida pelo tratamento. Além disso, o bloqueio de moléculas de MHC suína II com mAb MSA-3 colocaram o resultado da transferência de citosol entre linfócitos e células tumorais praticamente não afectadas. Por último, mas não menos importante, para a absorção de citosol os linfócitos não têm de ser pré-ativado. células naive T revelou a capacidade de se submeter os contactos com células de tumor, pelo menos, no mesmo grau como IL-2 células activadas ou RADIOGRAFADA L23 pré-expostos T (todos os dados mostrados na Figura S3).

Troca de citosol não se restringe a uma determinada espécie e tipo de células tumorais

comutadas para o modelo de ratinho, foi utilizada uma linha celular de tumor altamente agressivo BM185, isolado a partir de ratinhos BALB /c sofrem da ALL [18], para validar a universalidade dos contatos observadas entre as células T e células tumorais. A expansão no modelo do rato oferece adicionalmente a possibilidade de

in vivo

verificação.

microscopia

Electron e citometria de fluxo análise confirmou os contactos e transferência de citoplasma entre as células T de murino e células BM185 (Figura 2A e Figura S4). É de notar, em contraste com CMSP humanas, dentre os esplenócitos de murideo uma população a granel bem detectável de CD3

– células revelaram a capacidade de interagir com as células tumorais, resultando em absorção citosol. coloração adicionais de esplenócitos com CD19 identificada a população de células B por gating em CD3

– células que foram quase completamente CD19

+ (Figura 2B), ao passo que de acordo com os resultados usando células humanas, células NK não eram envolvido na transferência de citosol (dados não mostrados).

(a) 2×10

6 esplenócitos incubados com 2×10

6 células BM185 CMFDA-marcadas durante 4 horas e analisadas por absorção de fluorescência por células T. Da mesma forma que as PBMCs humanos modelo do rato revelou verde-fluorescente CD4

+ e CD8

células + T. Além disso, uma população verde-fluorescente bem detectável que se estende a população de células T pode ser observado dentro dos esplenócitos.

(B) Coloração de esplenócitos com CD3 e CD19 após a exposição a células de tumor identificou a população de células não-T capaz de absorção citosol como células B.

(C) Síntese de quatro experiências independentes de incubação de esplenócitos com células de diferentes linhas celulares. células BNL não são tumor derivado enquanto as outras linhas são células tumorais.

(D) Análise de expressão de MHC II das respectivas linhas celulares BM185, KLN-205 e BNL CL.2. O nível de expressão não se correlacionou com o resultado da transferência de citoplasma

(E) Em contraste com

+ células não afetadas T CD4 (CMFDA

-).,

células CD4 + T revelando uma absorção de tumor citosol derivada (CMFDA

+) mostrou sinais de activação de acordo com o aumento da expressão de CD25 e marcador ativação precoce CD69 enquanto CD62L diminuiu ligeiramente. As células foram incubadas como acima descrito (A), com subsequente coloração de células T CD4 e marcadores de activação. O padrão de activação era diferente para a estimulação com 2 ug /ml de ConA.

(F) Análise Proliferação de 1×10

4 células T purificadas revelando captação CMFDA após 4 h de exposição de esplenócitos para células BM185 marcados. Para o controle purificado CD4

células + T de camundongos normais foram cultivadas em meio como ele foi realizado com células T ordenadas por 4 dias e mais 16 h com

timidina 3H antes szintilization.

Os resultados são apresentados como dispersão-gramas representativas ou resumindo pelo menos 3 experiências independentes como média ± SEM.

Em geral, as células T de murino tinha uma tendência menos acentuada para interferir com tumor células em comparação com as células T humanas. Mesmo com L23 células apenas uma média de 10% CD4

+ T células tornou-se verde fluorescente e isso juntamente com um desvio padrão muito elevado. No entanto as células L23 induziu o maior captação de CMFDA (dados não mostrados). Além disso, outras linhas de células de murino incluindo as KLN-205 células de carcinoma do pulmão, células do fígado BNL CL.2 embrionárias, células mastcytoma P815, células de mieloma J558L célula B, células tumorais C1498 mielóide e as linhas de células de tumor no fígado HEPA e 1C1C7 HepA- 1-6 foram testados. Com a excepção das células BNL, variável, mas bem detectável CMFDA transferência para as diferentes células tumorais foi observado (Figura 2C). Curiosamente, apesar de dividir permanentemente, células BNL CL.2 não são consideradas como células de tumor clássica [19]. A resistência das células CL.2 BNL, oferecido também para o modelo de rato a oportunidade para validar a independência do tumor e especificidade de TCR do efeito. Avaliaram-se os níveis de expressão de MHC II sobre as diferentes linhas de células. Descobriu-se que BM185 e BNL CL.2 expressa elevado nível de MHC II, enquanto as células KLN-205 foram completamente negativo para MHC II (Figura 2D). Assim, a interacção TCR /MHC parece não ser obrigatória para a troca de citosol. Isto também é realçada pela transferência de citosol observada entre células B e células tumorais. Além disso, foram realizadas experiências utilizando hemaglutinina (HA) e células BM185 -transduced comparou o resultado de transferência de citossol após exposição a de tipo selvagem (wt) de BALB /c e ratinhos transgénicos 6,5. O rato 6.5 tem uma população característica de cerca de 20% de células T CD4 + que expressam um TCR específico da HA. Ambas as estirpes revelou uma tendência de aumento da frequência de células que mostram troca de citossol após exposição ao BM185-HA, em comparação com células BM185. No entanto, os esplenócitos derivados de 6,5 ratinhos não mostraram aumento da frequência de células que mostram troca de citosol com as células BM185 HA-transgénicos (Figura S5).

No entanto, após a exposição a células de tumor de células T mostraram os primeiros sinais de activação. A incubação dos esplenócitos com BM185 resultou na sobre-regulação do CD25 marcadores de activação e CD69 e alteração marginal de expressão de CD62L em células T revelando uma absorção de citosol derivada do tumor enquanto que as células T sem adaptação de fluorescência mostraram níveis de marcadores de activação de expressão comparáveis ​​aos médias linfócitos incubados (Figura 2E). Os níveis detectados de CD25 em meio incubado e CMFDA

– células T foi devido a expressão de CD25 constitutiva em células T reguladoras, assim, os níveis de aumento ao longo deste fundo eram sinais de ativação. A activação de células T avaliada é combinada com a proliferação dos linfócitos, assim como pode ser observado com as células T humanas que interagem com células L23 (Figura 2F).

transferência detectáveis ​​de citosol in vivo

A verificação da transferência de citoplasma

in vivo

é de grande interesse para excluir a possibilidade de que a troca citosol é apenas devido a um

in vitro

artefato. Portanto, as células BM185 CMFDA-marcadas foram injectados por via intravenosa (i.v.) em ratinhos BALB /c e os ratinhos foram sacrificados 6 horas depois. Subsequentemente, baço, nódulos linfáticos e medula óssea foram verificadas para as células BM185 mas apenas no baço pode ser detectado numerosas células tumorais (dados não mostrados) que foi combinado com a aparência de verde-fluorescente de CD4

+ T células (Figura 3A) . Em linha com o

in vitro

resultados, também

in vivo

linfócitos com a afinidade de captação citosol Pode ser encontrado nas populações de CD8

+ T e células B (Figura 3B ).

(A) 1×10

7 CMFDA marcado BM185 foram injetados por via intravenosa. 6 horas mais tarde os ratinhos foram sacrificados e o baço, nódulos linfáticos e medula óssea foi homogeneizada. 5×10

7 células foram coradas para CD4 e contados em citometria de fluxo e a proporção de linfócitos verdes fluorescentes foi avaliado.

(B) Avaliação do fenótipo de esplenócitos verde-fluorescente 6 h após i.v. aplicação de 1×10

7 CMFDA marcado BM185. Além de CD4

+ e CD8

+ células T, também

em

vivo

células B (B220

+ células) revelou absorção CMFDA.

Os resultados são apresentados como dispersão-gramas representativos de 3 experiências independentes.

As células tumorais deixam de proliferar após a absorção de citosol derivado de células T que conduz à sobrevivência prolongada de ratos

O fluxo de citosol não é uma estrada um caminho, mas pode ser observado em ambas as direcções. Assim, as células T não apenas tornou-se verde-fluorescente após a exposição a células de tumor CMFDA-rotulados mas também uma proporção de células de tumor tornou-se verde-fluorescente após incubação com linfócitos CMFDA-marcados (Figura 4A). Para acompanhar a transferência de células de linfócitos derivada de citosol BM185 foram marcadas com CellVue Vinho, um corante que é incorporada em regiões de membranas lipídicas com a observação destacada do fabricante de transferência não específica mínima entre as células. Ao expor as células tumorais marcadas com CellVue de linfócitos, foram capazes de detectar uma fracção positiva com fluorescência induzida CellVue em CD4

+ células T, indicando uma transferência de partes da membrana celular das células tumorais para a superfície de linfócitos (Figura 4B ). Este é convincente validação da impressão de a fusão das membranas celulares, como demonstrado por MET (Figura 2 e Figura S4). célula BM185

(A) foram marcadas com CellVue para distinguir a população de células tumorais a partir de linfócitos CMFDA-rotulados. As células de tumor e células de baço foram incubadas em número igual, durante 4 h e a absorção de CMFDA foi avaliada por citometria de fluxo. . Mais adiante, BM185 foram separados por separação de células em células não fluorescentes e fluorescentes

(B) Avaliação de transferência de componentes da membrana de CellVue marcado BM185 a linfócitos após a exposição de células numa razão 1: 1 para 4 h. CellVue incorpora em regiões lipídicas das membranas celulares.

(C)

3H timidina de células expostas a BM185 esplenócitos CMFDA-marcados a partir de ratinhos BALB /c e posteriormente separadas por triagem FACS de células em células de tumor que trocaram citosol com linfócitos do rato (CMFDA

+) ou aqueles que permaneceram inalteradas (CMFDA

-). As células foram cultivadas durante 3 dias em placas de 96 poços e 16 h depois da adição de timidina radioactiva.

(D) Curva de sobrevida de camundongos BALB /c após i.v. injecção de 1×10

4 células BM185 (5 ratinhos por grupo /experimento, a curva de sobrevivência representa duas experiências independentes, assim, n = 10), com ou sem incorporação de CMFDA após a exposição ao esplenócitos murinos CMFDA-rotulados. O curso da BM185 provocou a leucemia é altamente reprodutível. A sobrevivência das células BM185, sem a absorção do derivado de linfócitos citosol corresponde completamente a este declínio conhecida de viablitiy. Em contraste, os murganhos injectados com esplenócitos BM185 incorporada citosol derivado sobreviveram significativamente mais longa (p ≤ 0,0042).

Os resultados são apresentados como dispersão-gramas representativas ou resumindo 2-4 experimentos independentes como média ± SEM.

Nós separados células BM185 em fluorescente e não fluorescente após a exposição ao esplenócitos de murino . As células tumorais isoladas foram cultivadas durante 4 dias, com posterior avaliação do

incorporação de 3H-timidina. Surpreendentemente, uma diminuição drástica da proliferação de células BM185 Depois da absorção de linfócitos derivada citosol pode ser medida (Figura 4C). Esta foi apenas uma interrupção temporária do ciclo celular. 7 dias de cultura revelou bem proliferação detectável mesmo das células tumorais que foram submetidos a transferência de citosol (dados não mostrados).

A ruptura da divisão das células tumorais pode ter consequências possíveis para a sobrevida de camundongos BALB /c. De nota, as células BM185 são altamente maligno causando um curso agressivo de todos. Mesmo uma dose baixa de 10

4 células leva à morte dentro de 20 dias. BM185 células que apareceram não fluorescente após a exposição ao esplenócitos revelou um curso altamente reprodutível de mortalidade. Em contraste, os murganhos injectados com BM185, que incluiu citosol a partir de esplenócitos sobreviveram significativamente (p ≤ 0,0042) mais e 20% dos ratos (dois em cada dez) mesmo sobreviveram ao desafio com células tumorais (Figura 4D).

células T trocar citosol especificamente com células tumorais, mas não com células

saudável

A questão permanece: Será esta uma interação exclusiva de células T com células tumorais? E se assim for: é o efeito restrito a linhas de células tumorais ou fazer células de tumor primário também induzem esse fenômeno? Esta última questão é de interesse uma vez que a transferência de citosol com células de tumor primário confirmaria importância clínica especial quando se considera que o sistema imunitário é activado pelos contactos de células com células de tumor e do tumor revela uma paragem temporária da divisão celular.

como realizada com os esplenócitos de murideo, as experiências foram repetidas pelo expor diferentes linhas de células de tumor para as PBMC humanos. Nós escolhemos células BM185 como uma linha adicional xenogénico de tumor, células de linfoma de células B humanas e a linha de células de tumor no fígado HepG2. Em comparação com células L23 o efeito foi menos pronunciado em todas as linhas celulares testadas. No entanto, uma absorção de clara de citosol por CD4

+ células T após co-cultura com todas as linhas de células de tumor pode ser observado (Figura 5A). Interessantemente, as células BM185 também induzida dentro PBMCs humanos uma adaptação de fluorescência em 5% das células T CD4

+ células T a partir de PBMC grandes quantidades, assim como com esplenócitos singeneicos murinos. Assim, a troca de citosol distinta com células L23 não pode ser explicada apenas pela configuração xenogénico.

(a) Exposição de PBMC para diferentes linhas de células de tumor marcadas com CMFDA incluindo o porcina xenogénico L23 células e células BM185 murino, bem como a T5.1 humana de linfoma de células B e Laz, linha de células T de Jurkat e o células de hepatocarcinoma HepG2. Com todas as linhas celulares tumorais testadas uma transferência de citosol foi avaliada. Em contraste, as PBMC humanas expostas a PBMC marcado com CMFDA saudáveis ​​do mesmo dador de sangue (singeneicos) ou doadores de sangue diferentes (alogénico) não mostrou qualquer adaptação de fluorescência.

(B) hepatócitos primários derivados a partir de tecido saudável ou HCC e células HepG2 foram cultivadas durante 3 dias na câmara diapositivos para se obter uma monocamada de células soltas. Os hepatócitos foram marcadas com CMFDA e incubou-se com 5×10

5 PBMC durante 4 h. As células foram fixadas e ar seco com posterior coloração para CD4 (vermelho, apenas HCC e HepG2) eo núcleo (azul). A microscopia revelou uma absorção de fluorescência verde por linfócitos somente se expostos a células tumorais. coloração adicional de CD4 confirmou que algumas das células que participam são células T +

CD4.

Os resultados são apresentados como imagens representativas e dispersam-gramas ou resumindo 3 experimentos independentes como média ± SEM (exceto para (B ) que resume pelo menos 6 experimentos).

Assim, as células tumorais induzida a troca de citosol. Para controlar se este efeito era específico para células tumorais PBMC humanas foram incubadas com PBMC alogeneicas CMFDA-rotulados ou PBMC autólogas derivadas de dadores de sangue saudáveis. Nós não encontrou absorção de CMFDA comparável quando foram utilizadas células tumorais (Figura 5A). De nota, esplenócitos de ratos Lewis criados sob condições livres de organismos patogénicos especificados (SPF) não provocou adaptação de fluorescência em PBMC humanos, também (dados não mostrados).

Para excluir a possibilidade de que esse efeito foi causado por linhas de células de tumor que são frequentemente induzidas por vírus e estabilizadas (tal como para as células L23, [20]), as células de tumor primárias derivadas de HCC humana foram cultivadas com PBMCs alogénicas. Uma vez que excluiu a possibilidade de transferência de citosol entre células dador alogénico, os efeitos observados são interpretados estar relacionado com as células tumorais. Usando técnicas microscópicas uma absorção vigorosa de CMFDA após a exposição das PBMC a células de carcinoma hepatocelular era visível. Como controlo, saudáveis ​​hepatócitos humanos primários foram incubadas com PBMC que não induzem uma transferência de fluorescência (Figura 5B).