Abstract
Fundo
Os pacientes diagnosticados com câncer metastático têm prognóstico quase uniformemente pobres. Os tratamentos disponíveis para pacientes com doença disseminada usualmente não são curativos e têm efeitos secundários que limitam a terapia que pode ser dada. Um tratamento que é selectivamente tóxico para os tumores se maximizar os efeitos benéficos da terapia e minimizar os efeitos colaterais, potencialmente, permitindo um tratamento eficaz a ser administrada.
Métodos e Descobertas
postulado que o tumor-trópico propriedade de células estaminais ou células progenitoras pode ser explorada para proporcionar selectivamente um gene terapêutico para tumores sólidos metastáticos, e que a expressão de um transgene em loci adequados tumor pode mediar a cura da doença metastática. Para testar esta hipótese, foram injectados HB1.F3.C1 células transduzidas para expressar uma enzima que activa o pró-fármaco eficaz anti-cancro da CPT-11 por via intravenosa em ratinhos portadores de tumores de neuroblastoma disseminadas. As células HB1.F3.C1 migrados seletivamente para locais de tumor, independentemente do tamanho ou localização anatômica dos tumores. Os ratinhos foram então tratados sistemicamente com CPT-11, e a eficácia do tratamento foi monitorizada. Os ratinhos tratados com a combinação de células que expressam a enzima HB1.F3.C1 CPT-11 de activação de pró-fármaco e esta produziu sobrevivência livre de tumor de 100% dos ratinhos de 6 meses (
P
0,001 em comparação com grupos de controle).
Conclusões
a nova e significativa conclusão deste estudo é que ele pode ser possível explorar a propriedade tumor-trópico de células-tronco ou progenitoras para mediar eficaz, tumor terapia selectiva para tumores metastáticos, para o qual não há tratamentos curativos toleradas atualmente disponíveis
Citation:. Aboody KS, Arbusto RA, Garcia E, Metz MZ, Najbauer J, Justus KA, et al. (2006) desenvolvimento de uma abordagem Tumor-seletiva para tratar o cancro metastático. PLoS ONE 1 (1): e23. doi: 10.1371 /journal.pone.0000023
Editor do Academic: Hans Clevers, Universidade de Utrecht, Holanda
Recebido: 08 de agosto de 2006; Aceito: 10 de agosto de 2006; Publicação: 20 de dezembro de 2006
Direitos de autor: © 2006 Aboody et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of /Instituto de Saúde Nacional do Câncer (CA113446, CA79763, CA76202 e CA21765); . Fundação Pare o cancro, Phi Beta Psi Sorority, The Rosalinde e Arthur Gilbert, Fundação Neidorf Família, da Fundação Marcus, e instituições de caridade associadas sírios libaneses Americanos (Alsac)
Conflito de interesses: Os autores declararam que não há interesses concorrentes existe.
Introdução
o neuroblastoma é o tumor sólido extracraniana mais comum em crianças. Tipicamente, os pacientes diagnosticados com doença de alto risco demonstrar uma boa resposta inicial à terapia, mas como muitos como 80% desses pacientes recaída com doença metastática refratária à terapia. Tal como outros tumores sólidos, quando neuroblastomas metástases, que são muito difíceis de tratar, e a maioria das crianças com neuroblastoma metastático morrem da doença [1] – [3]. Os tratamentos disponíveis têm eficácia anti-tumoral, mas também produzem efeitos colaterais indesejáveis para o tecido normal, o que limita o tratamento que pode ser administrada. São necessárias abordagens inovadoras e eficazes para o tratamento de neuroblastoma
A abordagem descrita neste estudo é baseado na exploração da propriedade tumor-trópico de HB1.F3.C1 células [4] – [16]. emitir agente terapêutico eficaz selectivamente aos tumores. O objetivo específico do estudo foi mostrar que a administração intravenosa de células HB1.F3.C1 expressam o (irinotecano) carboxilesterase CPT-11 -activating coelho enzima (RCE) iria aumentar significativamente o efeito antitumoral de doses toleradas de CPT-11 em camundongos portadores de tumores de neuroblastoma divulgados. A abordagem descrita pode também ser adaptado para desenvolver um tratamento para os pacientes com outros tipos de tumores sólidos metastáticos.
células neurais estaminais (NCCC) ou células progenitoras (NPCs) e células estaminais mesenquimais (MSCs) foram recentemente investigada como veículos de entrega para o tratamento de xenoenxertos subcutâneos, bem como para o tratamento de tumores no sistema nervoso central ou nos pulmões de modelos pré-clínicos. Este é o primeiro estudo que tentam explorar a notável tumor-tropismo destas células para desenvolver tratamentos para tumores sólidos metastáticos, disseminadas. Uma vez que não há tratamentos eficazes disponíveis para a maioria dos tumores metastáticos, demonstrando que estaminais ou progenitoras células de origem fetal ou adulto pode ser utilizado para melhorar o prognóstico de pacientes com doença metastática fatal seria altamente significativa.
A linha celular utilizada neste estudo (HB1.F3.C1) foi derivada a partir de células fetais telencéfalo. As células primárias foram imortalizadas por inserção retroviral da v-
myc
gene que foi necessário para sustentar o seu potencial de replicação [17]. Após a imortalização, as células HB1.F3.C1 replicar
In vitro
para formar células filhas idênticas ou podem ser induzidas a diferenciarem-se em outras células de linhagem neuronal, exibindo assim características de ambas as células estaminais e as células progenitoras. Desde HB1.F3.C1 células administrados sistemicamente migrar para e localizar
in vivo
em locais de patologia incluindo tumores, nos propusemos a explorar essa propriedade para distribuir selectivamente RCE para ativar o pró-fármaco anticancerígeno CPT-11 [18] – [20]. Colocámos a hipótese de que o aumento da conversão de pró-fármaco presente no seu metabolito activo (SN-38) em locais de tumores que aumentam a actividade antitumoral selectiva. Nós administrada por via intravenosa células HB1.F3.C1 adenovírus-transduzidas que expressam uma forma segregada de RCE a ratinhos portadores neuroblastoma disseminado. Os ratinhos foram então tratados sistemicamente com CPT-11 e sobrevivência a longo prazo dos animais foi monitorizado. Os resultados obtidos sugerem que a nova enzima /pró-droga abordagens para a terapia com células-tronco ou progenitoras, como veículos de entrega pode ter utilidade no tratamento de câncer metastático.
Métodos
Linhas de tumor de células
As três linhas de células de neuroblastoma humano utilizadas neste estudo foram NB-1691, NB-1643, e SK-N-AS [21], [22]. Estas linhas celulares foram obtidas a partir do Grupo de Oncologia Pediátrica e da American Type Culture Collection e refletem diferentes fenótipos e genótipos de neuroblastoma: N-
myc
amplificada, N-
myc
não amplificado /sobre-expresso, N-
myc
não amplificado expressão /baixo nível,
MDM2
amplificados e diferentes proporções de nuclear /p53 citoplasmática. Cada tipo de experiência detalhado abaixo foi feito com todas as três linhas de células; resultados de experiências representativas estão apresentados. Três linhas de células de neuroblastoma foram utilizados para demonstrar que os resultados observados não estavam limitados a uma única linha de células; resultados semelhantes foram observados com todos os três linhas de células. linhas de células de tumor foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 10% de CO
2.
HB1.F3.C1 Linha Celular
O HB1. F3.C1 linha celular é uma linha celular clonada multipotentes que foi gerado por células obtidas a partir do telencéfalo de um feto humano de gestação de 15 semanas de imortalizar, utilizando um retrovírus que codifica a V-
myc gene
[17] , [23]. As células primárias foram obtidos de acordo com as Diretrizes da Anatomia Patológica do Departamento de Vancouver General Hospital, com a permissão de usar tecido fetal concedido pelo Comitê de Pesquisa Clínica Envolvendo Seres Humanos da Universidade de British Columbia. HB1.F3.C1 é uma estabelecido, bem caracterizada, linha celular estável [23] – [27]. HB1.F3.C1 células auto-renovar
In vitro
, são não-tumorigénica, e são multipotentes em que elas podem ser induzidas a diferenciar-se em neurónios, oligodendrócitos, astrócitos e [17]. A utilização desta linha de células contornado o problema significativo de disponibilidade limitada de grandes quantidades de células primárias e maximizada reprodutibilidade entre os experimentos. A linha celular foi cultivada em DMEM com 10% de FCS a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 10% de CO
2.
transdução de células para expressar CRE HB1.F3.C1
adenovírus deficientes na replicação que expressa uma forma segregada de CRE sob o controlo do promotor de citomegalovírus (CMV) (AdCMVrCE) foi construído usando métodos padrão, tal como descrito anteriormente [18], [20], [28]. HB1.F3.C1 células foram co-cultivadas com AdCMVrCE durante 24 horas antes da injecção intravenosa. O ensaio de actividade de enzima utilizada para quantificar o nível de expressão de CRE por HB1.F3.C1 células transduzidas com adenovírus, também tem sido relatado previamente [20].
Migração HB1.F3.C1 celular, Injection and Localization
para examinar se as células HB1.F3.C1, injectada por via intravenosa, migram para focos tumorais disseminada em ratinhos, as células de tumor de neuroblastoma foram injectados intravenosamente nas veias da cauda de ratos e deixou-se semear e desenvolver tumores durante dois meses. células HB1.F3.C1 (2 × 10
6) foram então injectadas
via
a mesma rota e os órgãos foram colhidas 3-4 dias mais tarde para avaliar a migração para tumores macroscópicos e microscópicos.
Para experiências terapêuticas, HB1.F3.C1 células foram administrados 2 semanas a seguir à injecção de células de neuroblastoma. Neste ponto do tempo, os tumores são microscópicos e indetectável por olho ou pelo
in vivo
imagem. Consistente com o início do tratamento neste ponto de tempo, propomos que a eventual utilidade clínica mais provável da abordagem descrita será a erradicar a doença residual mínima após a terapia convencional. Este protocolo experimental reflete mais diretamente que a aplicação potencial.
Em ambos migração e estudos terapêuticos, 2 × 10
6 HB1.F3.C1 células transduzidas com adenovírus com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 foram pré-marcado com CM-Dil (clorometilbenzamido-1,1′-dioctadecil-3,3,3 ‘, 3’-tetramethylindocarbocyanine perclorato, Molecular Probes, Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então lavadas 3 vezes com PBS e injectadas na veia da cauda de ratinhos portadores de tumor. CM-DII foi escolhido porque é não-difusível, em virtude da sua ligação aos tióis celulares covalente, e tem sido mostrado para ser adequado para a rotulagem e
In vivo
a identificação de células durante pelo menos 10 semanas [29] , [30]. Em experimentos incluídos neste trabalho, camundongos injetados com células CM-Dil-marcadas foram colhidas 3-4 dias após a rotulagem e injeção.
Es1
e Combinada imunodeficientes (SCID) Severe esterase deficiente
O plasma de ratinhos SCID contém níveis elevados de uma carboxilesterase roedor que activa do CPT-11 [31], [32]. Por isso, foram utilizados camundongos SCID esterase com deficiência para todos os
In vivo
estudos terapêuticos [33]. Estes animais têm níveis de esterase no plasma comparáveis às do plasma humano. Os ratos foram alojados em uma instalação acreditados-AALAAC e receberam comida e água ad libitum.
RT-PCR /PCR
A medula óssea foi colhida a partir de tíbia de ratos normais e portadores de tumor, e o ARN foi extraído para a detecção de RT-PCR da tirosina hidroxilase (TH), um marcador de células de neuroblastoma. O DNA foi extraído a partir de uma alíquota separada de medula óssea para a PCR do V-
myc gene para identificar HB1.F3.C1 células. As sequências dos iniciadores e condições de RT-PCR para TH foram publicados anteriormente [21]. Métodos padrão foram utilizados para v-
myc
amplificação, utilizando um iniciador directo de 5′-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 ‘e um iniciador inverso de 5′-AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3’, com um passo de recozimento de 62,5 ° C durante 1 minuto para 30 ciclos. O controlo positivo para TH foi de RNA extraído de células NB-1691, e para a V-
myc gene era de DNA a partir de células HB1.F3.C1. Os controlos negativos não continha RT ou nenhum DNA, para TH e v-
reações myc
, respectivamente.
histoquímica, imuno-histoquímica e imunofluorescência imagem
Organs foram colhidas, fixadas em 4 % de paraformaldeído /PBS, pH 7,4 e crioprotegido em 30% de sacarose. Os tecidos fixados foram embebidos em OCT, criosseccionada em série (10 uM), descongelar-montadas em lâminas de vidro e armazenado seco a -20 ° C. Para o rastreio histológica de rotina, as secções de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina por métodos convencionais.
Presença de células HB1.F3.C1 em loci do tumor de neuroblastoma ou em tecido normal foi examinado utilizando microscopia de fluorescência. Em secções preparados como detalhado acima, os núcleos de todas as células foram coradas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol; Sigma Biochemical, St. Louis, MO; fluorescência azul), e detectados utilizando filtros de epifluorescência de excitação /emissão de 340 -380 /420 nm (LP) (UV-2A, Nikon). HB1.F3.C1 células, marcadas com CM-Dil (fluorescência vermelha), foram detectados usando filtros de excitação /emissão de 540-580 nm e 600-660 nm (Y-2E /C), utilizando um microscópio Nikon Eclipse TE2000-L (Nikon Instruments, Melville, NY), equipado com uma câmera digital SPOT RT Slider (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI). Para detectar tumores de neuroblastoma humano em tecidos de rato, foi realizada a coloração imuno-histoquímica utilizando um anticorpo monoclonal de ratinho que reconhece a proteína mitocondrial humano (Chemicon, Temecula, CA). As secções foram pós-fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 min, lavadas, permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 /PBS, 30 min e incubadas em solução de bloqueio (BSA a 5% + 3% de soro normal de cavalo + 0,1% de Triton X-100 , 1 h). As secções foram então incubadas sequencialmente com anticorpo primário (diluição 1:100) durante 16 h a 4 ° C, o anticorpo secundário IgG anti-ratinho biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 2 horas, e avidina-FITC (Vector Laboratories) durante 1 hora. As secções de tecido foram contrastadas com DAPI e montadas com meio de montagem fluorescente (DAKO). A fluorescência FITC foi detectado pelo filtro de epifluorescência (excitação 465-495 nm, 515-555 nm de emissão; B-2E /C).
Para a avaliação histológica de rotina da presença de tumores em vários órgãos, cortes de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina. As secções adjacentes foram processadas para imuno-3,3′-diaminobenzidina (DAB) como coloração semelhante tecidos transformados para coloração por fluorescência, excepto que após permeabilização, peroxidases endógenas foram extinta com 0,3% de peróxido de hidrogénio /PBS durante 30 min. reactividade de anticorpos para a mitocôndria humana foi posteriormente detectado usando um Vectastain ABC
kit Elite (Vector Laboratories) e um Kit Peroxidase Substrate (Vector Laboratories) de acordo com as instruções do fabricante.
baixa e alta a ampliação das imagens foram obtidas usando uma Nikon Eclipse TE2000-L microscópio (Nikon Instruments, Melville, NY) equipado com iluminação de campo brilhante e fluorescência. As imagens foram gravadas e armazenadas usando software SPOT Avançado e Adobe Photoshop.
Modificado celular Boyden Câmara Migration Assay
ensaios de câmara de Boyden modificadas foram usadas para avaliar a
in vitro
tropismo de células HB1.F3.C1 a meios condicionados de células tumorais ou para controlar meios, usando métodos padrão. Resumidamente, as células HB1.F3.C1 transduzidas com um MOI de 0, 5, 10 ou 20 AdCMVrCE foram tratadas com tripsina, lavadas e ressuspensas em DMEM contendo 5% de BSA. Células (3 x 10
4 células /100 uL) foram colocadas em câmaras superior e meio condicionado por células de neuroblastoma em câmaras inferiores. cell-condicionado neuroblastoma médio em ambas as câmaras superiores e inferiores compreendido o controle quimiocinese sem um gradiente quimioatrativo. As células foram deixadas migrar durante 4 horas numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO
2. O número de células migradas HB1.F3.C1 na câmara inferior de cada poço foi quantificada utilizando CyQUANT GR corante fluorescente (Chemicon) e um leitor de fluorescência de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os ensaios foram realizados em triplicado.
Os estudos em animais
neuroblastoma disseminada foi produzido por injecção de 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, ou de células SK-N-AS para o veias da cauda de ratos. Tipicamente estes ratos exigem a eutanásia -75 dias após injecção de células de neuroblastoma. tumores brutas em múltiplos órgãos são visíveis na necropsia. Este modelo de neuroblastoma metastático tem sido bem caracterizada e é altamente reprodutível em relação ao curso da doença e o envolvimento de órgãos [34]. Além disso, o modelo recapitula o padrão clínico de neuroblastoma metastático em que os tumores se desenvolvem em loci múltiplos, incluindo a glândula supra-renal, medula óssea e fígado.
Cada grupo de tratamento incluiu 10 ratinhos, monitorizados diariamente para a presença de doença ou problemas de saúde. O calendário semanal de administração de células HB1.F3.C1 e CPT-11 (7,5 mg /kg) é ilustrada na Figura 8. Este regime foi administrado durante 2 semanas consecutivas, seguido de um período de repouso de 2 semanas e, em seguida, uma outra 2- claro semana de terapia. Todos os protocolos animais foram aprovados pela City of Hope ou pesquisa das crianças do St. Jude Hospital IACUC. Quando os ratos pareciam estar em desconforto ou sofrimento, a julgar pelo pessoal de cuidados de animais independentes, sem conhecimento do projeto do protocolo, os animais foram sacrificados. Todos os ratos sacrificados foram verificados como portador de tumor por necropsia. O endpoint para o estudo terapêutico foi a sobrevivência a longo prazo
células SK-N-AS (5 × 10
5) transduzidas para expressar luciferase foram injetadas nas veias da cauda.
One. mês a seguir à injecção de células tumorais, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com luciferina e fotografada utilizando um sistema de imagiologia IVIS da Xenogen, de acordo com as instruções do fabricante.
tumores múltiplos estavam presentes em 100% dos ratinhos.
Dois ratos representativos são mostrados.
neuroblastoma humano células tumorais são injetadas por via intravenosa para produzir tumores disseminados.
Num momento apropriado após a injeção de células do neuroblastoma, células estaminais neuronais ou células progenitoras neurais As células transduzidas com adenovírus para expressar uma enzima activadora de pró-fármaco (neste estudo, uma forma segregada de carboxilesterase coelho [CRE]) são injectadas por via intravenosa.
Após a migração de células estaminais ou células progenitoras de focos tumorais e um atraso de 3-4 dias para permitir a expressão relativamente elevada da enzima activadora de pró-droga para o meio extracelular nos locais de tumor, os ratinhos são tratados com o pró-fármaco (neste estudo, a CPT-11).
o pró-fármaco é activado de forma selectiva pelo focos tumorais, para aumentar o índice terapêutico do pró-fármaco
(a), fígado dissecado a partir de um animal representativo com metástases hepáticas.; o animal foi sacrificado dois dias a seguir à injecção de células HB1.F3.C1 na veia da cauda.
(B) baixa e (C) de grande aumento de uma secção de envolvimento hepático-tumoral, coradas com . hematoxilina e eosina
As células tumorais parecem roxas (setas pretas) escuros; . Seção de fígado tecido normal aparece rosa
(D) corado com um anticorpo a proteína mitocondrial anti-humana e contrastadas com hematoxilina
micrometástases de tumores mancha marrom escuro (setas vermelhas).; tecido hepático normal é roxo.
(E) Microscopia de imunofluorescência da secção do fígado.
HB1.F3.C1 células foram CM-DII marcado antes da injecção e são evidentes como as células vermelhas.
A secção de fígado foi corado com DAPI; focos tumorais são identificados por áreas de núcleos de células de tumor manchadas de DAPI densamente empacotados.
As setas vermelhas mostram células HB1.F3.C1 extravasados proximal a uma veia hepática (v).
Inset é alta ampliação de uma célula HB1.F3.C1 marcada com Dil dentro do tumor. (F-H) seção de fígado de um animal portador de tumor que recebeu células HB1.F3.C1 CM-DII rotulados foi corado com anticorpo mitocondrial específica humana conjugado com FITC.
(F) Red CM-DII células HB1.F3.C1 marcado com.
(G) A mesma seção que mostra FITC (verde) células tumorais humanas e células HB1.F3.C1.
(H) Sobreposição de (células CM-DII vermelho HB1.F3.C1) F e G (verde FITC HB1.F3.C1 e células tumorais).
células HB1.F3.C1 (células laranja /amarelo indicadas pelas setas brancas) migraram para micrometástases hepáticas (células verdes) e se infiltrou no parênquima tumor na proximidade de um vaso sanguíneo (bv, linhas pontilhadas brancas)
as barras de escala:. 1 cm (a), 2 mm (B), 500 ^ M (C), 200 um (F, G), 100 uM imagem
de raios-X de membro posterior de um rato com (D, E, H), de 10 um (E inset). neuroblastoma fase (Dia 82; painel esquerdo, barra de escala: 1 cm)
confirmação da massa tumoral, como humano SK-N-aS neuroblastoma células foi realizada por imuno-histoquímica utilizando o anticorpo anti-humano mitocôndrias (não mostrado. )
as células HB1.F3.C1 CM-Dil-marcados (glóbulos vermelhos injectados, na veia da cauda de 3 dias antes de serem sacrificados) localizada ao tumor na medula (painel da direita.; barra de escala:. 200 mm)
Detecção Concordante de v-
myc
(células HB1.F3.C1) por PCR e expressão TH (células de neuroblastoma) por RT-PCR em espécimes de medula óssea.
amostras de medula óssea isoladas a partir de animais injectados com células HB1.F3.C1 foram analisadas para a presença de V-
myc
(células HB1.F3.C1) ou a expressão de TH (células NB-1643).
células HB1.F3.C1 estavam presentes na medula óssea apenas quando células tumorais também estavam presentes.
células HB1.F3.C1 não foram detectados na medula óssea de animais não portadores de tumores.
os controlos positivos (+) foram DNA extraído a partir de células HB1.F3.C1 para v-
myc
, e extraiu-se ARN a partir de NB -1691 células para TH
Os controles negativos. (-) não continham DNA ou RNA modelo, respectivamente
normal e os órgãos foram colhidos, seccionadas e coradas com portadores de tumor. DAPI. células HB1.F3.C1 não foram detectados no rim normal (A) do cérebro, (B), intestino (C) coração, (D) ou (E) o tecido da pele.
Raro, único, HB1. células F3.C1 (setas brancas) foram observados em (F) do pulmão, (G) e fígado (H) baço
barras de escala:. 200 um (a-e), 100 ^ M (M-H) .
as barras representam o número médio de células que migraram ± SEM de poços em triplicado em ensaios de câmara de Boyden modificado.
Um dia antes de serem utilizados em tratamentos, as células foram transduzidas com a construção AdCMVrCE (ver texto).
o esquema de tratamento foi baseado no tempo de curso da expressão da forma segregada de RCE, após transdução adenoviral de células HB1.F3.C1 (Danks, observação não publicada) e em um esquema de administração de CPT-11 que tem sido mostrado para ser relativamente eficaz para pacientes de neuroblastoma [35].
Análises estatísticas
Todos os dados foram analisados com o software GraphPad Prism (San Diego, CA). As análises dos resultados de migração de células (número médio de células ± S.E.M.) De células não transduzidas foram comparados com a das células transduzidas com adenovírus. Estes dados foram analisados usando um bicaudal
t
-teste. Análise de gráficos de Kaplan-Meier em comparação sobrevivência de 10 ratos por grupo usando um método de log-rank (Mantel-Haenszel).
Resultados
Mouse Model of metastático Neuroblastoma
intravenosa injecção de 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, ou de células do neuroblastoma SK-N-AS neuroblastoma humano produz disseminada em 100% dos ratinhos SCID-esterase deficiente. A natureza disseminada de tumores é evidente na Figura 1, em dois ratinhos que receberam injecções na veia da cauda de células SK-N-AS transduzidas para expressar luciferase. Um mês após a injecção de células de neuroblastoma, o substrato luciferina luciferase foi injetado por via intraperitoneal de visualizar tumores
in situ
. Consistente com relatórios publicados, os tumores estavam presentes em vários órgãos e localizações anatómicas, incluindo abdómen, medula óssea, fígado, pulmões e [21], [34]. Uma vez que 100% dos ratinhos injectados com células de neuroblastoma desenvolvem doença disseminada que, finalmente, resulta em morte, este modelo facilitada avaliação de experiências terapêuticas que foram realizados de acordo com o esquema na Figura 2. Esta figura ilustra a hipótese a ser testada. Os ratinhos injectados com células de neuroblastoma humano desenvolver tumores múltiplos. Duas semanas após a injecção de células de neuroblastoma, células HB1.F3.C1 transduzidas com adenovírus que codifica uma enzima activadora de pró-droga são administrados por via intravenosa. Três dias mais tarde, após ter HB1.F3.C1 células localizadas preferencialmente para locais de tumor e a enzima activadora de pró-fármaco (RCE neste estudo) é expressa em níveis elevados, a administração de pró-fármaco (CPT-11) é iniciada, dado numa óptima predeterminada cronograma. A eficácia antitumor do pró-fármaco por si só pode então ser comparada com a co-administração de células e HB1.F3.C1 pró-fármaco, usando a sobrevivência como um ponto final.
localização das células HB.F3.C1 para Neuroblastoma tumor no fígado
para confirmar primeiro que HB1.F3.C1 células migram para e localizar em tumores de neuroblastoma disseminadas, ratos com tumores NB-1643 estabelecidos foram injectados por via intravenosa com 2 × 10
6 CM-DII rotulados HB1.F3. células C1. Após 3 dias, os órgãos normais e portadores de tumor foram colhidas e seccionados, e avaliadas microscopicamente. Como mostrado na Figura 3, vários tumores eram evidentes por inspecção bruto no fígado de um rato representativo (painel A), e também por avaliação microscópica de secções de hematoxilina /eosina (painéis B e C, as áreas de roxo) e coloração com imunoperoxidase para humanos proteína mitocondrial (painel D, áreas castanhas). HB1.F3.C1 células co-localizada com estes focos tumorais, conforme demonstrado pelas células CM-Dil-rotulados, vermelhas visto no painel E. Este painel mostra também o extravasamento das células HB1.F3.C1 e a sua migração para fora a partir da veia hepática (v). Painel F mostra HB1.F3.C1 NSC (CM-DII marcado, vermelho) e G Painel mostra mesma seção corados com mitocondrial anticorpo-FITC humanos (NSCs humanos e de células tumorais, verde). Painel de H, uma sobreposição dos painéis F e G, demonstra a co-localização das células HB1.F3.C1 (laranja /amarelo, indicado pelas setas brancas) e células de tumor (verde), em locais imediatamente adjacente e distante do vaso sanguíneo (BV). Resultados semelhantes foram observados para os tumores em vários outros órgãos, incluindo o ovário (não mostrado) e na medula óssea (Figura 4).
HB1.F3.C1 células localizam Neuroblastoma Metástases no Medula Óssea
desde medula óssea é um local frequente de metástase neuroblastoma e medula aspirados ou biópsias são usados para documentar o estágio da doença em pacientes de alto risco, procurou-se determinar se as células HB1.F3.C1 também infiltrado tumores neste site. O painel esquerdo da Figura 4 mostra o raio-x do fémur de rato tendo um tumor macroscópico que se originou na medula óssea. Este animal foi injectado por via intravenosa com células HB1.F3.C1 CM-Dil-rotulados e sacrificados três dias mais tarde. A área do osso indicada pelo rectângulo vermelho foi, em seguida, processado para microscopia de imunofluorescência. O painel da direita da Figura 4 mostra claramente células HB1.F3.C1 (fluorescência vermelha) se infiltrar na medula portador de tumor, documentando que estas células migraram para e co-localizada com tumores macroscópicos (Figura 4), bem como tumores microscópicos (Figura 3 ). No entanto, embora interessantes, considerou-se mais importante e relevante para demonstrar a migração de células para tumores HB1.F3.C1 microscópicas na medula óssea (Figura 5), como na recidiva da doença é pensado para originar a partir de células tumorais residuais presentes na medula ou em sites primários. Além disso, é essencial para a aplicação clínica de sucesso desta abordagem para demonstrar que células HB1.F3.C1 não estão presentes no tecido normal (Figuras 5, 6).
Evidência molecular para HB1.F3.C1 celular e tumor celular co-localização na medula óssea
para resolver o primeiro destes dois perguntas, avaliou-se a migração de células HB1.F3.C1 às células tumorais na medula óssea, utilizando uma abordagem molecular sensível para detectar a presença de um número mínimo de células de tumores e /ou células HB1.F3.C1. Para este fim, colhidas de medula de ratinhos que tinham sido injectados por via intravenosa com células NB-1691, seguido por HB1.F3.C1 células duas semanas mais tarde. Como notado acima, nesta “fase” da doença, os tumores não são detectáveis microscopicamente. Em seguida, utilizado a PCR para detectar a V-
myc gene presente em células HB1.F3.C1 e RT-PCR para detectar a tirosina hidroxilase (TH), um marcador de células de neuroblastoma. Dados na Figura 5 mostram que quer tanto v-
myc Comprar e TH ou nenhum destes marcadores foram detectados em qualquer medula. Se a medula continha células de tumor, tal como indicado por um sinal detectável por células TH, HB1.F3.C1 (um sinal positivo para V
myc
) estavam também presentes. Por outro lado, quando não há células de neuroblastoma foi detectada, células HB1.F3.C1 foram igualmente indetectável. Este “co-localização” ocorreu no prazo de 1 hora após a injecção e persistiram durante pelo menos 7 dias. Estes dados são consistentes com os resultados das Figuras 3 e 4, e mostram que as células HB1.F3.C1 rapidamente migrar para as células tumorais
in vivo
.
poucas células HB1.F3.C1 são Present em tecido normal
para a terapia do tumor ser selectivo, era também essencial para mostrar que as células HB1.F3.C1 não migraram para outros tecidos normais. Por conseguinte, 2 × 10
6 células CM-Dil-marcadas foram injectados intravenosamente em ratinhos com tumores NB-1643 e após 3 dias, todos os órgãos foram recolhidos e avaliados quanto à presença de células HB1.F3.C1. A Figura 6 demonstra que poucas, se algumas, células HB1.F3.C1 estavam presentes no cérebro normal, rim, coração, intestino ou tecido da pele (painéis A-E, respectivamente). Ocasionalmente, foi observada uma única célula do pulmão, do fígado ou do baço (painéis F-h, respectivamente), mas nenhum foco de fluorescência CM-DII foi observada em qualquer tecido normal de qualquer um dos cinco ratinhos examinados. Concluiu-se que as células migraram HB1.F3.C1 selectivamente a células de neuroblastoma após a injecção intravenosa.
Eficácia terapêutica para o tratamento da metastático Neuroblastoma
Tendo estabelecido que as células HB1.F3.C1 são tumor- trópico
in vivo
, foi avaliada a eficácia antitumor do nosso neural tronco /progenitoras dirigida por células pró-fármaco enzima (NDEPT) abordagem terapêutica, utilizando HB1.F3.C1 células transduzidas para expressar uma forma segregada de um carboxilesterase coelho (RCE) ea anticancerígeno pró-fármaco CPT-11. O primeiro confirmada, utilizando ensaios de câmara de Boyden modificado, que a transdução adenoviral e expressão de CRE não alterou as propriedades trópico de células HB1.F3.C1 (Figura 7). Foi também determinado que o nível máximo de expressão de CRE ocorreu 3-4 dias após a transdução (dados não mostrados). Em seguida, as células transduzidas com HB1.F3.C1 rce que codifica adenovírus deficiente na replicação, e injectadas por via intravenosa das células transduzidas em ratinhos portadores de tumores disseminados SK-N-AS. Os ratos foram tratados de acordo com o protocolo mostrado esquematicamente na Figura 8. Tal como mostrado na Figura, quatro dias a seguir à injecção de células HB1.F3.C1 + AdCMVrCE (três dias a seguir à injecção de células HB1.F3.C1), iniciou-se o tratamento com CPT-11 (7,5 mg /kg) no dia a dia × 5 programação, uma programação óptima de administração para os doentes com neuroblastoma. Este tratamento foi repetido na semana seguinte, seguido por um período de repouso de 2 semanas e, em seguida, um outro curso de duas semanas de terapia. O gráfico de Kaplan-Meier da Figura 9 mostra os dados de sobrevivência dos ratinhos não tratados em comparação com os ratinhos tratados com CPT-11 apenas, ou com a combinação de células que expressam CRE HB1.F3.C1 e CPT-11.