Abstract

As propriedades quimioprotectores de sulforafano (SF), derivados de vegetais crucíferos, são amplamente reconhecidos a surgir a partir do seu potente indução de xenobióticos que metabolizam e enzimas antioxidantes. No entanto, muito pouco se sabe sobre o impacto de SF sobre a eficácia da terapia do cancro por meio da modulação de enzimas metabolizadoras de drogas. Para identificar proteínas moduladas por uma baixa concentração de SF, nós tratamos células cancerígenas do cólon HT29 com 2,5 uM de SF. alterações abundância de proteína foram detectadas através de marcação de isótopos estáveis ​​de ácidos aminados em cultura de células. Entre 18 proteínas encontradas para ser significativamente regulada para cima, aldo-ceto redutase 1C3 (AKR1C3), bioactivating o DNA de ligação cruzada pró-fármaco PR-104A, foi ainda caracterizado. Pré-condicionamento células HT29 com SF reduziu a CE

50 de PR-104A 3,6 vezes. O aumento da citotoxicidade PR-104A foi ligado a abundância AKR1C3 e actividade, tanto induzida por SF de um modo dependente da dose. Este efeito foi reproduzido em uma segunda linha celular de cancro do cólon, SW620, mas não em outras linhas de células de cancro do cólon onde a abundância AKR1C3 actividade e estavam ausentes ou quase não detectável, não pôde ser induzido por SF. Curiosamente, SF não teve influência significativa sobre a citotoxicidade PR-104A ao não-cancerosas, imortalizado linhas epiteliais do cólon humano de células que expressam níveis baixos ou altos de AKR1C3. Em conclusão, a resposta aumentada de PR-104A após pré-condicionamento com SF foi aparente apenas em células de cancro, desde que AKR1C3 é expressa, enquanto que a sua expressão em células não-cancerosas não induziu tal resposta. Portanto, um subconjunto de tipos de câncer podem ser suscetíveis a componentes e pró-droga tratamentos derivados de alimentos combinados com nenhum dano aos tecidos normais

Citation:. Erzinger MM, Bovet C, Hecht KM, Senger S, Winiker P, N Sobotzki , et ai. (2016) Sulforaphane Pré-condicionamento sensibiliza células de cólon humano em direção ao biorredutivo Anticancer Pr�f�maco PR-104A. PLoS ONE 11 (3): e0150219. doi: 10.1371 /journal.pone.0150219

editor: Douglas Thamm, Universidade Estadual do Colorado, United States |

Recebido: 26 Outubro, 2015; Aceito: 10 de fevereiro de 2016; Publicação: 07 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Erzinger et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e suas informações dos arquivos de apoio

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (136,247), www.snf.ch.

Conflito de interesses: os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

drogas câncer são frequentemente associados com efeitos colaterais graves que limitam o potencial de dosagem, portanto pró-fármacos que requerem bioativação em células-alvo são activamente perseguidos como uma estratégia para promover selectividade terapêutica [1]. Para diferenciar ainda mais entre as células alvo e não alvo, particularmente para pró-drogas activadas por enzimas, uma nova abordagem alternativa é a condição prévia selectivamente as células cancerosas com quantidades não tóxicas de um composto bioactivo natural para melhorar com segurança susceptibilidade droga [2]. Estes compostos, muitas vezes sobre-regular enzimas que metabolizam os medicamentos que bioactivate drogas, portanto, apesar dos baixos riscos, eles podem afetar significativamente os resultados de terapia [3]. Ao contrário de interacções medicamentosas, as mudanças modulada de alimentos no metabolismo da droga que influenciam a eficácia da droga na terapia do câncer raramente foram abordadas.

Os isotiocianatos, tais como sulforafano (SF) são derivados de vegetais crucíferos, são biodisponíveis no cólon [ ,,,0],4], e modulam a expressão de genes de um grande número de xenobióticos que metabolizam e enzimas antioxidantes [4-6]. Em grande medida, este processo é mediado pelo factor de factor de transcrição nuclear factor eritróide 2 relacionada-2 (Nrf2) [7]. A influência do SF na transcrição do gene e expressão da proteína tem sido caracterizada em modelos de roedores e linhas de células humanas de tecido de origem diferente [8-18], incluindo quatro estudos que implicam abordagens proteômicas [14, 16-18]. SF reage com resíduos de cisteína do Nrf2 repressor Keap1, resultando na translocação nuclear de Nrf2 e a ligação do factor de transcrição de ADN [7]. a expressão do gene é afetada principalmente por genes que codificam para a fase II e enzimas de desintoxicação, mas também enzimas de regeneração de NADPH celulares, antioxidantes, ou enzimas que metabolizam xenobióticos [14-18]. A maioria dos aplicativos de translação de SF visam explorar o potencial de regulação para desativar eletrófilos e espécies reativas de oxigênio em células saudáveis ​​ou pré-malignas para prevenção de câncer [15, 19].

Enquanto SF ou altos níveis de Nrf2 pode contribuir para quimiorresistência [7, 20], a relação oposta também foi observado, com diferenças importantes sendo mecanismo de acção do fármaco e características de células [21]. exemplos mais conhecidos envolvem uma função terapêutica directa de SF de forma droga semelhante, no entanto, não há conhecimento limitado sobre influências de não-tóxicos, baixas concentrações de SF potencialmente obtidos pela dieta. Um processo de particular importância é a forma como a activação da transcrição de enzimas de activação de drogas pode promover a acção de pró-fármacos do cancro. A este respeito, tem-se observado que quando as células cancerosas (TD47D da mama) foram tratados com SF, NAD (P) H: quinona oxidorredutase 1 (NQO1), um activador de mitomicina C (MMC), foi induzida e as células foram sensibilizados para MMC [22]. Em um estudo de acompanhamento, dimetil fumarato foi usado como indutor NQO1, e os resultados iniciais SF foram confirmados

in vivo

. É importante ressaltar que não houve aumentos observados em toxicidades adversas, motivando um estudo mais aprofundado de como indução enzimática dieta relevantes podem impactar a atividade pró-droga [23]. Estes dados, em conjunto com a biodisponibilidade estabelecida de SF no cólon humano, sugeriu-nos a relevância de caracterizar alterações em todo o proteoma em células de cancro do cólon humanos expostos a doses não-tóxicas de SF utilizando rotulagem isótopo estável com aminoácidos em cultura de células ( SILAC) [24], uma abordagem de marcação metabólica que permite a quantificação de milhares de proteínas com elevada precisão e sensibilidade [25].

PR-104A é o metabolito de pró-fármaco da mostarda dinitrobenzamida pré-pró-fármaco PR-104 (figura 1) [26-29]. Em estudos anteriores, a enzima redutase de aldo-ceto (AKR) 1C3 foi estabelecida para mediar a activação aeróbia do PR-104A [29, 30]. Esta enzima é um membro da superfamília de enzimas AKR, composto por enzimas redutase cetosteroides que regulam a produção de androgénios, estrogénios, progestinas e [31] e a sua expressão é regulada pelo /Keap1-via Nrf2 [29]. PR-104 tem sido envolvido em uma série de primeiros ensaios clínicos para a terapia do cancro [32-35], no entanto, um potencial efeito benéfico da expressão da enzima induzido quimicamente na citotoxicidade PR-104A não tem sido relatada.

In vivo

, PR-104 é hidrolisado a PR-104A, que é ainda mais reduzida em metabolitos que formam ICLs citotóxicos.

para determinar a influência de uma baixa concentração de SF que pode ser explorados para a modulação da eficácia do medicamento, analisamos alterações em todo o proteoma sobre SF pré-condicionamento em células cancerígenas do cólon HT29 por SILAC [24]. Com base nestes dados, formulada a hipótese de que a actividade PR104A pode ser promovido em células cancerosas. Portanto, testou-se o impacto da SF pré-condicionamento na citotoxicidade PR-104A nestes e várias outras linhas celulares de cancro do cólon estabelecido e em comparação com as células normais imortalizadas, mas diplóides humanos do cólon epiteliais (HCEC) como um modelo para o tecido saudável cólon. Uma variedade de dados de captação celular, abundância de enzima, actividade em diferentes tipos de células e knock-down ensaios sugerem um modelo que envolve a sensibilização SF-promovido com base no aumento da abundância de proteína AKR1C3 e actividade, e as características celulares que favorecem a interacção positiva.

Materiais e Métodos

Materiais

meio de cultura celular e suplementos eram de Invitrogen (Life Technologies) e produtos químicos a partir de Sigma Aldrich, se não especificado de outra forma. As soluções de reserva R-sulforafano (LKT Laboratories) e PR-104A (Proacta) foram preparadas em DMSO, clorambucil em etanol. NADPH era da Calbiochem. Coumberone foi generosamente fornecida pelo Prof. Dalibor Sames (Universidade de Columbia, Nova Iorque, EUA) e SN34037 pelo Prof. Bill Wilson e Dr. Adrian Blaser (Cancer Centre Auckland Society Research, University of Auckland, Nova Zelândia). ON-TARGETplus Humano AKR1C3 siRNA (SmartPool) e ON-TARGETplus não-alvo piscina siRNA foram obtidos a partir Dharmacon (Thermo Scientific). Lipofectamine RNAiMAX transfecção reagente (Life Technologies) foi usado para siRNA transfecção de acordo com o protocolo do fabricante.

Células e condições de cultura

HT29 células foram obtidas a partir da Leibnitz-Institut DSMZ GmbH em janeiro de 2012. células SW620, SW480, HCT116 e GP2d, descritos em [36, 37], foram obtidos do Instituto de Molecular Cancer Research (Universidade de Zurique, Suíça) em outubro de 2013 e autenticada pela empresa Microsynth (Balgach, Suíça) usando short em tandem repetir perfis em janeiro de 2015. HT29, células SW620 e GP2d foram cultivadas em DMEM, SW480 células foram cultivadas em células HCT116 médias e meio RPMI-1640 foram cultivadas em meio de McCoy. Todos os meios foram suplementados com 10% (v /v) de soro bovino fetal e 100 unidades /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. clones HCEC foram obtidos em agosto de 2011 (HCEC1CT) e agosto de 2013 (HCEC2CT) e cultivadas sob condições previamente relatado, mas sob normoxia [38]. Todas as linhas de células têm sido regularmente confirmada para ser livre micoplasma. Para as experiências de SILAC, HT29 células foram cultivadas em lisina e arginina DMEM livre (Silantes) que foi quer suplementado com lisina 0,219 mM (Lys0) e arginina 1,14 mM (arg0) para o meio de luz (L), enquanto que a forma pesada (H) foi suplementado com 0,219 mM [

13 C

6

15 N

2]-lisina (Lis8) e 1,14 mM [

13 C

6

15 N

4] – arginina (Arg10). Para uma incorporação completa dos aminoácidos marcados com isótopos, as células foram cultivadas durante um total de 24 duplicações da população de células (seis passagens, população duplicações de quatro células cada) em meio SILAC antes da experiência. 24 h após a sementeira, as células cultivadas em meio de luz SILAC foram tratadas com 0,1% (v /v) de DMSO e as células cultivadas em meio SILAC pesada foram tratadas com 2,5 uM de SF durante 48 h. Todas as amostras de células foram preparadas em triplicado.

Proteína Extracção

As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, e incubou-se a 4 ° C durante 15 min com tampão de lise (NaCl 150 mM, Tris 50 mM HCl, EDTA 1 mM, pH 7,4) contendo inibidores de protease (completo mini, Roche Diagnostics). O lisado foi sonicada e centrifugada, a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA (Thermo Fisher Scientific), e as amostras armazenadas a -80 ° C.

SILAC

digestão de proteína, Análise por espectrometria de massa de amostras e SILAC análise bioinformática foi realizada pela adaptação de abordagens padrão (detalhes completos sobre método estabelecido para este estudo em S1 apêndice).

AKR1C3 atividade

substrato AKR1C coumberone foi usado como sonda atividade juntamente com um AKR1C3 específica inibidor (SN34037) por modificação do método descrito em [30]. Em placas de 96 poços para cada amostra, 40 ug de proteína total foram adicionados ao tampão de ensaio (100 mM de tampão KPO4 [pH 7] contendo 250 uM de NADPH) com ou sem 1 ^ M SN34037, e incubou-se 60 min, 37 ° C. A reacção foi iniciada com coumberone (30 uM final; DMSO 5% [v /v]). A emissão de fluorescência, devido à formação de coumberol, a 510 nm (excitação 385 nm) foi registada num leitor de placas infinito PRO M200 (Tecan) a 37 ° C. atividade AKR1C3 foi calculada como ΔRFU /min durante 60 min (metabolismo coumberone completa em S1 Fig). Medições realizadas em duplicado com triplicatas biológicos; A análise estatística (valores médios, teste t de Student) realizada utilizando GraphPad Prism 6.

Análise Western Blot

Os lisados ​​celulares foram separados em gel de NuPAGE® Bis-Tris a 4-12% a 200 V durante 45 min em SDS a 1X NuPAGE® MES tampão de corrida (Life Technologies) e transferidas electroforeticamente para membrana de Amersham Hybond-P PVDF (GE Healthcare) a 30 V durante 60 minutos em tampão de transferência NuPAGE® 1X (Life Technologies). As membranas de PVDF foram bloqueadas com 5% -leite-TBST à TA. As membranas foram incubadas com anticorpo anti-AKR1C3 policlonal de coelho (1: 2.000, Thermo Scientific), seguido de incubação com anti-coelho IgG HRP (1: 5’000, GE Healthcare). A proteína foi detectada utilizando um Pierce® ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). membranas tratadas foram expostas a filme de raios-X. A membrana foi despida, incubadas com anticorpo anti-actina (1: 1’000, Sigma Aldrich) e analisado novamente. As bandas de proteína foram quantificados com o software ImageJ [39], e foram ajustados para controlo de actina carregamento correspondente

Droga Citotoxicidade

As células foram semeadas em placas de 96 poços (HT29, HCEC, SW480:. 1 ‘500 células /poço; SW620: 1’000 células /poço; HCT116: 500 células /poço; GP2d: 5’000 células /poço). 24 h mais tarde as células foram expostas a 2,5 mM SF (HCT116 excepção: 1? M) correspondente a um IC

10 ou 0,1% (v /v) de DMSO. Após 48 h, o meio foi removido e foram adicionadas concentrações crescentes de droga em meio fresco. 24 h mais tarde o meio foi substituído por meio fresco. 72 h mais tarde, a viabilidade celular foi ensaiada utilizando o celular CellTiter-Glo® luminescentes Viabilidade Assay (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. A experiência foi realizada em triplicado. Todos os valores de luminescência foram normalizados relativamente às células tratadas com o veículo. As curvas de dose-resposta foram ajustadas por uma função de regressão não linear GraphPad Prism em análise 6. estatística foi realizada pelo teste adicional da soma dos quadrados F para testar se as curvas de dose-resposta em células de controlo e SF-pré-tratados estatisticamente diferentes uns dos outros.

PR-104A de citotoxicidade com células siAKR1C3

HT29 foram semeadas em placas de 6 poços (90’000 células /poço) e deixadas a ligar. 24 h mais tarde, eles foram expostos a siAKR1C3 (120 pmol) e 2,5 mM SF ou% DMSO 0,1 simultaneamente. Após 48 h, o meio foi removido e três concentrações de PR-104A (0, 25, 100? M) foram adicionados em meio fresco. 4 h após a adição do fármaco, o meio foi removido e um ensaio de sobrevivência clonogénica foi realizada de acordo com protocolos convencionais [40]. Depois de duas semanas de incubação, as colónias foram coradas com Giemsa e contadas. Como um controlo, foi utilizado não-alvo siRNA (120 pmol). A experiência foi realizada em triplicado. As análises estatísticas (teste t não pareado com correção de Welch) foram realizadas utilizando GraphPad Prism 6.

SF Captação

concentrações intracelulares SF em HT29 e células HCEC1CT foram medidos pelo ensaio ciclocondensa�o acoplado-HPLC ( reacção com 1,2-benzenoditiol), como descrito anteriormente (mais detalhes no S1 apêndice) [41].

resultados

Influência do SF na expressão do gene em células de cancro do cólon HT29

SILAC foi utilizada para investigar mudanças nos níveis de abundância de proteínas celulares após o tratamento com uma baixa concentração de SF em células cancerígenas do cólon HT29. Após o tratamento com 2,5 uM SF, durante 48 h, correspondendo a um IC

10 em células HT29 (Fig S2); que identificou 23 proteínas diferencialmente abundantes (Figura 2; Tabela 1). A preponderância de proteínas envolvidas em processos metabólicos e redox celulares foram encontrados para ser enriquecido, e enzimas previamente caracterizados para mediar a activação de pró-fármacos redutores, tais como AKR1C3, PTGR1, e foram NQO1 entre este grupo [22, 29, 42-44] . A maior mudança vezes era evidente para a ciclina D1 proteína de ligação 1, um regulador negativo da activação da transcrição envolvendo os fatores de transcrição E2F [45], ao passo que várias metabólica e proteínas de regulação redox regulados pelo factor de transcrição Nrf2, incluindo AKRs e um aldeído desidrogenase, um aumento de 4,6 vezes ou superior. A grande alteração na abundância de AKR1C3 (7 vezes), previamente implicado na activação do PR-104A, chamado a possibilidade de sensibilização droga. Portanto, nós nos concentramos nossos esforços adicionais para elucidar quaisquer interacções SF-PR104A e contribuições de AKR1C3 como base molecular. Uma lista completa de todas as proteínas quantificados no experimento SILAC, incluindo a sua relação normalizada H /L, é apresentado na Tabela S1.

2.653 proteínas (preto e cinza) foram quantificadas e testadas para significância. Entre as 23 proteínas significativamente regulados (preto), 18 eram up-regulada e 5 sub-regulada em abundância.

Para confirmar independentemente o aumento na abundância AKR1C3 aparente no estudo SILAC, Western análise blot foi realizada e verificou-se que AKR1C3 abundância foi induzida em células HT29 de uma forma dependente da dose SF (Figura 3A). Para confirmar o aumento da actividade AKR1C3 em lisados ​​HT29, foi utilizada uma versão modificada de um método previamente descrito para medir a actividade especificamente AKR1C3 em células intactas, envolvendo coumberone como um substrato para todos os quatro membros da família AKR1C, e o SN34037 inibidor AKR1C3 específica [30 ]. Semelhante a níveis de proteína, actividade AKR1C3 aumentou de uma forma dependente da dose em células HT29 (Fig 3A).

os níveis de actividade de proteína AKR1C3 e são mostrados em (a) para as células HT29 e em (e) para células HCEC1CT tratados 48 h com SF ou DMSO (controlo). As barras representam valores médios e as barras de erro são erros padrão. A análise estatística foi realizada por um teste t não pareado com correção de Welch. As experiências foram realizadas em triplicado. (*:

P

0,05; RFU = unidades de fluorescência relativa). Modulação da viabilidade das células é demonstrado para HT29 em (b) e para HCEC1CT em (f), após as células foram incubadas 48 horas com 2,5 | iM ou SF 0,1% de DMSO (controlo) e incubou-se com concentrações crescentes de PR-104A. Os dados apresentados são valores médios ± DP de quatro (HT29) ou três (HCEC1CT) repetições biológicas. Um teste adicional F da soma dos quadrados foi realizada para testar se as curvas de dose-resposta estatisticamente diferentes uns dos outros. Os valores de p resultantes mostram que a resposta SF impacta significativamente drogas em células HT29, e não tem nenhum efeito significativo nas células HCEC1CT. (C) a sobrevivência clonogênica ensaio mostrando aumento da sobrevida de HT29 tratada com siRNA contra AKR1C3 em comparação com as células tratadas com não-alvo siRNA após o tratamento PR-104A durante 4 h. As células foram pré-tratadas durante 48 h com 2,5 uM SF em conjunto com siARN. Cada ponto de dados representa três experiências independentes. As barras de erro mostram o desvio padrão de média. A análise estatística foi realizada por um teste t não pareado com correção de Welch; **:

p Art 0,01, ***:

p Art 0,001. (D) Western Blot mostrando níveis de proteína AKR1C3 em células HT29 tratados com não-alvo siRNA ou siAKR1C3 com ou sem tratamento simultâneo SF (controlo = 0,1% DMSO).

Impacto do SF-mediada AKR1C3 indução em toxicidade do fármaco em células de cancro do cólon HT29

Descobrimos que pelo pré-células HT29 com 2,5 uM SF, durante 48 h, seguido de tratamento com doses crescentes de PR-104A, uma redução de 3,6 vezes na significativa CE

50 da droga foi observada (Fig 3B; Tabela 2;

p Art 0,0001). Maiores concentrações SF foram testados para o pré-condicionamento, mas aumentar a toxicidade do pré-tratamento se impedido a continuação da utilização destas concentrações mais elevadas SF. Como um controlo, esta interacção foi comparada com a influência de SF pré-condicionamento sobre a citotoxicidade do clorambucilo (CBL), uma droga anti-cancro que também formas de ADN de ligações cruzadas intercadeias (ICLs), mas não se baseia na bio-activação enzimática. Como esperado, a citotoxicidade de CBL foi inalterado (Tabela 2).

Para confirmar se o aumento dos níveis de abundância AKR1C3 devido a SF pré-condicionamento de HT29 são responsáveis ​​pelo aumento da citotoxicidade do PR-104A, foi realizada ARN interferência usando um pool de quatro siRNAs contra

AKR1C3

. Um ensaio clonogénico foi usado para determinar a citotoxicidade do PR-104A em células HT29 após pré-condicionamento simultâneo com SF e ARNsi contra

AKR1C3

(figura 3C e 3D, S2 Tabela). Como controle, foi utilizado não-alvo siRNA. Além disso, variando os tempos de incubação e concentrações de siRNA foram testados para assegurar que a expressão induzida por AKR1C3 SF foi reprimida pelo ARNsi contra

AKR1C3

sob as condições descritas, e após 48 horas de pré-condicionamento simultâneo com SF e ARNsi contra

AKR1C3

, os níveis de proteína foram semelhantes aos níveis em células HT29 não tratadas (dados não mostrados). Quando a sobre-expressão induzida por AKR1C3 SF foi regulada para baixo através de interferência de ARN, a citotoxicidade do PR-104A foi reduzida, indicando que a SF pré-condicionamento reduzido a concentração PR-104A necessária para alcançar uma citotoxicidade semelhante através da indução de níveis de abundância AKR1C3. Estes dados suportam a ligação previamente estabelecido entre a abundância AKR1C3 e eficácia PR-104A [29, 30], e, além disso, confirma o mesmo efeito em condições de indução química, ou seja, com SF.

Impacto da SF pré-condicionamento sobre a toxicidade de drogas em HCEC células do cólon não-cancerosas

Promover a citotoxicidade de drogas no tecido canceroso pode ser benéfico se a mesma interação é reduzida ou ausente em contrapartes saudáveis. Portanto, a combinação de SF e PR-104A foi investigada em um linha imortalizada de células epiteliais do cólon humano (HCEC) como um modelo para o tecido não canceroso [38]. HCEC (HCEC1CT e HCEC2CT, a partir de dois indivíduos diferentes) são células diplóides não tumorigénicas que expressam epitelial, assim como marcadores de células estaminais e foram estabelecidas a partir de mucosa do cólon normal. Eles não carregam mutações em genes de ponto de acesso, tais como

APC

,

KRAS

, ou

TP53

[38]. níveis de abundância AKR1C3 medidos por Western Blot foram ligeiramente induzida após tratamento SF em células HCEC1CT (Figura 3E), mas a um grau menor do que para as células HT29 (Fig 3A). Não houve aumento significativo na atividade AKR1C3 (Fig 3E), nem de sensibilidade às drogas (HCEC1CT: Fig 3F; Tabela 2;

p

= 0,2; HCEC2CT: Tabela 2;

p

= 0,8).

captação SF no HT29 e células HCEC1CT

para examinar se a resposta diferente em HT29 vs. células HCEC1CT pode estar relacionado com a captação SF celular, analisamos captação SF no HT29 e HCEC1CT por um ciclocondensa�o ensaio. Este ensaio tem a vantagem de permitir a quantificação de SF livre, bem como SF obrigado a tióis celulares, tais como a glutationa [41]. Não houve diferenças significativas na captação SF (S3 Fig), sugerindo a exclusão de aumento da captação de base para a interação SF-PR104A em HT29 mas não células HCEC.

Impacto da SF pré-condicionamento sobre a toxicidade de drogas no adicional linhas celulares de cancro do cólon

Para explorar a generalidade ea base de efeitos de pré-condicionamento SF, as experiências de citotoxicidade foram realizados com linhas celulares de cancro do cólon adicionais com diferentes origens genéticas (Tabela 2). Semelhante ao HT29, em SW620 a CE

50 de PR-104A foi significativamente reduzida de 3,6 vezes por SF pré-condicionamento (

p Art 0,0001). Tal como em células HT29, AKR1C3 abundância em células SW620 foi induzida a cerca de 3 vezes e a actividade aumentada de 1,7 vezes (Figura 4, Tabela S3). Em contraste, para HCT116, SW480 e células GP2d, PR-104A citotoxicidade não foi alterada. Esta observação parece ser consistente com o fato de que nenhuma proteína AKR1C3 foi detectado em HCT116 e lisados ​​de células SW480, e nem SF pré-condicionamento induzir a abundância de proteínas ou actividade (Fig 4, S3 Tabela). Em células GP2d, AKR1C3 foi apenas expresso; no entanto, a abundância ea atividade dessa enzima não foram suficientemente aumentada pela SF para alterar PR-104A citotoxicidade (Fig 4, S3 Tabela). A clara tendência foi observada no sentido de menor PR-104A CE

50 valores para as células com maior atividade AKR1C3 (Fig 4C, R

2 = 0,7063;

p Art 0,01). Estes resultados indicam que uma combinação de níveis basais e AKR1C3 actividade, bem como a susceptibilidade à indução por SF, influenciar a propensão das células para suportar o potencial PR-104A-reforço de SF. Portanto, a variação genética em todo o tecido saudável e tumor primário, bem como diferentes tipos de câncer, pode ser esperado para contribuir para as respostas individuais.

(a) atividade AKR1C3 com (cinza) e sem (preto) SF pré-condicionamento para o cólon As linhas celulares utilizadas neste estudo. A análise estatística foi realizada pelo teste t não pareado com correção de Welch; *:

p Art 0,05. (B) Western Blot para a proteína AKR1C3 com e sem pré-condicionamento SF (2,5 ^ M durante 48 h). (C) Correlação entre a atividade AKR1C3 e citotoxicidade PR-104A (

p Art 0,01). Gráfico inclui dados de HCEC1CT, HCEC2CT, HT29, SW620 e células GP2d com (símbolos abertos) e sem (símbolos fechados) SF de pré-condicionamento. As linhas de células sem proteína AKR1C3 (HCT116, SW480) foram removidos. *: Mudança significativa na CE

50 sobre SF pré-condicionamento acordo com o teste extra de soma de quadrados F para testar se as curvas dose-resposta no controle e SF pré-tratados células estatisticamente diferentes uns dos outros

Discussão

Apesar da disponibilidade de dados relativos ao impacto de SF sobre a expressão gênica, houve apenas informações limitadas disponíveis sobre proteína alteração abundância em células do cólon humanos, especialmente para concentrações SF muito baixo para alterar significativamente a viabilidade celular. Na tela proteômica realizado aqui, 23 proteínas foram diferencialmente abundante, 18 sendo aumentado em abundância no tratamento com 2,5 mM SF. Várias destas proteínas, incluindo diferentes AKRs, foram encontrados anteriormente para ser induzida por doses mais elevadas de SF (5 e 15 uM) em linhas de células da mama estabelecidas a partir de glândulas mamárias com doença fibrocística e adenocarcinoma de cólon humano de células Caco-2, também usando abordagens proteomic [14, 16]. No entanto, no presente estudo, a resposta celular foi analisada numa concentração não tóxica e potencialmente fisiologicamente relevante demonstrada a exposição de SF nos tecidos humanos (2,5 ^ M) [46]. Em doses elevadas, SF tem actividade citostática e citotóxica em células em cultura [47-50]. Uma mudança moderada na abundância AKR1C3 (7,3 vezes) e lista geralmente limitado de enzimas supra-regulados detectados no nosso estudo pode estar relacionada com o tipo de célula ou a baixa concentração de SF, apoiando um aumento em uma proporção elevada de enzimas redutase, mesmo a baixa concentração .

na base dos resultados SILAC, exploramos a possibilidade de SF pré-condicionamento de células HT29 para alterar a citotoxicidade do profármaco biorredutivo PR-104A, e revelam a existência de uma interacção positiva directamente relacionado com a modulação de AKR1C3. análise de Western blot, as medições da actividade enzima específica, e siRNA knock-down experimentos todos confirmaram que maior sensibilidade à PR-104A foi relacionado a um aumento nos níveis de abundância AKR1C3 e atividade. Em contraste, esta sensibilização não foi detectável em células imortalizadas HCEC1CT, consistente com a falta de actividade da enzima induzida detectada nestas células (FIG 4A). Com base nos dados de Western blot, pareceu haver um aumento relativo na abundância de proteínas (Fig 4B). No entanto os níveis de proteína absolutos assim permaneceu baixo em ambas as células pré-condicionado e não tratados que não foi observada nenhuma sensibilização eficaz. O resultado para a linha celular HCEC1CT era de interesse devido ao seu tecido de origem não-câncer e características moleculares sugerindo-a como um modelo para as células epiteliais do cólon saudáveis ​​[38].

O possível reforço selectivo da PR-104A em células tumorais nos motivou a examinar cinco linhas celulares adicionais, nomeadamente HCEC2CT (não-cancerosos), e linhas celulares de cancro do cólon SW480, SW620, HCT116 e GP2d para entender melhor como fatores molecular influenciar a resposta combinação. Semelhante a HT29, SW620 células foram sensibilizados em relação a tratamento com PR-104A pelo SF-pré-tratamento. Além disso, AKR1C3 abundância de proteína e a actividade foi igualmente induzida nessas células. Em contraste, a abundância de proteínas e a actividade não foi afectada por pré-tratamento SF-HCEC2CT em células não-cancerosas, por conseguinte, estas células não foram sensibilizados para a droga. Em linhas celulares que tinham níveis muito baixos ou nenhum mRNA AKR1C3 [51] e não expressam a proteína (SW480, HCT116), AKR1C3 abundância também não foi inducible com SF pré-condicionamento. Portanto, não houve impacto sobre a citotoxicidade PR-104A. células GP2d tinha baixa

AKR1C3

níveis de mRNA [51], mas a abundância de proteínas e atividade da enzima pode ser aumentada após a SF pré-condicionamento, mas com um nível de indução aparentemente insuficiente para impactar a citotoxicidade da PR-104A. Assim, a actividade AKR1C3 parecia ser mais diagnóstico de PR-104A citotoxicidade (Figura 4C) que pequenas alterações abundância de proteína que podia ser detectado através de Western blot, mas não foram suficientes para produzir um efeito real. Esta observação dá apoio adicional no contexto de células cancerígenas do cólon à sugestão de que a actividade AKR1C3 poderia ser utilizado como um marcador preditivo para susceptibilidade PR-104A como estendeu previamente, com base em dados a partir de xenoenxertos de derivados do paciente e as células de leucemia. Por fim, sugere um valor para o desenvolvimento continuado de estratégias para monitorar a atividade AKR1C3, incluindo perfis com base na actividade da proteína [30, 52, 53].

Tem sido especulado que os fatores adicionais, tais como a reparação do ADN, pode conta para resultados inconsistentes observados anteriormente sobre a relação entre a susceptibilidade PR-104A e atividade AKR1C3 em linhas celulares, no entanto, nossos dados sugerem um papel fraco se houver diferenças de reparação a ser significativo nas células cancerígenas do cólon, considerando os resultados obtidos com o CBL (Tabela 2). formas PR-104A ICLs, proposto para ser semelhantes aos descritos para o CBL e MMC [26-28, 54]. Quando testamos CBL como um agente de modelo de reticulação e analisados ​​citotoxicidade nas mesmas linhas celulares como PR-104A, não houve efeito significativo da SF pré-condicionamento sobre a viabilidade celular (Tabela 2). No entanto, sob condições aeróbicas, como empregue aqui, PR-104A ICLs Pensa-se que só podem ser formadas, se AKR1C3 é expressa, caso contrário, outros modos de acção em linhas celulares que faltam esta enzima têm sido sugeridas, tais como mono-alquilação de ADN por si só PR-104A ou o seu meia de mostarda oxidado [27, 28, 54]. As estruturas para esses adutos de DNA não foram rigorosamente caracterizados, nem seu modo correspondente de reparo conhecido, por isso a importância destas vias para influenciar a citotoxicidade nas células com baixa basal ou induzidos garante níveis AKR1C3 um estudo mais aprofundado.

A possibilidade de aumentar a citotoxicidade de pró-fármacos anticancerígenos biorredutores com fitoquímicos alimentares tem sido demonstrada em um punhado de estudos anteriores de linhas de células humanas [21, 22, 43, 55]. Quatro linhas celulares, de cancro do cólon, do pulmão ou da origem da mama, foram sensibilizados para a MMC droga biorredutivo por indução de NQO1 [22]. Yu

et al

. curcumina e resveratrol usado para induzir a enzima que metabolizam drogas PTGR1 e, portanto, sensibilizar fígado HepG2 e células do cólon SW620 para o hidroximetilacilfulveno droga biorredutivo [43]. A sensibilização semelhante no sentido hidroximetilacilfulveno foi obtida em células HT29 usando D3T como indutor de enzima [55].