Abstract

estudos recentes têm sugerido que o K-ras aberrantes de sinalização é responsável pelo desencadeamento de respostas imunológicas e tumorigénese-driven inflamação. As interleucinas IL-17, IL-22 e IL-23 têm sido relatados em vários tipos de malignidades, mas o papel exacto mecanicista destas moléculas continua por ser elucidado. Dado o papel de K-ras e o envolvimento de interleucinas na tumorigénese colorectal, os esforços de investigação são apresentados pela primeira vez, que mostra que expresso diferencialmente interleucina níveis de IL-17, IL-22 e IL-23 são associados com K-ras em uma forma específica do palco junto a progressão do cancro colorectal. Especificamente, a) o efeito de K-ras sinalização foi investigada na expressão total de interleucinas em doentes com cancro colorrectal e controlos saudáveis, e b) uma associação foi estabelecida entre a K-ras e citocinas mutantes GM-CSF e IFN-γ. Os resultados indicam que as interleucinas específicos são expressos diferencialmente em pacientes positivos K-ras e o uso de K-ras inibidor Manumycin A diminui tanto os níveis de interleucina e a apoptose em células Caco-2 por inibição da viabilidade celular. Finalmente, os níveis de inflamação impulsionado-GM-CSF e IFN-γ são modulados através da expressão de interleucina em pacientes com tumor, com expressão de interleucina no lúmen intestinal e tecido canceroso mediado por sinalização K-Ras aberrante. Colectivamente, os resultados a) indicam que a expressão de interleucina é influenciada pela sinalização de Ras e interleucinas específicos desempenham um papel promotor oncogénica em cancro colo-rectal, com destaque para a ligação molecular entre a inflamação e a tumorigénese, e b) acentuam as correlações moleculares entrelaçadas como conduz a novas abordagens terapêuticas no futuro

Citation:. Petanidis S, Anestakis D, Argyraki M, Hadzopoulou-Cladaras M, Salifoglou a (2013) expressão diferencial de IL-17, 22 e 23 na progressão do câncer colorretal em pacientes com mutação K-ras: Inibição de sinal Ras e diafonia com GM-CSF e IFN-γ. PLoS ONE 8 (9): e73616. doi: 10.1371 /journal.pone.0073616

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 21 de junho de 2013; Aceito: 23 de julho de 2013; Publicação: 06 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Petanidis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi co-financiado pela UE-FSE e fundos nacionais gregas através do programa QREN-Heráclito II. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

o câncer colorretal é a segunda forma mais comum de câncer no mundo. Atualmente, na maioria dos países em desenvolvimento, não há rastreio organizado e programas de diagnóstico [1], [2]. Estudos anteriores demonstraram que o cancro colo-rectal é uma doença multifactorial, em que a expressão de muitos genes específicos, conhecidos como oncogenes ou supressores de tumor, é anormalmente alterados [3]. A este respeito, o gene PIK3CA, que está envolvido na via de sinalização de PI3K /AKT, é sobre-regulada no cancro colo-rectal. O gene supressor de tumor fosfatase e tensina homólogo (PTEN) é regulada para baixo devido a uma mutação genética ou eliminação [4]. No entanto, os mecanismos moleculares da carcinogénese colorectal permanecem por ser elucidados. Toward tais esforços, é crucial para identificar marcadores moleculares específicos para a detecção e identificação de mecanismos que contribuem para a carcinogénese colorectal. Um tal biomarcador representativa é K-ras, um oncogene com guanosina trifosfato (GTP) propriedades de ligação [5]. Devido à sua capacidade para interagir com moléculas de sinalização importantes, incluindo o transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), e a proteína quinase activada por mitogénio (MAPK), o gene K-ras proporciona uma função essencial nas a divisão celular, o crescimento e diferenciação celular. Deste modo, as mutações no gene K-ras (em especial, as substituições de um único nucleótido) estão implicados na maior parte dos tipos de tumores, incluindo o adenocarcinoma do pulmão, cancro do pulmão, o carcinoma ductal do pâncreas, carcinoma colorrectal e [6].

Ao longo dos últimos anos, evidências têm demonstrado que interleucinas realizar funções importantes no desenvolvimento do tumor, diferenciação celular, inflamação e metástase [7], [8]. A este respeito, a IL-17, que é largamente produzido por linfócitos T de memória activadas, estimula tanto a imunidade inata e defesa do hospedeiro e desempenha um papel activo em doenças inflamatórias, doenças auto-imunes e cancro. Mais especificamente, a IL-17 induz a expressão do factor nuclear kappa B (NF-kB), quimiocinas CXCL8, CXCL6 e CXCL1, factores de crescimento de G-CSF, GM-CSF (-fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos), IL-6 e moléculas de adesão (ICAM-1), levando à acumulação de neutrófilos aumentada, granulopoeisis, e respostas inflamatórias [9], [10]. Por outro lado, a IL-22 actua como um mediador de respostas inflamatórias celulares através da activação quinases intracelulares (JAK1, Tyk2, e quinases MAP) e factores de transcrição tais como a STAT3 [11]. Além disso, as funções de IL-22 exibe anti-apoptóticos e tumorigénicas, com dados recentes que mostram que a sobre-expressão da molécula que protege linhas celulares de cancro de pulmão de apoptose através de uma) activação da STAT3 e seus jusante proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl- xL, e b) a inactivação das cinases reguladas por sinais extracelulares [12]. Do mesmo modo, a IL-23 desempenha um papel-chave na inflamação intestinal crónica e a sua sobre-regulação em tecidos paralelos malignas níveis de o “biomarcador metastático” metaloproteinases de matriz MMP-9 aumentada, factor de necrose tumoral TNF-alfa, e o aumento dos níveis de angiogénese [13 ], [14], [15].

em um esforço para descobrir as ligações moleculares entre as vias tumorigênicos e imuno-inflamação na fisiologia do câncer, a pesquisa foi lançada em nossos laboratórios para sondar as interações e possíveis papéis entrelaçadas que os alvos moleculares anteriormente mencionados podem desempenhar na progressão do cancro colorectal em múltiplos estágios. Para este fim, relatamos aqui pela primeira vez que a) as interleucinas específicos são regulados positivamente em carcinoma colorrectal em comparação com tecidos colorrectais saudáveis, b) interleucinas são sobre-expressa em todos os pacientes K-ras e pode promover o crescimento de células e inibir a célula apoptose em células Caco-2 células de câncer colorretal através dos ras via de sinalização, c) uso de K-ras inibidor Manumycin a diminui os níveis de interleucina, e diminui a apoptose in-2 Caco células cancerosas colorectal inibindo a viabilidade celular, e d) GM-CSF e IFN-γ (interferão gama) são modulados através da expressão de interleucina positiva ou negativamente. As observações coletivas lançar luz sobre a associação funcional entre interleucinas na inflamação, ras-de sinalização e tumorigênese colorretal, assim potencialmente auxiliar no desenvolvimento de detecção de câncer de futuro e terapêutica.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi realizado com a aprovação do Conselho de revisão Institucional do Hospital AHEPA da Faculdade de Medicina, Universidade Aristóteles de Salónica. O papel satisfaz PLoS ONE políticas em matéria de investigação sujeito humano. Um consentimento informado por escrito foi recebido de cada paciente. autorizações escritas foram obtidos, antes da cirurgia, de pacientes envolvidos voluntariamente no uso de tecidos exclusivamente para fins de investigação. Os doentes tinham lido e entendido o documento as informações do paciente fornecido, e os objetivos e métodos do estudo tinha sido totalmente explicado a eles. Os doentes envolvidos tinham dado consentimento informado por escrito para autores deste manuscrito para publicação destes dados. A investigação clínico foi realizado de acordo com as orientações expressas na Declaração de Helsinki.

Reagentes

Manumycin A foi adquirido a Sigma (Sigma Alemanha, Europa). DMEM-Hepes, PBS (tampão fosfato salino), FBS (soro fetal bovino), e tripsina-EDTA reagentes foram adquiridos a partir de Invitrogen (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha). DMSO (sulfóxido de dimetilo) e Tris-EDTA (Tris-etileno-diamino-tetra-acético) foram adquiridos a Applichem (Applichem, Darmstadt, Alemanha). Os K-ras (A-18) de peroxidase policlonal de cabra IgG de rábano (HRP), de ratinho anti-IgG de cabra-HRP, e GAPDH (G-20) policlonais de cabra IgG-HRP para a análise de transferência de Western foram obtidos de Santa Cruz ( Santa Cruz, Califórnia, EUA). A IL-17 humana, IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN-γ foram detectadas utilizando anticorpos monoclonais anti-humanos de Santa Cruz. Para a preparação de soluções aquosas concentradas (1,0 u), Manumycin A foi dissolvido em Tris 10 mM, pH 7,4. A solução estoque Manumycin A foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,22? M e, subsequentemente, dividido em alíquotas e armazenado no escuro à temperatura ambiente. Tris-EDTA (TE) tampão foi preparado a partir de um 1 M de Tris, pH 8, e uma solução de estoque de 100 mM de EDTA. As concentrações finais eram de Tris 50 mM e EDTA 1 mM. O estoque assim preparado foi filtrado através de um filtro de 0,22 um, em seguida, dividido em alíquotas e armazenado no escuro à temperatura ambiente.

Pacientes

Um total de 92 pacientes com cancro colo-rectal (CRC), 37-88 anos de idade, eram do Hospital AHEPA da Faculdade de Medicina, Universidade Aristóteles de Salónica (Tabela S1). Desses pacientes, 28 abrigavam mutações K-ras (24 com G12V e 4 com G12D). Estes pacientes foram submetidos a ressecção de câncer colorretal (nas linhas B1-D) entre 2009 e 2012. Além disso, 56 voluntários saudáveis ​​que a) preencheram os requisitos de ter sexo combinado e idade semelhante com as amostras de pacientes com CCR, e b) não apresentaram cólon adenomas, foram seleccionadas como controlos. Os doentes com condições inflamatórias, incluindo doenças infecciosas ou de colagénio, foram excluídos. Todos os pacientes foram classificados de acordo com as classificações de palco UICC usando espécimes ressecados. As amostras de sangue foram obtidas por punção venosa antes da cirurgia rectal. Cada amostra foi centrifugada a 3000 g durante 5 min, e, em seguida, congeladas a -80 ° C até à análise.

ADN e ARN A extracção

fixado em formalina, foram seleccionadas secções tumorais do doente embebidos em parafina por um patologista para confirmar o diagnóstico e definir áreas enriqueceu-tumorais para dissecção. As células cancerosas isoladas foram lisadas em tampão (0,2 M Tris-HCl, NaCl 0,5 M, EDTA 0,01 M, SDS a 1%, de sódio 1 M de acetato) contendo proteinase K a 60 ° C durante 72 extracção h e o ADN foi realizada com a utilização de o DNA e RNA Qiagen Purification Kit de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Atenas, Grécia). Para extracção de RNA, as células cancerosas foram re-suspensas em 400 de tampão de ARN lise ul (0,5 M de EDTA, 10% de SDS, Tris 1 M, pH 7,5) suplementado com 300 mg de proteinase K e incubou-se a 60 ° C durante 16 horas até que o tecido tinha foi completamente solubilizada. O ARN foi purificado por meio de Trizol reagente (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), subsequentemente tratado com ADNase para evitar a contaminação do ADN genómico, e armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

Ensaios imunossorvente (ELISA) ligado a enzima

Antes do ensaio, as amostras de tecidos congelados foram colocados à temperatura ambiente. Subsequentemente, elas foram lavadas em uma solução isotónica de cloreto de sódio (Sigma), cortadas em pedaços, pesados ​​e homogeneizados a 4 ° C em tampão de lise (HEPES 50 mM pH 7,4, CHAPS 5 mM, 5 mM de DTT) 1. O processamento da amostra ocorreu em uma escala de massa de 1 g de tecido /10 ml de tampão de lise. Os tecidos homogeneizados manteve-se a -20 ° C durante 24 hr e, em seguida, centrifugados a 20000 g durante 15 min a 4 ° C. Os sobrenadantes (10 ul por cavidade) foram usadas para específica fase-quantitativa (B1, B2, C1, C2, D) de detecção de IL-17, IL-22 e IL-23 por meio de ensaios de imunossorvente ligado a enzima de Cytoscreen (Biosource International , Camarillo, CA). Os limites de detecção para os kits de ELISA, tal como especificado pelo fabricante, foram de 9 pg /ml (IL-17), 8 pg /ml (IL-22) e 4 pg /ml (IL-23). Manumycin Um tratamento foi aplicado a todas as amostras de pacientes fase D para todos os três interleucinas investigados.

Transcriptase Reversa Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

RT-PCR foi realizada em amostras de tecido do doente para IL -17, IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN-γ. GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi usada como um controlo interno. A amplificação foi realizada num volume total de 20 ul por reacção, contendo 10 ul de PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, RU), 5 uL de iniciadores (1 pmol /uL) e 5 ul de cDNA (40 de ARN ng) . os iniciadores de RT-PCR de IL-17, 1L-22, IL-23, GM-CSF, IFN-γ e de GAPDH são listados na Tabela S2. Os parâmetros da reacção de PCR foram definidas como se segue: 95 ° C durante 15 minutos, seguido por 40 ciclos de PCR reacção a 94 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Derreter análise da curva de produtos de amplificação foi realizada no final de cada reacção de PCR por aumento da temperatura de 60-95 ° C com uma taxa de transição de temperatura de 0,1 ° C por segundo, o que nos permite distinguir os produtos originais a partir de produtos e iniciador não específicas dímeros. Os produtos de PCR foram também separados num gel de agarose a 1,5% para visualizar a formação de produtos de PCR correcção. A quantificação relativa (RQ) da expressão do gene foi calculada assumindo 100% eficiente de PCR, em que cada valor de CT das reacções foi normalizada para a expressão de ARNm de GAPDH.

K-ras detecção da mutação e análise da sequência de K-ras G12 Codon

Todas as amostras de tecido de tumor de pacientes eram snap-congelados e preservados em nitrogênio líquido antes do uso. As secções de parafina foram então preparadas e uma secção de cada caso foi escolhida para a coloração de hematoxilina-eosina. Um patologista experimentado analisada a secção de Hematoxilina-Eosina para confirmar a presença de tecido tumoral. Subsequentemente, as amostras de tecido a partir de, pelo menos, cinco secções em série foram macrodissected para assegurar que as amostras continham pelo menos 80% de células tumorais. O ADN foi isolado a partir destas amostras de tecido, utilizando o Kit de extracção de ADN Qiagen (Qiagen, Berlim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, as mutações no codão 12 de K-ras exão 1 foram detectadas nestas amostras de DNA genómico através de sequenciação directa baseada em PCR. Os iniciadores de PCR para a K-ras foram utilizados K-ras-Forward: 5′-AAGGCCTGCTGAAAGTGACTG-3 ‘e K-ras-reverse: 5′-CTGGTGCAGGACCATTCTTCAG-3’. A reacção de PCR foi realizada num volume total de 50 l contendo 150 ng de DNA genómico extraído. As condições de amplificação de PCR foram como se segue: desnaturação inicial a 94 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 s, hibridação a 55 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s, com uma etapa de extens final a 72 ° C durante 5 min num termociclador TP-600 (Takara). Os produtos de PCR foram então analisados ​​utilizando electroforese em gel de 2,5% de agarose e purificou-se ainda mais para a sequenciação directa de ADN por meio de um analisador de ADN ABI-3730XL (Applied Biosystems, Europa).

Análise imuno-histoquímica de IL-17, IL-22, e IL-23

secções parafinadas de biópsias de cólon humano a partir de pacientes com cancro colorrectal, foram tratados com IL-23 anticorpos contra a IL-17 anti-IL-22 humana anti-humano e anti-humanos monoclonais (mAb) ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Coloração com o isotipo de IgG1 de ratinho foi utilizado como controlo negativo. As imagens foram obtidas através de uma Carl Zeiss microscópio usando software de análise de imagem (Carl Zeiss, Berlim, Alemanha).

Western Blot Análise de IL-17, IL-22 e IL-23

Collected amostras de tecido de pacientes colorectais foram lavadas duas vezes com PBS gelado e lisadas em 100 mL de tampão de lise arrefecido com gelo por 1 × 10

6 células. Os lisados ​​foram incubados em gelo durante 10 min, agitada em vórtex durante 45 s e mantida em gelo durante mais 10 min. Após a centrifugação a 14.000 g e 4 ° C durante um período de 15 min, o sobrenadante foi colhido e as proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford. proteínas de lisados ​​dissolvidos em tampão de amostra 6xLaemmli foram separadas (30 ug /pista) utilizando electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (10% acrilamida) e PVDF (difluoreto de polivinilideno) membranas transferidas-electro. Após o bloqueio com leite magro a 5% em tampão TBST (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,6), as membranas foram incubadas durante 90 minutos com uma diluição adequada de anticorpo primário em TBST + 1% leite desnatado. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com uma diluição adequada de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano em TBST mais leite magro a 1%. Finalmente, as transferências foram desenvolvidos por ECL (reforçada quimiluminescência) e digitalizados através de um BioSpectrum 500 Imaging System. GAPDH foi usada como um controlo interno em todas as experiências.

ELISA local para a GM-CSF e IFN-γ

IFN-γ produção de células a partir de amostras de sangue de doentes foram quantificados com um IFN-γ ELISPOT kit (Diaclone, Besancon, França) de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. As membranas foram revestidas com anticorpos de IFN-y humano e incubadas durante a noite a 37 ° C. Em seguida, 1 × 10

5 PBMC (células mononucleares do sangue periférico) a partir de doentes com cancro colorectal foram adicionados para as placas e incubadas durante 26 hr a 37 ° C com 5% de CO

2. As células foram removidas e os anticorpos biotinilados contra IFN-γ humano foram adicionados sobre as membranas. As manchas foram contadas por um contador de placas automatizado da Applied Biosystems (Applied Biosystems, Europa)

na produção de células a partir de PBMC de doentes foram quantificados utilizando um kit de GM-CSF de ELISPOT (R D Biosystems, Minneapolis , EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, placas de 96 poços de filtração de ELISPOT foram revestidas com 4 ug /ml de anticorpo GM-CSF em 100 ul de reagente diluente durante a noite a 37 ° C. As placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (PBS com 0,5% de Tween 20) e bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente em tampão contendo PBS, suplementado com BSA a 1% e 5% de sacarose bloqueio. placas ELISPOT foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2, e 100% de humidade. Poços contendo células só serviu como controle negativo. As manchas foram enumeradas por um contador de placas automatizado (Applied Biosystems).

Cultura celular

adenocarcinoma colorretal células Caco-2 epiteliais humanas foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas em DMEM (meio de eagle modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (Biochrom, Alemanha). As culturas de células foram cultivadas até à confluência e mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2. As células Caco-2 foram incubadas com meio isento de soro fetal bovino durante 24 h antes do tratamento com Manumycin A a uma concentração final na gama de 50-300 | iM. Três conjuntos independentes de experiências foram realizadas num Manumycin Um tratamento.

MTT de viabilidade celular Ensaio

A viabilidade celular em células Caco-2 foi investigada usando o MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol -2-il) brometo) -2,5-difeniltetrazólio ensaio. As células foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. Após um tratamento de 24 horas com Manumycin A, foi adicionada uma solução MTT (10 ul /poço) e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. O meio foi então removido, e os cristais de formazano precipitados foram dissolvidos em 100 ul de DMSO. Após agitação durante 30 min, a absorvância a 570 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas de ELISA (BioRad, Europa). A viabilidade celular relativa foi calculada como se segue: a viabilidade celular relativa = (absorvância média experimental /absorvência média de controlo) × 100%. Os ensaios foram realizados em triplicado, em três experiências independentes.

Ensaio TUNEL

apoptose celular em células Caco-2 foi visualizada utilizando o TUNEL (-marcação terminal desoxinucleotidil-transferase terminal nick-mediada UTP biotinilado) detecção ensaio (Roche, Atenas, Grécia). As células foram incubadas com Manumycin durante 24 horas e depois lavou-se três vezes com PBS. Resumidamente, as células foram tratadas com proteinase K e enxaguadas duas vezes com PBS. Adicionou-se um tampão de equilíbrio contendo a mistura de nucleótidos marcados e enzima TdT; a mistura foi deixada a incubar a 37 ° C durante 1 hora em um de 5% de CO

2 câmara humidificada, e, em seguida, a coloração foi realizada. Observados através de um microscópio de fluorescência a Carl Zeiss, com detecção a 570 nm, as células normais não estão manchadas enquanto que as células em apoptose têm uma forte fluorescência vermelha.

Análise Estatística

O teste t de Student e one-way e testes de variância de dois fatores foram utilizados para análises estatísticas dos dados. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad 5.1 (GraphPad, La Jolla, EUA). Casos com valores de P 0,05 ou 0,01 foram considerados estatisticamente significativos (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Resultados

interleucina e K-ras Correlação em colorectal Cancer Stage Progressão

Os níveis de IL-17, IL-22 e IL-23 em pacientes com câncer e controles saudáveis ​​foram determinados utilizando interleucina humana imunoensaio ELISA, Western Blot, e RT- As técnicas de PCR.

IL-17

Inicialmente, a IL-17 os níveis de expressão foram medidos em estágios consecutivos de cancro colo-rectal e em tecidos de controlo saudáveis, utilizando ELISA. Os resultados mostraram que a IL-17 os níveis de expressão eram geralmente mais elevada em K-ras tecidos cancerosos positivos (a partir de 170 pg /ml em B1 a 247 pg /ml em D) em comparação com K-ras amostras negativas (de 150 pg /ml em B1 a 225 pg /ml em D) (P 0,05) (Figura 1A). Análise de IL-17 os níveis de proteína ao longo do cancro fases B1-D em pacientes mostrou que eles eram significativamente mais elevados em comparação com o a) níveis de doentes negativos para o K-ras (62% vs. 38%) correspondente, e b) controlos saudáveis ​​( 62% vs 16%) (Figura 2A). Além disso, o nível de ARNm de IL-17 foi determinada nas amostras positivas K-ras. Um aumento significativo em ARNm de IL-17 foi observada níveis (Figura 2B). A fim de examinar o efeito da mutação K-ras (G12V) sobre a expressão de interleucina, o inibidor de transferase de farnesilo ras Manumycin A foi aplicado em amostras normais e fase D do paciente, devido à sobre-expressão selectiva do que a interleucina nessa fase particular. No final do tratamento Manumycin A (10 μΜ), uma diminuição significativa (P 0,001) nos níveis de IL-17 foi observado (Figura 1A). Uma diminuição semelhante em amostras D etapa positiva K-ras foi exemplificado por níveis de mRNA e proteína (P 0,001 para os níveis de proteína, P 0,01 para níveis de mRNA) (Figura 3A-B). As experiências indicam a importância do K-ras mutantes de sinalização de IL-17 de expressão.

Determinação da interleucina (A) IL-17, (B) IL-22, e (C) de IL-23 As concentrações (pg /ml) nos tecidos tumorais de K-ras positivo, os pacientes com cancro do cólon negativos K-ras, e pacientes de controlo, nas diversas fases da progressão do cancro do cólon. Manumycin A foi aplicado em amostras normais e fase D do paciente. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de amostras em cada grupo envolvido. Grande barra indica comparação entre estágio D do paciente e estágio D + amostras de tratamento Manumycin.

(A) níveis de IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN expressão da proteína -γ. GAPDH foi usada como um controlo de carga por análise de Western blot. Os dados são média ± SD de três experiências independentes. A análise densitométrica de cada nível de proteína foi calculado a partir da média de três experiências. Cada valor foi expresso como a razão entre a proteína medido ao nível GAPDH (P 0,001). (B) os níveis de IL-17 de expressão de mRNA de IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN-γ a partir de tecidos de cancro do cólon realizada por análise de RT-PCR. 5 ug de RNA total foi isolado a partir de tecidos de cancro. Os valores representam a média ± DP de três experiências independentes.

Efeito do Manumycin Um tratamento (10 uM) sobre os níveis de IL-17, IL-22, IL-23 (a) expressão de ARNm, GM-CSF e IFN-γ em pacientes de cancro colorrectal positivos K-ras como realizada por análise de RT-PCR. células de cólon fase D dos pacientes foram tratados com Manumycin A (10 uM) durante 24 h, antes de RT-PCR. 5 ug de RNA total foi isolado a partir de células de cólon tratadas. Os valores representam a média ± DP de três experiências independentes. (B) os níveis de IL-17 de expressão de proteínas, IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN-γ em K-ras doentes com cancro colorectal positivos como realizada por análise Western Blot. células do cólon estágio D de pacientes foram tratados com Manumycin A (10 �), durante 24 horas, antes da quantificação de proteínas. Os valores representam a média ± DP de três experiências independentes.

IL-22

Tissue IL-22 níveis foram significativamente levantada no grupo negativo K-ras em comparação com os pacientes que ostentam a mutação K-ras (a partir de 94 pg /ml vs 80 pg /ml em B1 a 216 pg /ml vs. 150 pg /ml em D) (P 0,05 para B1-C1, P 0,01 para C2-D) ( A Figura 1B). Além disso, os níveis de proteína e ARNm de IL-22 foram significativamente mais elevados no grupo negativo de K-ras. Especificamente, entre estes pacientes, níveis de proteína IL-22 foram elevados no grupo negativo de K-Ras (84% vs. 60%) (P 0,001) (Figura 2A). Além disso, os níveis de ARNm de IL-22 no grupo positivo K-ras foram mais baixos em comparação com o grupo negativo de K-ras (P 0,001) (Figura 2B). A adição de Manumycin A a 10 μΜ para amostras normais e fase D paciente causou uma diminuição nos níveis de IL-22 os níveis de (P 0,001 para os níveis de proteína, P 0,01 para níveis de ARNm). (Figura 1B, 3A-B)

IL-23

o ELISA, ARNm, e análise de proteínas revelou que a K-ras pacientes positivos mostraram um aumento em IL-23 de expressão em comparação com o negativo de K-ras (P 0,01 para B1, P 0,05 para B2-D) e grupo controle saudável (P 0,001) (Figura 1C, 2A-B). Para determinar a correlação entre a presença de K-Ras e IL-23 de expressão, Manumycin A foi adicionado a amostras normais e Estádio D paciente e proteína IL-23 e os níveis de ARNm em K-ras foram determinados pacientes positivos (Figura 1C, 3A-B) . Os resultados mostram que a inibição de K-ras provoca uma diminuição significativa nos níveis de IL-23 os níveis de (P 0,001 para os níveis de proteína, P 0,01 para níveis de ARNm), estabelecendo assim uma correlação entre a K-ras e de IL-23 os níveis de

GM-CSF

Para investigar potenciais mecanismos de envolvimento de GM-CSF, nas diversas fases da carcinogénese do cólon, a expressão de GM-CSF foi monitorizada e quantificados, por ELISPOT, Western Blot, e RT- métodos de PCR. Para o GM-CSF ELISPOT, as células foram preparadas a partir de PBMCs isoladas de fresco e usada para a detecção de GM-CSF. Os resultados mostram um aumento gradual dos níveis de GM-CSF durante a progressão do cancro do cólon, especialmente na fase C2 e D (P 0,001) (Figura 4A, Figura S1). Além disso, a proteína GM-CSF e os níveis de ARNm foram significativamente maiores em K-RAS positiva, pacientes na fase D (p 0,001) (Figura 2A-B) em comparação com K-ras pacientes de controlo negativo e saudáveis, o que indica uma activação de GM-CSF induziu durante cólon progressão estágio do câncer tumorigênese (Figura 4A, a figura S1). Os resultados observados estão de acordo com descobertas recentes que indicam a importância de GM-CSF no K-ras de câncer de cólon positiva processos tumorigênicos (vide infra). Manumycin A foi adicionado a amostras de pacientes normais e fase D (Figura 4A) e de proteína GM-CSF e níveis de ARNm em K-ras foram determinados pacientes positivos (Figura 3A-B). Os resultados mostram que a inibição de K-ras provoca uma diminuição significativa em GM-CSF mRNA e os níveis de proteína (P 0,001 para os níveis de proteína, P 0,05 para níveis de ARNm), estabelecendo assim uma correlação entre as duas moléculas

(A), o GM-CSF ELISPOT de PBMC foi obtido a partir de pacientes antes da cirurgia. As células mononucleares foram estimuladas e foram investigados para a secreção de GM-CSF. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os resultados são apresentados como média ± DP dos diferentes grupos. (B) y-IFN ELISPOT de PBMC foi obtido a partir de pacientes antes da cirurgia. As células mononucleares foram estimuladas e foram investigados para a secreção de IFN-γ. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os resultados são apresentados como média ± DP dos diferentes grupos. Grande barra indica comparação entre estágio D do paciente e estágio D + amostras de tratamento Manumycin.

IFN-γ

A fim de examinar o efeito da mutação K-ras em IFN-γ durante as fases de progressão do cancro colo-rectal, determinou-se o nível de IFN-γ expressão. Como mostrado (Figura 4B, 2A-B, Figura S1), IFN-γ é regulada para baixo em pacientes de cancro do cólon em comparação com controlos saudáveis. Além disso, há uma diminuição significativa nos níveis de proteína e ARNm de IFN-y entre a K-ras negativas e K-ras indivíduos positivos (p 0,001), indicando, assim, o efeito de K-ras de sinalização em IFN-y a sub-regulação . Além disso, o tratamento com Manumycin A causou um aumento nos níveis de expressão de IFN-γ, como mostrado por Western Blot e experiências de RT-PCR (P 0,001 para os níveis de proteína, P 0,01 para níveis de mRNA) (Figura 3A-B). Os resultados sugerem um feedback K-ras mecanismo de sinalização em IFN-γ, que desempenha um importante papel na carcinogênese do cólon.

Manumycin uma supressão da viabilidade e crescimento celular de Caco-2 Células

os resultados observados mostram pela primeira vez que a ras inibidor Manumycin a reduz a viabilidade das células em células Caco-2 do cancro do cólon. O efeito desta forma específica de inibidor sobre a viabilidade das células de cancro do cólon foi examinado após incubação num meio contendo Manumycin A com concentrações na gama de 10-300 | iM, durante 24 h. As células incubadas em meio na ausência de Manumycin Um serviram como controlos. O emprego do ensaio MTT revelou que a inibição da viabilidade celular em todas as células de cancro de adenocarcinoma do cólon de Caco-2 testados ocorreu de um modo dependente da dose (Figura 5A-B). Em detalhe, a viabilidade celular diminuiu significativamente de 90% (em 10 μΜ) a 40% (em 300 μΜ) (P 0,001), em comparação com o controlo. Os padrões de inibição observada como uma função da concentração Manumycin Um revelar as propriedades antitumorais de inibidores de ras em K-ras induzidas sinalização do cancro do cólon.

(A) ensaio de MTT que mostra o efeito de Manumycin Um na viabilidade celular em cancro células Caco-2. As células foram tratadas com diferentes concentrações de Manumycin A durante 24 h. A viabilidade celular foi medida com um leitor de placas de ELISA a 570 nm. ampliação da imagem × 200. (B) Os resultados indicam que Manumycin A inibe a viabilidade das células de adenocarcinoma do cólon humano Caco-2 de uma forma dependente da dose. Os valores representam a média ± DP de três experiências independentes. Um Manumycin induz apoptose em (C) Caco-2 adenocarcinoma do cólon células cancerosas humanas. apoptose de células Caco-2 foi detectado utilizando o ensaio TUNEL de detecção a partir de Roche. concentrações Manumycin A: 10, 50, 100, 200, e 300 μΜ. A linha de células cancerosas foi exposto a Manumycin A a diferentes concentrações durante 24 horas e coradas. células apoptóticas vermelhos foram visualizadas usando um Carl Zeiss (Zeiss Europa) microscópio fluorescente. ampliação da imagem × 200. (D) Os gráficos representam os resultados quantitativos da apoptose.