Abstract

A curcumina, o componente ativo da cúrcuma, tem sido mostrados para proteger contra carcinogênese e impedir o desenvolvimento do tumor. No entanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo anti-tumor no cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). Neste estudo, verificou-se que a curcumina pode inibir a proliferação de células SCLC, ciclo celular, migração, invasão e angiogênese através da supressão da STAT3. células SCLC foram tratados com curcumina (15 umol /L), e os resultados mostraram que a curcumina foi eficaz na inibição da STAT3 fosforilação para regular negativamente de uma matriz de STAT3 alvos a jusante, o que contribui para a supressão da proliferação celular, a perda de formação de colónias, depressão de célula migração e invasão. A curcumina também suprimiu a expressão de proteínas proliferativa (Survivin, Bcl-x

L e Ciclina B1), e proteínas invasivos (VEGF, MMP-2, MMP-7 e ICAM-1) .Knockdown expressão de STAT3 por siARN foi capaz para induzir efeitos anti-invasivos in vitro. Em contraste, a activação da STAT3 a montante da interleucina 6 (IL-6) leva ao aumento de

célula proliferação,

célula

sobrevivência crescimento, angiogénese, invasão, migração e tumor. Nossos resultados ilustram a importância biológica da IL-6 JAK de sinalização //STAT3 na progressão SCLC e provas providenovel que o caminho pode ser um novo alvo potencial para a terapia de SCLC. Concluiu-se que a curcumina é um agente potente na inibição da STAT3 com actividade farmacológica favorável, e curcumina pode ter potencial como uma translação eficaz do cancro terapêutico ou agente preventivo para SCLC

citação:. Yang CL, Liu YY, Ma YG, Xue YX, Liu DG, Ren Y, et al. Células Blocks (2012) curcumina pequenas células do cancro do pulmão de migração, invasão, angiogénese, ciclo celular e neoplasia através de Janus Kinase-STAT3 Sinalização Caminho. PLoS ONE 7 (5): e37960. doi: 10.1371 /journal.pone.0037960

editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Índia |

Recebidas: 1 de fevereiro de 2012; Aceito: 26 de abril de 2012; Publicado em: 25 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Provincial chave laboratório de câncer de esôfago, do Departamento de Ciência e Tecnologia, da República Popular da China (No. [2011] 20), Departamento de Saúde Liaoning, República Popular da China (No. 2010-079), Liaoning Liaoning Departamento de Recursos Humanos e Segurança social, República Popular da China (No. 2009-390). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) proteína é um membro de uma família de factores de transcrição citoplasmáticos latentes que transmitem sinais a partir da superfície da célula para o núcleo activado por citocinas e factores de crescimento. A ligação de receptores de superfície de células com ligandos, tais como interleucina-6 (IL-6) ou o factor de crescimento epidérmico (EGFR), induz a fosforilação da tirosina da proteína STAT3 por Janus quinases de tirosina-cinase do receptor do factor de crescimento e [1]. A forma dimérica da STAT3 activado fosfo- transloca para o núcleo e regula a expressão de genes que contêm locais de ligação de STAT3 nas suas promotores [2]. A activação da proteína STAT3 é rápida e transiente em células normais. STAT3 regula processos biológicos fundamentais, incluindo a proliferação celular, sobrevivência e desenvolvimento. Recentemente, evidências acumuladas indicam que as anormalidades no Janus quinase (JAK) /transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT) via de sinalização estão envolvidos na oncogénese de vários cancros [3].

Activado STAT3 (pSTAT3 nuclear) é expresso em cerca de 55% de tumores NSCLC, tal como medido por análises de imuno-histoquímica [4] – [6]. activação da STAT3 é observado na maioria das linhas celulares de NSCLC [7], [8]. Em contraste com NSCLC, forte expressão pSTAT3 foi demonstrada em 100% (10/10) dos tecidos do tumor SCLC testados [9]. No entanto, o mecanismo pelo qual desregulado sinalização STAT3 contribui para a progressão do cancro do pulmão de células pequenas humano (SCLC) não tem sido elucidado. CPPC é conhecido por ter uma biologia mais agressiva com um rápido crescimento e disseminação precoce, bem como uma associação comum com síndromes paraneoplásicos [10]. De todos os tipos histológicos de câncer de pulmão, SCLC é o mais sensível à quimioterapia e radiação, mas o prognóstico permanece pobre, com uma sobrevida após o tratamento mediana global de 10 meses e uma sobrevida de 5% [11] 5 anos. pacientes com câncer de pulmão idosos e aqueles com baixa capacidade de desempenho não são tratados com quimioterapia por causa da alta toxicidade dos regimes de múltiplas drogas. Descoberta de novos agentes com efeitos colaterais menos graves é de grande necessidade. No tratamento clínico de pacientes com câncer, muitos medicamentos são derivados de espécies de plantas naturais [12].

A curcumina é derivado do açafrão (

Curcuma longa

) e é um polifenol natural. Curcumina tem sido muito utilizado como um alimento, agente de coloração, e a medicina tradicional. É seguro e não tóxico e tem antitumoral demonstrável, anti-inflamatórios, por apoptose, e propriedades antioxidantes [13]. Especialmente para sua propriedade anticarcinogenic, ainda tem sido objecto de um grande interesse. Evidências crescentes indicam que a curcumina tem efeitos anti-cancro contra diferentes tipos de células tumorais humanas, incluindo células de cancro do ovário, células de cancro do cólon e células de astroglioma [14], [15]. foram identificados estes efeitos anticancerígenos de curcumina por meio de interferir com o ciclo celular, indutor da apoptose, e inibindo o potencial invasivo dos cancros. No entanto, os mecanismos subjacentes a este efeitos anticancerígenos ainda estão sob investigação, especialmente para seu potencial anti-invasiva em SCLC cancer.We já haviam demonstrado que a curcumina inibe o crescimento de células SCLC e induz a apoptose de células SCLC [16]. No presente estudo, investigamos os mecanismos moleculares pelos quais a curcumina suprimem migração e invasão em células SCLC. Nosso objetivo foi determinar o papel da JAK de sinalização /STAT na progressão SCLC e testar a hipótese de que a curcumina poderia servir como alvos terapêuticos.

Resultados

Nosso objetivo neste estudo foi determinar se a curcumina modula o crescimento das linhas de células SCLC e, em caso afirmativo, para delinear vários mecanismos pelos quais podem mediar os seus efeitos. Foram examinados os efeitos da curcumina na activação JAK, a activação da STAT3 e produtos de genes regulados por STAT3 e crescimento celular em CPPC (NCI-H446 e NCI-1688) células. Em um estudo anterior, identificou-se um nível de expressão de p-STAT3 mais elevada em linhas de células NCI-H446 em comparação com outras linhas de células SCLC humanas. Nós selecionamos as células NCI-H446 para este estudo.

IL-6 induz a proliferação de células SCLC humanas, e curcumina ou Si STAT3 inibe. A curcumina ou siSTAT3 inibe a proliferação de NCI-H446 e NCI-1688 células. Para investigar o papel da STAT3 no funcionamento de células de SCLC, a activação e a inibição da STAT3 foram induzidas com IL-6 e com siSTAT3 ou curcumina, respectivamente. Após a transfecção com STAT3 siRNA (siSTAT3) ou ARNsi de controlo (controlo negativo comercialmente), a expressão da STAT3 foi avaliada utilizando Western blot e RT-PCR. Descobrimos que siSTAT3 significativamente regulada negativamente a proteína e os níveis de ARNm de STAT3, em comparação com siSTAT3 controlo (Fig. 1).

As células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi STAT3 (Si STAT3). Após a transfecção, a expressão da proteína STAT3 (A) e ARNm (B) foi avaliada utilizando Western blot e RT-PCR e comparação com as células NCI-H446 e NCI-H1688 não transfectadas. As colunas “NCI-H446 e NCI-H1688 células” correspondem às células não tratadas, respectivamente. As colunas “siSTAT3” correspondem à transfectadas com colunas STAT3 siRNA.The “controlo” corresponde à transfectadas com ARNsi de controlo. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

p

. 0,05, em comparação com células de controlo

Para confirmar relatórios anteriores [17], [18] que a IL-6 induz a proliferação de células cancerosas, nós sérica células NCI-1688, durante 12 h e, em seguida, faminto NCI-H446 e cultivaram-na ausência ou na presença de diferentes concentrações de IL-6 durante 24 h, 48 h e 72 h. IL-6 induziu a proliferação de NCI-H446 e NCI-1688 de uma maneira dependente da dose. De acordo com os resultados da nossa experiência preliminar, a 25 ng /concentrações ml de IL-6 promoveu significativamente a proliferação de células, em comparação com 12,5 concentrações de ng /ml, enquanto que não houve diferença significativa entre 25 ng /ml e 50 ng /concentrações ml (Fig . 2). A concentração inibitória máxima metade (

50 IC) valor da curcumina foi de 15 uM em células SCLC do nosso trabalho publicado anterior [16]. Por conseguinte, a 25 ng /ml de concentração de IL-6 e 15 uM de concentração curcumina foram utilizados na experiência seguinte. SiSTAT3 sozinho ou 15 curcumina uM teve efeito significativo na proliferação de células, em comparação com células de controlo (Fig. 3). Foram observadas diferenças significativas entre todos os pontos de tempo examinados, indicando um aumento linear na proliferação com o aumento do tempo de exposição a IL-6 (todo o

p Art 0,05)

As células foram tratadas com IL. 6 (12,5, 25 ou 50 ng /ml) durante 24, 48, ou 72 h, e a vitalidade das células foi estimado usando o ensaio BrdU. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes.

p Art 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com células não tratadas com IL-6

As células foram tratadas com curcumina (15 um. ) durante 24, 48, ou 72 h, e a vitalidade das células foi estimado usando o ensaio BrdU. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

p Art 0,05 ou **

p Art 0,01, em comparação com as células não tratadas.

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p Art 0,05 ou

##

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. 0,01, em comparação com a transfectadas com células controle siRNA

A curcumina inibe as células SCLC migração e invasão. As inibições de NCI-H446 e migração celular NCI-1688 por curcumina foram examinados usando ensaios de cicatrização de feridas e modelos de migração Transwell e os resultados são mostrados na Fig. 4 e Fig. 5A. A curcumina (15 mmol /L) foi capaz de inibir significativamente NCI-H446 e NCI-1688 SCLC células migração, e este efeito foi consistente em ambos os cicatrização de feridas e transpo� modelos de migração. Além disso, os ensaios para cicatrização de feridas e Transwell ensaios de migração modelo indicaram que siSTAT3 foi capaz de inibir a célula migration.IL-6 era capaz de promover a migração celular e invasão. O ensaio baseia-Transwell Matrigel indicou que a curcumina ou siSTAT3was capaz de inibir significativamente a invasão de células (Fig. 5B). Estes resultados sugerem claramente que a curcumina exibe efeitos anti-migração e anti-invasão contra células SCLC.

monocamadas confluentes de células foram marcadas, e reparação foi monitorado microscopicamente após 24 h de tratamento com 15 uM curcumina ou IL-6 25 ng /mL. As fotografias representativas mostrou a mesma área no tempo zero e após 24 h de incubação com ou sem curcumina. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

p Art 0,05 ou **

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. 0,01, em comparação com células de controlo

Depois de 8 horas de incubação com ou sem a concentração indicada de curcumina, células que migram para a câmara inferior foram fixadas, coradas e contou-se utilizando microscopia de luz ou um sistema de rastreio de alto conteúdo baseado em microscopia flurescent, como descrito em Materiais e Métodos. campos aleatórios foram digitalizados (quatro campos por filtro do poço) para a presença de células no lado inferior da membrana. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

P

. 0,05, em comparação com células de controlo

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P

0,05, quando comparada com células tratadas com IL-6 (25 ng /ml). B, o efeito do tratamento curcumina na invasão de células foi determinada utilizando o Ensaio de Invasão Sistema de Matrigel. as células NCI-H446, em meio isento de soro com ou sem curcumina foram semeadas para dentro da câmara superior do sistema. O poço do fundo foi cheio com meio completo. Após 16 h de incubação, as células que tinham invadido através da membrana de Matrigel foram coradas com solução Giemsa 20% e contadas sob um microscópio de luz (ampliação, 200x). As experiências foram realizadas três vezes em triplicado. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

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. 0,05, em comparação com células de controlo

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. 0,05 em comparação com as células tratadas com IL-6 (25 ng /ml)

a importância do /JAK via IL-6 /STAT3 no crescimento independente de ancoragem. O crescimento independente de ancoragem de células SCLC foi determinada num ensaio de agar mole [19]. as células NCI-H446 foram capazes de construir grandes agregados no agar mole durante o período de observação de 15 dias. Em contraste, não houve proliferação na presença de siSTAT3 ou curcumina, o que sugere uma contribuição para esta via neste processo. Havia uma completa promover pela IL-6, sugerindo importância desta via em crescimento independente de ancoragem (Fig. 6). Na primeira semana, as células pareciam muito semelhantes ao microscópio com excepção para o facto de que os inibidos não proliferar. No entanto, depois que as células 7-14 dias inibida com curcumina começou a mudar sua morfologia.

A formação de colónias de células NCI-H446 e as sublinhas estáveis ​​indicados em agar mole. As células foram observadas utilizando um microscópio invertido (× 400) em agar mole para 15 dias. As colunas “controle” correspondem ao transfectadas com controle de siRNA.

A curcumina provoca G

2 /M Fase paragem do ciclo celular em células NCI-H446. Para determinar se a curcumina inibe a progressão do ciclo celular de células NCI-H446, as células foram cultivadas até 70% de confluência e a distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo depois de um de 12 e 24 h de exposição para a curcumina (15 uM). Observou-se que a percentagem de células em G

Fase 2 /M e um tratamento curcumina foi de 52,2% após 12 h de incubação e diminuiu para 21,2% depois de 24 h. A percentagem de células em sub-L

0 /L

1 fase foi de 3,5% e 37,1% após 12 e 24 h de incubação, respectivamente. Nas células de controlo da percentagem de células em G

2 /M e Sub-G

0 /G

1 fase foi de 21,7% e 1,1%, respectivamente (Tabela 1).

Para determinar a possível mecanismo através do qual a curcumina influencia o G

fase em células NCI-H446, a expressão de ciclina B1 foi determinada utilizando RT-PCR e transferência de Western. Em comparação com células de controlo, a curcumina regulada negativamente de forma significativa o ARNm e os níveis proteicos da ciclina B1, que está relacionado com L

progressão fase 2 /M (Fig. 7). O siSTAT3 teve efeito significativo sobre os níveis de expressão B1 ciclina. Em comparação com células de controlo, a IL-6 significativamente regulada positivamente a proteína e os níveis de ARNm da ciclina B1. Tomados em conjunto, os resultados acima manifesto que a curcumina inibe a proliferação de células de cancro SCLC e o bloqueia em G

2 de fase através da repressão da expressão da ciclina B1.

células NCI-H446 foram tratados com IL-6 ( 25 ng /ml) ou a curcumina (15 uM) durante 24 h. Os níveis de expressão destes componentes foram estimados utilizando RT-PCR (A) e Western blot (B). Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

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. 0,05 em comparação com células de controlo

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. 0,05 em comparação com as células tratadas com IL-6 (25 ng /ml)

a curcumina inibe a IL-6 fosforilação STAT3 indutível de uma maneira dependente da dose e tempo. Para examinar se a curcumina que foi desenhado para alvejar seletivamente STAT3 mostraria efeito inibitório semelhante na fosforilação da STAT3, as células NCI-H446 foram cultivadas em meio sem soro durante a noite e, em seguida, foram pré-tratadas com diferentes concentrações de curcumina por 1 horas ou 15 uM curcumina tempo diferente. Após o tratamento, a proteína total foi extraída e STAT3 fosforilado e STAT3 totais foram analisados ​​por Western blot. Como mostrado na Figura 8, a curcumina inibiu a fosforilação de tirosina de STAT3 em 705 de uma forma dependente da dose e tempo. STAT3 total não foi afetada pelo tratamento de curcumina

A:. Para estudar o efeito dose-dependente das NCI-H446cells foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina para 1 h. B: Para estudar o efeito dependente do tempo, as células foram tratadas com a curcumina (15 uM) durante 30, 60 e 120 min. C: Para estudar o efeito da curcumina na produção de IL-6 induzida por p-STAT-3, as células foram asdescribed cultivadas acima, excepto que as células foram pré-tratadas com IL-6 (25 ng /ml) durante 1 h antes do tratamento com a curcumina (15 ^ M) durante 1 h. As células foram removidos nos tempos indicados e lisadas para preparar o extracto de célula completa. As células foram colhidas e 20 ug de proteína do extracto de células completas foi carregado em cada pista. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

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. 0,05 em comparação com células de controlo

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. 0,05 em comparação com as células tratadas com IL-6 (25 ng /ml)

Dado que os sinais induzida por IL-6 são mediadas através de fosforilação da STAT3, é lógico então investigar o efeito de IL-6 e curcumina na STAT3 fosforilação em células SCLC. Embora as células SCLC expressam altos níveis de Tyr705p-STAT3 (Fig. 8A e B). A figura 8C mostra que induzida por IL-6 fosforilação STAT3 em células SCLC foi reduzida por tratamento de curcumina. A exposição de células a curcumina durante 1 h marcadamente suprimida fosforilação de STAT3 induzida por IL-6 em células NCI-H446.

A curcumina inibe a fosforilação JAK em células SCLC. A fosforilação de STAT depende da activação de JAK. Os membros da família JAK de quinases de tirosina de proteína fosforila fosforilam e activam as proteínas STAT citoplasmáticos. JAK-2 é um activador reconhecido da STAT3 [20]. Investigou-se os efeitos inibitórios da curcumina na activação de STAT era devido à supressão da expressão de JAK em CPPC cells.Curcumin inibida p-JAK-1, P-JAK-2 e a expressão de p-JAK-3 em células NCI-H446 (Fig. 9). Expressão de um total de JAK-1, JAK-2 e JAK-3 não foi alterada por tratamento curcumina.

células NCI-H446 foram tratados com a concentração dfferent de curcumina por 30 proteínas min.These foram testados por transferência de Western. Quantidades iguais de proteína celular total (20 ug) foram resolvidas por 10% -15% de SDS-PAGE. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

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. 0,05 em comparação com células de controlo

os níveis de curcumina inibida de MMP-2, MMP-7, de VEGF, Survivina, Bcl-X

L, e ICAM-1 em células SCLC. Níveis de migração, invasão e angiogénese associada proteínas em células NCI-H446 após o tratamento com a curcumina foi determinada e quantificada por transferência de Western. Os resultados foram mostrados na Figura 10 indicam que os níveis de MMP-2, MMP-7, VEGF e Survivina (Figura 10A). BCL-X

L, e ICAM-1 (Fig. 10B) foram menores do que o grupo de controlo correspondente. Estas proteínas desempenham um papel importante de migração celular, invasão e angiogénese. Estes efeitos podem ter levado para a inibição da migração, angiogénese e invasão de células NCI-H446 após a exposição a curcumina a 15 uM.

células NCI-H446 foram tratados com 15 ^ M durante 24 h a curcumina. Estas proteínas foram analisadas por transferência de Western. Quantidades iguais de proteína celular total (20 ug) foram resolvidas por 10% -15% de SDS-PAGE. GAPDH foi usada como um controlo de carga. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. *

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0,05 em comparação com células de controlo.

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. 0,05 em comparação com as células tratadas com IL-6 (25 ng /ml)

Discussão

SCLC representa um altamente maligno e forma particularmente agressiva de câncer, com início e generalizada metastasesand um mau prognóstico. Até à data, não existem dados delineando os efeitos da curcumina nas proteínas que regulam a sinalização STAT3 em CPPC. Vários estudos que empregam abordagens genéticas e farmacológicas para modular transdutor de sinal constitutivo e ativador de transcrição 3 atividade (STAT3) têm comprovado o papel crítico da atividade de STAT3 aberrante na transformação maligna e progressão do tumor e, portanto, endossa STAT3 como um novo alvo droga contra o câncer [21] .

curcumina (diferuloylmethane), um agente anti-inflamatório utilizado na medicina tradicional, tem sido mostrado para suprimir a transformação celular, a proliferação, invasão, angiogénese e metástases através de um mecanismo não é totalmente compreendido. Uma vez que vários genes que medeiam estes processos são regulados pelo transdutor de sinal e activador de transcrição, que postularam que a curcumina medeia a sua actividade através da modulação de activação da STAT3. Neste estudo, foram investigados o mecanismo pelo qual a curcumina manifesta o seu efeito sobre a expressão do gene da STAT3 e regulada a jusante-STAT3. Nós mostramos que a curcumina regulada a expressão de produtos de genes regulados por STAT3 envolvidas no ciclo celular (ciclina B1), sobrevivência (Bcl-X

L, Survivin), angiogênese (fator de crescimento endotelial vascular) e metástase (metalloproteinase- matriz 2, da metaloproteinase da matriz-7 e molécula de adesão intercelular-1). Tradicionalmente, o ciclo celular é segregado em quatro fases: a replicação do DNA ocorre durante a fase S, e cromossomo segregação ocorre durante a fase M. As fases S e M são separados por as chamadas fases Gap, L

1 (antes da replicação de ADN) e G

2 (antes da mitose). Nosso estudo demonstrou que a curcumina inibiu a proliferação de células NCI-H446 através da indução de prisão G

2 /M do ciclo celular, levando à morte celular por apoptose. Não foram observadas diferenças significativas em relação à distribuição de células no

0 /G

1 e S fases G. No presente estudo, ambos os níveis de mRNA de ciclina B1 e de proteína foram significativamente regulada negativamente quando as células foram tratadas com a curcumina durante 24 h. Ciclina B1, que é sobre-expresso numa variedade de tumores, é regulada por STAT3 e é necessária para as células para avançar a partir da L

2 de fase para a fase M do ciclo celular [22], [23]. Esta constatação demonstra pela primeira vez que a curcumina tem um efeito de captura sobre a progressão do ciclo celular que envolve o G

2 /H de fase em células SCLC. Isso também pode explicar os efeitos antiproliferativos da curcumina. Nosso laboratório tem mostrado anteriormente que a curcumina pode induzir SCLC células da apoptose. Além da activação constitutiva da STAT3, nós fomos capazes de demonstrar que a estimulação de células SCLC com IL-6 aumentam a fosforilação da STAT3 no resultado de SCLC cells.Our reforçar o potencial da curcumina como um medicamento na terapia anti-cancro multitarget.

a nossa descoberta de que a curcumina inibiu a invasão de células SCLC por meio de infra-regulação da expressão de produtos de genes regulada STAT3 envolvidas na invasão de células (por exemplo, MMP-2 e MMP-7). A infra-regulação de VEGF como mostrado aqui poderia explicar as actividades antimetastáticos de curcumina [24]. ICAM-1 tem sido implicada em processos cancerígenos, e a sua sobre-expressão por células malignas tem sido mostrado para melhorar a invasão celular, induzir a angiogénese, regulam as defesas celulares anti-apoptóticos, e aumentar a resistência imunológica através da produção de prostaglandina E2 [25]. MMP-2 e MMP-9 desempenha um papel crucial na invasão tumoral e angiogénese por mediar a degradação da matriz extracelular, e inibição da actividade de MMP tem sido mostrado para suprimir a metástase do cancro pulmonar [26].

Para investigar o mecanismo dos efeitos inibitórios da STAT3 induzida por curcumina em células SCLC, analisou-se as proteínas a montante da STAT3. Os papéis de JAK foram implicados na activação da STAT3. Tal como mostrado na Figura 8C e 9B, a fosforilação de JAK-1, JAK-2 e JAK-3 foram suprimidos por tratamento com curcumina em células SCLC. É provável que a inibição da STAT3 Tyr705 é devido à inibição da JAK, porque a inibição de fosforilação de JAK ocorreu dentro de 30 min após o tratamento, ao passo que a fosforilação da STAT3 foi inibida a 1 hora após o tratamento. Isto sugere que a curcumina pode manifestar o seu efeito na activação da STAT3, através da inibição de JAK. Em um estudo anterior, nosso laboratório descobriram que a curcumina inibe selectivamente a fosforilação de tirosina STAT3, mas não afeta a fosforilação de serina da STAT3 em células SCLC. Estes resultados estão de acordo com estudos realizados por Saydmohammed et al [27]. Eles descobriram que a curcumina não conseguiu inibir a fosforilação da STAT3 em Ser727 em células de cancro do endométrio e do ovário. Após a estimulação de IL-6, a STAT3 é rapidamente fosforilada em Tyr705 e translocada para o núcleo. Os nossos resultados indicam ainda que a IL-6 mediado por fosforilação STAT3 Tyr705 é principalmente um evento nuclear.

Em muitos tumores e células cancerosas, a activação constitutiva de STAT3 é dependente de IL-6, quer através de sinalização autócrina ou parácrina, a qual parece para ser amplamente expressos em linhas celulares de cancro [28]. Em alguns casos, a activação da via de STAT3 vivo está correlacionada com a infiltração de células inflamatórias intra-tumoral, o que significa que a activação da STAT3 pode ser através de mecanismos parácrinos [29]. Como para o presente processo, a inibição da STAT3 causou uma diminuição da produção de IL-activação da STAT3 6.O via tem sido estudada em amostras de tecido de tumor dos doentes. Os níveis de expressão de p-STAT3 correlacionada com a taxa de sobrevivência e a gravidade da cordoma [30]. Estudos recentes têm também ligado a ativação da STAT3 caminho para alto grau histológico e estágio avançado em vários tipos de câncer [31]. Estes resultados sugerem que a STAT3 pode não só servir como um marcador preditivo de resistência à droga, mas também como um marcador de prognóstico de tumores [32].

Em resumo, antes da presente relatório, não houve informação sobre o estado de JAK /STAT3 sinalização proteínas em células SCLC e sua regulação pelo curcumina. Este estudo é o primeiro a ter examinado em anti-câncer detalhe curcumina papel mecanicista da JAK de sinalização /STAT3 em SCLC tumorigênese e progressão. A importância deste estudo é que nós identificamos uma perturbação em uma infinidade de JAK /STAT sinalização proteínas em células cancerosas. Assim, STAT3 desempenha um papel significativo na oncogênese SCLC e poderia ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento SCLC.

Materiais e Métodos

Chemicals e anticorpos

A curcumina (1,7 -bis [4-HY-droxy-3-metoxifenil] -1,6-heptadieno-3,5-diona) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), dissolvido em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM , e diluída até à concentração indicada com meio RPMI 1640. Os anticorpos para Survivina, Bcl-X

L, ciclina B1, P-JAK1, JAK1, P-JAK2, JAK2, P-JAK3, JAK3, Tyr

705-pSTAT3 e STAT3 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology ( Beverly, MA). Os anticorpos para o VEGF, ICAM-1, MMP-2, MMP-7, e GAPDH foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). siSTAT3 e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

Cultura celular

NCI-H446 e NCI-1688 (SCLC) humanas linhas celulares do nosso anterior trabalho publicado [15] foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro a 10% HyClone fetal bovino (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, EUA), numa atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C.Cells foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura e colhida em uma solução de tripsina-EDTA na fase de crescimento logarítmica.

os plasmídeos e os siRNAs

os plasmídeos vectores de controlo (um mutante negativo dominante da STAT3) pcDNA6.2-STAT3 e foram descrita anteriormente [33]. sequências de siRNA segmentação STAT3α foram os seguintes: F, 5′-TGCTGAATGCAGGCAATCTGTTGCCGGTTTTGG CCACTGACTGACCGGCAACATTGCCTGCATT-3 ‘e R’, 5′-CCTGAATGCAGG CAATGTTGCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGCAACAGATTGCCTGCATTC-3 ‘. Controlo negativo: F, 5’-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTG GCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 ‘e R, 5’-CCTGAAATGTA CTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTC-3

transfecção transiente e estável

A transfecção de plasmídeos e siRNAs em câncer de pulmão de pequenas células. células foi feito usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para a transfecção transiente, as células foram transfectadas com ARNsi ou plasmídeos em doses diferentes conforme indicado, durante 48 horas antes dos ensaios funcionais foram realizados. As linhas celulares estavelmente transfeted foram isolados a partir de células SCLC transfectadas com o plasmídeo pcDNA6.2-STAT3 através de selecção com Blasticidina (Invitrogen, 5 ug /ml).

Ensaio de Proliferação Celular

A proliferação de células SCLC estava determinado por análise de 5′-bromo-2′-desoxiuridina incorporação (BrdU) no ADN sintetizado de novo utilizando uma enzima de proliferação celular linked immunosorbent assay (ELISA proliferação celular (BrdU), Roche, Mannheim, Alemanha). Para o ensaio de incorporação de BrdU, as células foram contadas e semeadas em placas de cultura de 96 poços (2 × 10

3 células /cavidade). BrdU células SCLC (10 uL /​​poço) foi adicionado foram fixadas e coradas após 4 h de acordo com as instruções do fabricante. análise colorimétrica foi realizada com um leitor de placas ELISA (DTX880; Beckman, Miami, FL) a 450 nm

análise do ciclo celular por citometria de fluxo

Após o tratamento com curcumina durante 24 h, as células SCLC. foram colhidas e lavadas duas vezes com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em etanol a 75% durante 2 h a 4 ° C. As células fixadas foram lavadas duas vezes com 500 ml de PBS frio. As células foram então coradas com 500 ml de solução de iodeto de propídio (PI) de coloração (50 mg /PI ml, 0,1% de Triton X-100, 200 mg /ml de ARNase isenta de ADNase em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. Dez mil eventos por amostra foram adquiridos utilizando um fluxo FACS-Scan citómetro (Becton-Dickinson, San José, CA, EUA), e a percentagem de células em G

0 /L

1, S, G

2 /M e Sub-G

2 /M fases do ciclo celular foram determinados por meio de software CELLQuest (Becton-Dickinson).

a cicatrização de feridas Ensaio

as células SCLC foram cultivadas em placas de 24 poços e cultivados em meio contendo 10% de FBS a monocamada de células quase confluentes, em seguida, cuidadosamente riscado utilizando uma ponta de pipeta de plástico para desenhar uma “ferida” linear na monocamada de células de cada poço. A monocamada foi lavada duas vezes com PBS para remover os detritos ou as células isoladas a partir da monocamada, e, em seguida, a curcumina foi adicionado por 15 uM; IL-6 foi adicionado por 25 ng /ml; o poço de controlo foi adicionado com 0,1% de DMSO como controlo do solvente. As culturas foram incubadas a 37 ° C e monitorizada por photographedimmediately e do lapso de tempo no sistema Bio-estação Carl Zeiss Axiovert. Sob o microscópio, o número de células que migraram para dentro da zona livre de células, foi avaliado na linha de base da “ferida” linear. As experiências foram realizadas três vezes em triplicado e foram contadas em dupla ocultação por, pelo menos, dois investigators.To investigar a motilidade celular, foram preparadas e ferido como descritos above.The feridos monocamadas foram incubadas a 37 ° C em meio RPMI-1640 contendo 10 monocamadas de células SCLC