Abstract

Alguns

estirpes de Escherichia coli

produzem toxinas cyclomodulins designados (CMS) que interferem com a ciclo de célula eucariótica de células hospedeiras, o que sugere uma possível ligação entre estas bactérias e cancros. Há relativamente poucos dados disponíveis sobre a colonização de tumores do cólon por cyclomodulin- e genotóxico produtoras de

E.

coli. Nós fizemos uma análise qualitativa e filogenética do associado à mucosa

E. coli

abrigar genes codificadores de cyclomodulin de 38 pacientes com câncer colorretal (CRC) e 31 com diverticulose. A funcionalidade destes genes foi investigado em culturas de células e a actividade de estirpes desprovidas de genotoxicidade do gene que codifica o CM conhecido foi investigada. Os resultados mostraram uma maior prevalência de phylogroup B2

E. coli

abrigar os genes produtores de colibatin em biópsias de pacientes com CRC (55,3%) do que naqueles de pacientes com diverticulose (19,3%), (p 0,01). Da mesma forma, uma maior prevalência de B2

E. coli

abrigar os genes que codificam CNF1-em biópsias de pacientes com CRC (39,5%) do que naqueles de pacientes com diverticulose (12,9%), (p = 0,01). Análise funcional revelou que a maioria destes genes eram funcionais. Análise da capacidade de

E. coli

de aderir a células epiteliais intestinal Int-407 indicaram que altamente aderente

E. coli

pertencia principalmente para phylogroups A e D, qualquer que seja a origem das cepas (CRC ou diverticulose), e que a maioria

E. estirpes de E. coli

pertencentes a phylogroup B2 exibido muito baixos níveis de aderência. Além disso, 27,6% (n = 21/76)

E. coli

desprovidas de genes codificadores de cyclomodulin conhecidos induzida danos no DNA

in vitro

, avaliada pelo teste do cometa. Em contraste com cyclomodulin produtoras de

E. coli

, estas estirpes pertencia principalmente para A ou D

E. coli

phylogroups, e exibiu uma diferença não significativa na distribuição de amostras de CRC e diverticulose (22%

relação

32,5%, p = 0,91). Em conclusão, cyclomodulin produtoras de

E. coli

pertencentes principalmente para phylogroup B2 colonizar a mucosa do cólon de pacientes com CRC

Citation:. Buc E, Dubois D, Sauvanet P, Raisch J, J Delmas, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) alta prevalência de Mucosa-Associated

E. coli

Producing Cyclomodulin e Genotoxin no cancro do cólon. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10.1371 /journal.pone.0056964

Autor: John R. Battista, Louisiana State University e A M College, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de maio de 2012; Aceito: 18 de janeiro de 2013; Publicação: 14 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Buc et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministère Français de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie, l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm U1071), l’Institut National de la Recherche Agronomique (USC-2018) e Ligue contre le cancer la. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é atualmente o terceiro câncer mais comum em homens e mulheres, e a quarta principal causa de morte por câncer em todo o mundo, com 1,2 milhões de casos estimados e 609.000 mortes estimadas por ano [1]. CRC esporádicos para cerca de 95% dos casos de colo-retal [2]. Fatores genéticos são geralmente pensado para representam cerca de 20% da causa do câncer com o ambiente contribuindo o risco remanescente de 80% [3]. CRC é, portanto, fortemente associada com exposições ambientais, incluindo as bactérias que contribuem significativamente para o ambiente do cólon. A evidência acumulada que mostra que a composição da microbiota intestinal humana influencia o estado de saúde do hospedeiro. disbiose microbial é observada em pacientes com CCR e tem sido relatada evidência de interações bacterianas em CRC para

Streptococcus bovis

,

Enterococcus spp.

,

Helicobacter pylori

,

Bacteroides fragilis

e

Escherichia coli

(para revisão ver [4]). Vários estudos demonstram claramente uma ligação entre mucosas aderente

E. coli Comprar e CRC. Estudos de pacientes com câncer no Reino Unido e na Alemanha revelou que associado à mucosa

E. coli

são mais frequentemente identificado em tecido do cólon de pacientes com adenocarcinomas que no de controles [5], [6]. Swidsinski

et al.

Informou que apenas 3% do cólon biópsias da mucosa de controles assintomáticos testadas foram positivas para

E.

Coli com um PCR universal bacteriana [5]. Em contraste, as biópsias de 92% dos pacientes com adenomas do cólon ou carcinomas bactérias abrigadas, com

E. coli

ser predominante em 70% dos pacientes [5]. Da mesma forma, Martin

et al., Achou que 70% dos pacientes com CCR teve bactérias associadas à mucosa, e que uma proporção significativa de bactérias pertenceu ao

E. coli

espécies. Curiosamente, Bronowski

et al.

Mostrou que alguns

E. coli

carregam genes de virulência previamente classificadas como específico para uropatogênica

E. coli

(UPEC) [7]. Tal

E. coli

podem desencadear a proliferação celular no trato intestinal [8], como pode ser visto com outras bactérias [9], [10].

E. coli é

as espécies Gram-negativas aero-anaeróbio predominantes da flora intestinal normal e participa na promoção da estabilidade da flora microbiana luminais e na manutenção da homeostase intestinal normais [11]. Como um comensal,

E. coli

coexiste com o seu hospedeiro mamífero em boa harmonia e raramente provoca doença. No entanto, algumas estirpes transportar uma combinação de genes de virulência que lhes permitem causar intestinal (INPEC, intestinal patogênica

E. Coli

) e extra-intestinal (ExPEC, extra-intestinal patogênica

E. Coli

) infecções (por comentários ver [12] – [14]). A análise filogenética mostrou que

E. coli

é composto por quatro grupos principais filogenéticas (A, B1, B2, e D) [15], [16]. estirpes patogénicas pertencem principalmente aos grupos B2 e D, enquanto a maioria das cepas fecais pertencem a grupos A e B1. Cepas de grupos B2 e D, muitas vezes carregam fatores de virulência que estão faltando no grupo A e estirpes B1 [17] – [19].

Entre

E. coli

fatores de virulência, várias toxinas, chamadas cyclomodulins, está atraindo crescente atenção porque são genotóxico e /ou modular a diferenciação celular, apoptose e proliferação (para revisão ver [4]). Citotóxica fator necrosante (CNF) ativa Rho GTPases, que leva a citoesqueleto alterações e afeta o ciclo celular. O factor de inibição de ciclo (CIF) alvo culinas Nedd8-conjugado para sequestrar as vias de sinalização da célula hospedeira [20], [21]. O colibactin genotoxin é um composto peptídico ribossomal policetido híbrido não-[22]. Suas máquinas biossíntese é codificada pelo

PKS

ilha genômica. Colibactin causa de DNA quebras de cadeia dupla e uma instabilidade cromossômica em células eucarióticas humanos [22], [23]. A toxina cytolethal distendendo (CDT) também induz danos ao DNA, provavelmente através da atividade DNAse, e uma enzima intimamente relacionado produzido pelo

Helicobacter hepaticus

promove a progressão da hepatite pré-maligna, lesões displásicas e aumenta a proliferação de hepatócitos, fornecendo a primeira evidência de que a CDT tem o potencial carcinogénico

in vivo

[24] – [26]

no presente estudo, comparou-se a prevalência de genes cyclomodulin- e codificando genotoxin na mucosa. -associated

E. coli

de espécimes de ressecção de CRCs e diverticulose. Também foi investigada a actividade genotóxica de associado à mucosa

E. coli

desprovido de genes codificadores de genotoxin conhecidas e sua capacidade de aderir a células epiteliais intestinais.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

A aprovação ética para o estudo foi concedido pela comissão de ética em pesquisa Clermont-Ferrand. Este IRB permitiu a renúncia de consentimento por escrito e aprovado o processo de obtenção de consentimentos verbais de indivíduos potenciais, porque a pesquisa não envolve procedimentos para os quais o consentimento escrito é normalmente exigidos fora do contexto de pesquisa e não apresenta nenhum risco de danos a indivíduos. As amostras biológicas foram recolhidas a partir de ressecções do cólon, que foram necessárias para o tratamento de pacientes. Os investigadores explicaram o estudo ao sujeito potencial verbalmente, fornecendo todas as informações pertinentes, tais como finalidade, procedimentos, riscos putativos. Na sequência desta explicação verbal, o sujeito potencial foi fornecido com uma folha de informações do estudo. Depois de permitir que o tempo potencialmente sujeitos ao ler a folha de informações do estudo, o investigador responderam todas as perguntas adicionais que o participante em potencial podem ter tido. Um acordo verbal para participar da pesquisa foi obtido em todos os pacientes incluídos no estudo. As datas de consentimento verbal foram rastreados de forma não-identificáveis.

Os pacientes

A fim de estudar amostras macroscópicas da ressecção de espécimes de cólon, comparamos pacientes com CRC e pacientes com diverticulose como um grupo sem câncer. Sessenta e nove pacientes foram estudados entre março de 2007 e novembro de 2009 no hospital universitário de Clermont-Ferrand, França. Trinta e oito tiveram CRC, e 31 tinham complicado diverticulose (Tabelas S1, S2, S3). Os pacientes do grupo CRC teve cancro do cólon não complicada e operável desenvolvido quer no cólon proximal (a partir do ceco para a flexura hepática do cólon ascendente) ou no cólon distai (cólon sigmóide). CRC do transversal ou o cólon descendente foram excluídos por causa de sua baixa ocorrência, e para evitar os riscos de viés. Em todos os casos, a operação consiste na ressecção segmentar do cólon envolvido pelo tumor com anastomose imediata sem desviar do estoma. Os pacientes com CCR complicado (obstrução, a perfuração ou infecção) foram excluídos do estudo. Pacientes do grupo diverticulose teve diverticulose envolvendo o cólon sigmóide e necessitou de cirurgia por causa de uma história de complicação (diverticulite recorrente, abcesso, peritonite). Foram excluídos pacientes com inflamação aguda ou crónica no momento da cirurgia, e aqueles com estenose. No caso de um ataque recente de diverticulite, antibióticos foram paradas pelo menos 3 semanas antes da cirurgia. A razão sexual foi 1,05 e 0,72 para pacientes com CCR e DIV respectivamente. A faixa etária foi de 35-95 anos para pacientes com câncer (idade média, 71 anos e idade média de 67 anos) e 34-81 anos para pacientes diverticulose (idade média, 58 anos e idade média, 60 anos). As amostras foram tomadas no cólon ressecado, no local dos tumores malignos para pacientes de CRC e na mucosa normal para pacientes diverticulose. A análise histopatológica confirmou as características neoplásicas das amostras em pacientes com CCR, e a falta de inflamação ou displasia em pacientes diverticulose. A série CRC composto 21 proximal e 17 amostras de cólon distai. fase TNM é relatado nas Tabelas S1 e S2. preparo intestinal foi de picossulfato de sódio oral ou polietilenoglicol oral, à noite antes da cirurgia. Todos os pacientes tinham recebido ressecção cefoxitina (2 g por via intravenosa) no momento da incisão e nenhum recebeu antibióticos nas 4 semanas antes da amostragem.

tratamento Amostra

As amostras de mucosa foram colocados em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril, pH 7,4 (PBS) e transportados em gelo para o laboratório. As amostras foram pesadas (50 a 100 mg de cada) e lavou-se cuidadosamente três vezes em 10 mL de PBS para remover a maior parte das bactérias fecais. Cada passo de lavagem foi seguido por centrifugação a 900g durante 5 minutos. As amostras foram, então, esmagados (Ultra-Turrax, IKA) e incubadas durante 15 minutos num rotor de tubo à temperatura ambiente na presença de Triton 0,1X. diluições de dez vezes do lisado foram então plaqueadas em ágar e ágar Drigalski cromogénico chromID CPS3® (bioMérieux), que permitem a identificação de

E.

coli.

E. coli

colónias foram recolhidas após 24 horas de incubação a 37 ° C e a identificação de bactérias foi confirmada com o sistema automatizado Vitek II® (bioMérieux). Quando possível um máximo de 96

E. coli

colónias por amostra foram recolhidos para a tipagem molecular. As bactérias foram subcultivados durante 24 horas a 37 ° C em placas de 96 poços em meio de Luria Bertani suplementado com 15% de glicerol e, em seguida, armazenada a -80 ° C.

A tipagem molecular e agrupamento filogenética

Dez colónias por amostra foram digitados com métodos moleculares para identificar o

E. coli

cepas (

E. coli

genótipos) colonizando as amostras. Foram utilizados dois métodos de genotipagem, uma sequência de “Enterobacterial repetitivo Intergenic Consenso” (ERIC)-PCR usando ERIC2 primário (5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 ‘) e um “Random Amplified Polymorphic DNA” (RAPD) – PCR utilizando o iniciador 1283 (5’-GCG ATC CCC A-3 ‘) [27], [28]. Uma estirpe representativa foi subsequentemente analisados ​​e armazenados a -80 ° C em meio de Luria-Bertani suplementado com 15% de glicerol.

E. coli

foram, então, classificados de acordo com o

E. coli

sistema uma colecção de referência (ECOR) [16] em grupos filogenéticas A, B1, B2 e D, usando uma técnica de PCR multiplex [29]. RS218 estirpe, o qual contém todos os genes alvo por PCR em multiplex, foi utilizado como controlo positivo.

Detecção e identificação de genes produtores cyclomodulin

Cyclomodulin que codifica os genes foram detectados por dot-blot DNA experiências de hibridação em todos os

E. coli

. As sondas foram obtidas por PCR como descrito anteriormente [30] (Tabelas S4 e S5), utilizando o kit de síntese de sonda de PCR DIG (Roche Applied Sciences, Switserland) de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de DNA de dois microgramas foram fixados para membranas de nylon carregadas positivamente por iluminação UV durante 20 min. A hibridação foi realizada com o kit de marcação e detecção de Roche (Roche Applied Sciences) como indicado pelo fabricante. Cada local foi verificada com uma sonda de gene 16S rRNA. O

PKS

ilha, que contém o agrupamento de genes produtores de colibactin, foi rastreada com uma sonda sobrepondo as

CLBK

e

clbJ

genes. O

CNF

genes foram detectados com uma mistura de sondas específicas para

cnf1

,

cnf2

, e

cnf3

. O

cdtB

genes foram detectados por duas experiências de hibridação com a

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV Comprar e

cdtB-I-cdtB-IV

misturas de sonda. O

CIF

gene foi detectado utilizando uma sonda específica interno. As sensibilidades e especificidades das sondas foram verificadas em cada membrana através da identificação de extratos de DNA de todas as estirpes de controlo cylomodulin. hibridações positivas da sonda com um cyclomodulin foram submetidos a ensaios de PCR de confirmação tal como anteriormente relatado [30]. A mistura reaccional continha 50 ng de amostra de ADN, 0,2 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (dNTP), 0,4 pM de cada iniciador, MgCl 2 3 mM e 1,0 U de DNA polimerase RedGoldStar (Eurogentec, Bélgica) em tampão de reacção correspondente. Primers localizadas em 5 ‘e 3’ regiões da ilha pks (os genes clbA e clbQ) foram utilizados para confirmar a presença completa da ilha produtoras colibactin.

ensaios citopáticos

HeLa células (derivadas de cancro do colo do útero) adquiridos a partir de ATCC (ATCC CCL-2

TM) foram mantidas numa atmosfera contendo 5% de CO2 a 37 ° C em meio apropriado. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de vitelo (Lonza, Walkersville, MD EUA), 1% de L-glutamina (Life-Technologies), 200 U de penicilina, 50 mg de estreptomicina, 0,25 mg de amphoterocin B por litro, e 1% de HEPES solução salina tamponada (Lonza). Elas foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos em 5 × 10

4 células /poço, durante 24 H. foram investigados os efeitos citopáticos do CNF e CDT em todas as linhagens de células-lisado, tal como previamente descrito [31]. Resumidamente, os efeitos de CDT e CNF foram detectados por um ensaio de célula que interagem com lisado. Após 48 H cultura a 37 ° C com agitação em meio de caldo de Luria-Bertani, as células bacterianas foram sonicadas e estéril filtrada separadamente utilizando filtros de 0,22 mícrons de tamanho de poro. As células HeLa foram tratados com os lisados ​​estéreis sonicadas (concentração final de proteína: 4 ug /ml) até à análise. Os efeitos de colibactin e Cif foram detectados por um ensaio de célula-interagindo-bactéria, baseada na interacção entre as células HeLa e as bactérias. Durante a noite culturas de caldo de Luria-Bertani de

E. coli

foram lavadas três vezes e diluídas em meio de interacção. culturas de células HeLa foram infectadas a multiplicidades de infecção (MOI, o número de bactérias por célula no início da infecção) de 100 e 200. As células foram lavadas 4 h após a inoculação e incubadas em meio de cultura de células com 200 ug /ml de gentamicina até à análise . Após 72 h de incubação a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5%, o meio foi removido por três lavagens de as monocamadas de células HeLa. As alterações morfológicas características da CDT, CNF, colibactin e Cif foram observados após coloração com Giemsa. A identificação foi baseada na capacidade de qualquer um lisado bacteriano contendo CNF e CDT ou bactérias vivas produtoras colibatin inteiros e CIF para induzir um efeito citopático em células epiteliais analisados ​​em 3 dias após a infecção. Colibactin, CDT e CIF induziu efeitos citopáticos, como evidenciado por núcleos aumentados e distensão célula (megalocitose), enquanto a CNF induzida multinucleação, e alargamento de células HeLa. Multinucleação é observado em 50% das células infectadas pelo CNF-producing bacteria e em cerca de 10% de células não infectadas ou de células infectadas com outras estirpes produtoras de CM. Para CNF e CDT, o efeito citopático só é observável com lisados ​​bacterianos. Em contraste, para colibactin e CIF, de contacto entre as bactérias e as células hospedeiras é necessário. A detecção de alfa-hemolisina foi realizada para todas as estirpes estudadas por crescimento durante a noite a 37 ° C em Columbia sangue de ovelha (5%) de agar (Oxoid, Dardilly, França).

E. coli

25922 (ATCC) foi utilizada como estirpe de referência para a produção de alfa-hemolisina.

eletroforese em gel de célula única

A atividade genotóxica de

E. coli

desprovidas de genes codificadores de CM conhecidos foram investigados por eletroforese em gel de célula única (teste do cometa). culturas de células HeLa foram infectadas a uma MOI de 500 com

E. coli

cultivadas durante a noite em caldo de Luria-Bertani. As células foram lavadas duas vezes 3 h após a inoculação e foram incubadas durante a noite em meio de cultura de células com 200 ug /ml de gentamicina, a 37 ° C sob 5% de CO

2 atmosfera. Eles foram, em seguida, lavou-se com meio PBS e combinada com 0,5% de ponto de fusão de baixo ponto de agarose (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, França) dissolvida em PBS estéril a 37 ° C. A mistura de células-agarose foi aplicada a uma lâmina de microscópio pré-revestidos com 1,5% de agarose-ponto de fusão normal (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) dissolvidos em PBS estéril a 37 ° C. Uma lamela de cobertura foi aplicada e deixou-se solidificar a 4 ° C durante 60 min. As lâminas foram então colocadas em 50 mL de tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, 2,5 M de NaCl, EDTA 100 mM contendo 1% de Triton X-100, 10% de DMSO, pH 10) durante 2 h a 4 ° C no escuro. As lâminas foram imersas em tampão de electroforese (EDTA mM de NaOH a 1 mM 300 de pH 13) durante 1 h a 4 ° C e um campo eléctrico foi aplicada (1 V /cm) durante 40 minutos. As lâminas foram neutralizadas com 400 mM Tris-HCl pH 7,5 e seca. 40 ul de uma diluição 1: 10000 de SybrGreen foi aplicada directamente à corrediça. As células individuais ou cometas foram vistos por Zeiss Axioplan2 microscópio de fluorescência. O B2

E. coli

estirpe IHE3034 e

E. pBACpks coli

DH10β foram usados ​​como controles positivos [22]. O B2

E. coli

estirpe IHE3034 Δ

CLBP Comprar e

E. coli pBAC

DH10β foram utilizados como controlos negativos [22].

Ensaio de aderência de

Int-407 células (derivadas de jejuno humano embrionário intestinal e íleo) adquirido a partir de ATCC (ATCC CCL -6

TM) foram mantidas numa atmosfera contendo 5% de CO2 a 37 ° C em meio apropriado. Elas foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de vitelo (Lonza, Walkersville, MD EUA), 1% de L-glutamina (Life-Technologies), 200 U de penicilina, 50 mg de estreptomicina, 0,25 mg de amphoterocin B por litro e 1% de HEPES solução salina tamponada (Lonza). Resumidamente, as células foram semeadas a uma densidade de 2 × 10

5 células /cm2 em placas de cultura de 48 H. A infecção foi realizada com uma multiplicidade de infecção de 10 bactérias por célula. As células infectadas foram centrifugadas a 900 g durante 10 min a 25 C e colocada a 37 ° C durante 3 H. As células foram lavadas três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,2). As células epiteliais foram então lisadas com 1% de Triton X-100 (Sigma) em água desionizada. As amostras foram diluídas e plaqueadas em meio de Luria-Bertani (LB) placas de agar para determinar o número de UFC correspondente ao número total de bactérias associadas a células. Cepas

E. coli K12

e

E. coli

LF82 foram utilizados como controle negativo e positivo, respectivamente [32]. Os resultados são expressos como número de bactérias aderentes por célula depois de um período de infecção 3 H.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o exato de Fisher e qui-quadrado. Para comparações de múltiplos grupos, um teste inicial do qui-quadrado para heterogeneidade foi feito, e apenas se este rendeu um valor de P 0,05 foram as comparações de pares individuais testados

Resultados

E. coli

em câncer de cólon e diverticulite amostras

A análise da

E. coli

estirpes indicou que o número de amostras, sem

E. coli

foi significativamente mais elevada em pacientes diverticulose (19,4%, n = 31/6) do que naqueles com CRC (2,6%, n = 1/38), p = 0,04 (Tabela 1). Muitos espécimes de cólon abrigava apenas um

E. coli

genótipo. Este foi observada em 42,1% (n = 16/38) das amostras de CRC e em apenas 25,8% (n = 8/31) de diverticulose, mas a diferença não foi significativa (p = 0,12). A maioria das estirpes isoladas a partir de CRC pertencia ao phylogroup B2 (73,7%, n = 28/38) em contraste com as isoladas de diverticulose (41,9%, n = 13/31), p 0,01 (Quadro 2). Não houve diferença significativa no

E. Observou coli

distribuição phylogroup, inclusive para B2

E. coli

estirpes isoladas de proximal (82,4%, n = 14/17) e os tumores do cólon distai (66,7%, n = 14/21), P = 0,23 (Quadro 2). No geral

E. coli

cepas pertencentes aos tumores do cólon B2 phylogroup colonizados com mais frequência do que eles fizeram amostras de diverticulose.

Distribuição de genes CM-codificação de acordo com

E. coli

grupos filogenéticos

A distribuição de genes que codificam CM-em

E. estirpes de E. coli

é mostrado na Tabela 3 e Tabelas S1, S2, S3. O traço mais frequente foi a colibactin-encoding

PKS

ilha (80% da CM produtoras de

E. Coli

, n = 28/35 e 24,1% do total

E. Coli

estirpes, n = 28/116). Todas as estirpes associadas à mucosa do cólon de pacientes com CRC ou diverticulose abrigar o colibactin-encoding

PKS

ilha pertencia a phylogroup B2 (p 0,001 para B2 grupo

contra

grupos A, B1 e D, individuais ou combinados). Além disso, 16,4% (n = 19/116) de cepas possuíam o

CNF

gene; destes, apenas um era

cnf2

-positivo e nenhum era

cnf3

-positivo, indicando que estas estirpes não eram de origem animal [33], [34]. Todas

cnf1

estirpes -harboring pertencia também para phylogroup B2, e foi responsável por 36,7% (n = 18/49) das cepas deste phylogroup. Quanto ao

PKS

ilha, a associação

cnf1

com phylogroup B2 era forte (p 0,001 para o grupo B2

contra

grupos A, B1 e D, individuais ou combinados ) e 33% (n = 16/49) das cepas B2 possuía tanto o

PKS

ilha e do

cnf1

gene (p 0,001 para B2 do grupo versus grupos a, B1 e D , individuais ou combinados), como observado anteriormente [30], [35]. Todos, menos três estirpes albergando

cnf1

gene exibiu o fenótipo alfa-hemolítica. No entanto, os três não-hemolítica

cnf1

-positivas abrigavam o gene

hlyC

. O

cdtB

genes foram observadas em seis linhagens. Embora quatro dos seis

CDT

-positivas pertencia a phylogroup B2, não foi observada associação significativa com um grupo filogenético particular, mesmo com as diferentes

cdtB

subtipos de genes.

cdtB-I

/

genes cdtB-IV

(n = 5) foram observados com maior frequência do que os do grupo de gene

cdtB-II-cdtB-III-cdtBV

(n = 1). A única

CDT-III

-positivo estirpe também abrigou o

cnf2

gene, uma combinação de genes frequentemente relatados no plasmídeo pVir e, principalmente visto em cepas de origem bovina [36], [37 ]. O

cdtB

genes não mostrou nenhuma associação particular com o colibactin-encoding

PKS

ilha ou o

cnf1

gene. Desde

genes cdt

têm sido extensivamente estudado em produtora de toxina Shiga

E. coli

(STEC) [38] – [40], foi decidido investigar

cdtB

-positivo estirpes de

STX

e

eae

genes. Não

STX

ou

eae

gene foi detectado em

cdtB

-positivas. O

CIF

gene foi detectado em três estirpes que pertenciam a phylogroups A (n = 1) e B1 (n = 2) e abrigava há outros genes CM-codificam. CIF é um efetor do sistema de secreção do tipo 3 codificado pelo locus de apagamento enterócitos (LEE) observada em enteropatogênica

E. coli

(EPEC) e enterohemorrhagic

E. coli

(EHEC) [41], [42] e as três estirpes positivas neste estudo possuíam o

eae

gene mas nem

stx1

nem

genes stx2

e, portanto, pertencia ao patótipo EPEC.

detecção fenotípica de cyclomodulins

Cell-lisado-interagindo testes foram utilizados para investigar CNF e CDT produção em todas as estirpes. A detecção de colibactin e produção CIF, que exigem testes de célula-interagindo-bactéria, só foi possível nas estirpes não hemolíticas, porque as estirpes produtoras de hemolisina, em contraste com os lisados ​​correspondentes, induzida morte celular rápida. Os resultados são dados nas Tabelas S1, S2, S3. Colibactin, CDT e CIF induziu efeitos citopáticos, como evidenciado por núcleos aumentados e distensão célula (megalocitose), enquanto a CNF induzida multinucleação em ≥50% de células e aumento das células HeLa (Figura 1). Para CNF e CDT, o efeito citopático foi apenas observado com lisados ​​de bactérias, ao passo que foi necessário um contacto entre as bactérias e as células hospedeiras para colibactin e CIF, tal como anteriormente descrito (Figura 1) [22], [31], [42]. A observação de um efeito citopático foi associada à presença de genes que codificam cm. Três estirpes albergando um

PKS

ilha isolada de diverticulose, distal e amostras de cólon proximal não induziu qualquer efeito citopático. Uma cepa isolada de uma amostra diverticulose tinha um não-funcionais

cnf1

gene e dois

CDT

-positivas não mostrou nenhum efeito citopático. Para a abrigar tensão

cnf2

e

CDT

-III genes, 50 multinucleações célula% atestaram a produção de CNF e da ampla megalocitose atribuída à produção CNF ou sua combinação com CDT-III . Foi observado um efeito citopático para as linhagens portadoras do

CIF

gene. No geral, a maioria dos genes que codificam CM-eram funcionais, nomeadamente

CNF

e

CIF

(93% e 100%, respectivamente).

Para CNF e CDT, o efeito citopático só é observável com lisados ​​bacterianos. Em contraste, para colibactin e CIF, um contacto entre as bactérias e as células hospedeiras é necessário. Colibactin, CDT e CIF induzida efeitos citopáticos como visto por núcleos aumentados e distensão celular (megalocitose), enquanto CNF induzida multinucleações e ampliação de células HeLa.

Distribuição de genes CM-codificação de acordo com a origem espécime e o phylogroupe

os resultados são mostrados na Tabela 4, Figura 2 e nas Tabelas S1, S2, S3. Vinte e cinco CRC espécimes entre 38 (65,8%) continham CM-positivo

E. coli

e apenas 6 espécimes diverticulose entre 31 (19,4%), indicando que as estirpes albergando CM-se, preferencialmente associada com CRC (p 0,01). Esta diferença foi associada a um elevado número de B2 CM-positivo

E. coli espécimes

CRC em comparação com a observada em amostras de diverticulose (Figura 2). Deste modo, as estirpes albergando colibactin-codificação

PKS

ilha estavam presentes em 55,3% de amostras de CRC (N = 21/38) e apenas em 19,3% de amostras de diverticulose (n = 31/6), o que indica que

PKS

estirpes positivas foram significativamente (p 0,01) mais prevalente no CRC. Em menor grau,

CNF

e

CDT

positiva

E. coli

foram significativamente (p≤0.02) mais prevalente no CRC do que nas amostras de diverticulose. Estas diferenças foram principalmente devido à alta prevalência de

PKS Restaurant -,

CNF viajantes – e

CDT

-positivo

E. coli em amostras

CRC distais em comparação com a de espécimes diverticulose (p≤0.01). No seu conjunto, estes resultados indicam que a CM-positiva

E. distribuição coli

varia de acordo com a amostra de origem.

A,

E. coli

(n = 70) isoladas de amostras de CRC (n = 38), e B,

E. coli

cepas (n = 46) isoladas de amostras de diverticulose (n = 31).

genotoxicidade dos

E. coli

desprovido de genes

Nós investigamos se

E CM-codificação. coli

desprovida dos genes que codificam CM conhecidos pode induzir danos no ADN em células hospedeiras. Usando HeLa células cultivadas, a genotoxicidade de estirpes foi investigado por uma única célula de ensaio de eletroforese em gel (ou teste do cometa), a técnica state-of-the-art para a detecção de danos ao DNA causados ​​por genotoxinas químicos. Um total de 76 clínicas

E. estirpes de E. coli foram investigados

; 15 originado de câncer de cólon proximal, 21 por câncer de cólon distal e 40 de diverticulose. Estas estirpes pertencem a A (n = 29), D (n = 21) e phylogroups B2 (n = 17). Curiosamente, 27,6% (n = 21/76) do

E. estirpes de E. coli

desprovidas de genes que codificam CM conhecidos induziu a formação de cometas, que são típicos de danos no ADN da célula hospedeira (Figura 3 e Tabelas S1, S2, S3). Além disso, em contraste com CM produtoras de

E. estirpes de E. coli

, que pertencem principalmente à phylogroup B2, estas estirpes positivas cometa pertencia principalmente a A (52%, n = 11/21) e D (29%, N = 6/21) phylogroups. Cometas foram observados com 13 cepas (32,5%) entre 40 isolados de pacientes com diverticulose, e com 8 cepas (22%) entre os 36 em pacientes com CCR. A distribuição destas estirpes genotóxicos putativas nas amostras foi, portanto, diferente de estirpes CM-codificam.

danos do ADN não foi detectada em células HeLa infectadas com o

E.