Abstract

adenocarcinoma mucinoso (MAC) representa uma entidade distinta histopatológico de câncer colorretal (CRC), que está associada com a doença progressão e prognóstico reservado. Aqui, descobrimos que os níveis de miR-205 e miR-373 de expressão foram especificamente regulada positivamente apenas em pacientes com cancros do cólon mucinosos, mas não em CRC que faltam componentes de mucina. Para investigar os efeitos de miR-205 e miR-373 sobre a biologia das células epiteliais do intestino (IEC) por gain- e experiências de perda de função em uma abordagem de prova de conceito, escolhemos previamente estabelecido

in vitro

modelos baseados em células Caco-2 humanos de diferenciada, não-invasiva (expressando TLR4 de tipo selvagem; denominado Caco-2 [WT]) versus indiferenciada, invasiva (expressando TLR4 D299G mutante; denominado Caco-2 [D299G]) IEC. Enterócitos-like Caco-2 [WT] mostraram baixos níveis de miR-205 e miR-373 expressão, enquanto ambos os miRNAs foram significativamente upregulated em colorectal carcinoma-como Caco-2 [D299G], assemelhando-se, assim, o padrão de expressão miRNA de emparelhado normal versus amostras de tumor de pacientes MAC. Usando transfecção estável, geramos miR-205 ou miR-373 e miR-expressando-205- ou subclones destas linhas IEC miR-373 de inibição. Descobrimos que a introdução de miR-205 em Caco-2 [WT] levou à expansão de células semelhantes a células caliciformes secretoras de muco, que foi associado com a indução de KLF4, MUC2 e expressão TGF-p1. Activação de miR-205 em células Caco-2 [WT] quimiorresistência induzido, enquanto que a inibição de miR-205 em quimiossensibilidade Caco-2 [D299G] promovido. Caco-2 [WT] superexpressão de miR-373 mostrou alterações mitóticas e sofreu alterações morfológicas (perda da polaridade epitelial, de reorganização do citoesqueleto, e rompimento juncional) associados com a transição epitelial-mesenquimal e progressão para carcinoma do cólon associada à inflamação, que se correlacionou com a indução de STAT3 fosforilado e a expressão de N-caderina. Funcionalmente, a introdução de miR-373 em células Caco-2 [WT] mediada perda de adesão célula-célula e aumento da proliferação e invasão. Inversamente, a inibição de miR-373 permitiu mesenquimais IEC para recuperar propriedades epiteliais, que se correlacionou com a falta de progressão neoplásica. Usando xenoenxertos em ratinhos demonstraram aceleração miR-373-mediada do crescimento do tumor maligno intestinal. Em conclusão, nossos resultados fornecem primeira evidência de que o miR-205 e miR-373 pode diferencialmente contribuir para o fenótipo agressivo de MAC no CRC

Citation:. Eyking A, Reis H, Frank M, Gerken G, Schmid KW , Cario e (2016) miR-205 e miR-373 são associados com Agressivo mucinoso Humano câncer colorretal. PLoS ONE 11 (6): e0156871. doi: 10.1371 /journal.pone.0156871

editor: Aamir Ahmad, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, United States |

Recebido: 12 Abril de 2016; Aceito: 20 de maio de 2016; Publicação: 06 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Eyking et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant CA226 /4-3 para CE) e financiamento interno (Interne Forschungsförderung Essen a CE). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal (CCR) é um dos cancros mais comuns e uma das principais causas de mundo ampla morte relacionada ao câncer [1]. Dentro do espectro CRC heterogénea, adenocarcinoma mucinoso (MAC) representa um subtipo histológica distinta, que é caracterizada por abundante produção de mucina extracelular ( 50% do volume de tumor) [2]. Tipicamente, derivado de células caliciformes do cólon mucina MUC2 é expresso em níveis elevados no MAC [3]. hipersecreção de muco tem sido associada a alterações na microbiota intestinal e a indução de respostas inflamatórias que podem promover o desenvolvimento do tumor [4]. Enquanto as taxas de prevalência variam de 4% a 11% de todos os casos de CRC, dependendo da localização geográfica [5], o MAC é muito mais vulgarmente diagnosticada em pacientes com CCR em colite ulcerosa (UC) [6]. Acredita-se que a inflamação crónica em UC pode facilitar a diferenciação mucina aberrante em CRC patogénese [7], mas as vias de sinalização que ainda não estão compreendidos.

Clinicamente, o MAC tem sido associada com tumores de estádio mais avançada no momento do diagnóstico, pobre respostas terapêuticas e redução de sobrevida em várias séries [8-11]. Apesar dos recentes avanços na terapia e gestão de estratégias individualizadas de pacientes com MAC, prognóstico no contexto metastático parece ser ainda pior do que a de pacientes com outros subtipos de CRC [12]. evidência crescente sugere que o MAC pode representar uma entidade de doença genética e fenotipicamente diferente de outros tipos de adenocarcinoma do cólon (AC) [13-15], mas os mecanismos moleculares específicos que podem conduzir a progressão do tumor e transformação metastática na carcinogênese mucinoso são em grande parte desconhecido.

Os microRNAs (miRNAs) representam uma classe altamente conservada de 19-25 RNAs não-codificantes de cadeia simples de nucleotídeos de comprimento que regulam muitos processos biológicos, incluindo patogênese do câncer [16]. A alteração de diversos perfis de miARN tem sido demonstrado que se correlacionam com a progressão do cancro do cólon por modulação da expressão do gene em translação e /ou transcricionalmente em redes de sinalização complexas [17,18]. No entanto, miRNA assinaturas de expressão podem diferir significativamente entre as populações CRC [19], reflectindo potencialmente variabilidade fenotípica, devido a diferentes distribuições subtipo histológico em coortes CRC heterogêneos [20]. É tão longe claro se miRNAs individuais podem desencadear o comportamento biológico do MAC. Recentemente, relatórios independentes variavelmente relatado miR-205 e miR-373 para ser associado com CRC [21-23], mas os casos individuais não foram classificados em subtipos histológicos.

miR-205 interage com os membros do miR -200 família (miR-200a /-200b) [24] e representa um miARN específico-epitelial [25], essencialmente envolvidos em funções celulares normais, tais como a regeneração e a expansão das células estaminais [26]. miR-373 pertence à família de miR-520 /-373, que consiste em três grupos diferentes de miARN (miR-302 /-367, miR-371 /-372 /-373, e miR-520) [27]. miR-373, identificado pela primeira vez como um miARN específico de células estaminais embrionárias [28], pode regular directamente a actividade da via Wnt /β-catenina [29]. Tanto o miR-205 e miR-373 parece exercer efeitos pleiotrópicos em tumorigénese, dependendo da célula ou tecido de origem. Eles têm como alvo vários genes ou proteínas, directa ou indirectamente [27,30] e pode, assim, actuar quer como oncogenes, facilitando a iniciação do tumor ou como supressores de tumores por inibição da invasão. Sinalização através de miR-205 e miR-373 pode favorecer epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) e migração de células cancerosas em certas entidades tumorais [24,31-33]. No entanto, os possíveis papéis de miR-205 e miR-373 em CRC patogênese permanecem até agora desconhecido.

Aqui, nós mostramos que os níveis de miR-205 e miR-373 de expressão são especificamente regulada apenas no CRC mucinoso. Funcionalmente, o miR-205 dirige a decisão destino da célula epitelial intestinal para uma linhagem celular do tipo taça produtoras de mucina e miR-373 conduz a progressão tumoral associada à inflamação, diminuindo a adesão célula-célula e aumentando a invasão. Assim, nós fornecemos primeira evidência de que os efeitos de sinalização distintas de miR-205 e miR-373 pode diferencialmente contribuir para o fenótipo único de MAC no CRC.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Uma lista detalhada de todos os anticorpos é fornecida em S1 Table. Metotrexato (MTX) foi obtido a partir Pfizer e Matrigel

® da Corning.

amostras de cancro do cólon humano

Foi realizado um estudo de coorte retrospectivo, em um único centro entre os pacientes com diagnóstico de CRC , usando o material fixado em formol embebido em parafina (FFPE) arquivados a partir de julho de 2003 a novembro de 2013, o Instituto de Patologia, Hospital Universitário de Essen, na Alemanha. Este estudo agido de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética local ( “Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen”; # 13-5602-BO, análise anônima de acervo histórico). A Tabela 1 mostra as características histopatológicas de 51 pacientes. Apenas acompanhado adjacente não-neoplásica, tecido normal (R

0) e bloquear tumor pares para cada caso foram incluídos. Todos os tecidos livres de tumor do tumor e emparelhados foram patologicamente avaliação, classificada como adenocarcinoma colorrectal (AC) e subdividida em 1. convencional (definido como: 50% glândula-formação, sem produção de mucina), 2. mucinoso ( 50% extracelular mucina), ou 3. crónica UC-associado (qualquer variante histológica). O subtipo mais frequentemente observada em CRC UC-associado foi MAC ( 50% de mucina extracelular) ou alternada com o componente mucinoso ( 50% de lesão composto de mucina) (

N

= 10), enquanto o resto era células de sinete (

n

= 1) ou AC formação de glândula (

n

= 2). Nenhum dos tumores convencionais foi classificado como fracamente diferenciado, em comparação com quase dois terços do mucinoso (60%;

P

0,0001; teste exacto de Fisher) ou mais do que um terço da UC-associado (38%;

p Art 0,01; teste exato de Fisher) tumores. Todas as amostras (tumor vs. R

0) a partir de pacientes UC demonstraram leve a uma inflamação moderada.

As linhas celulares

A célula epitelial intestinal humana (IEC) linha de Caco-2 representa um modelo amplamente utilizada para estudar os eventos moleculares envolvidos nos passos de progressão da diferenciação e do cancro [34]. Geração e fenótipos das linhas IEC humanas derivadas de células Caco-2 (obtido a partir de ATCC Cat # HTB-37; lote 1537739) estavelmente transfectadas com construções de expressão de TLR4-D299G TLR4-WT, ou foram recentemente descritos em pormenor [35]. Caco-2-TLR4-WT exposição típica morfológicas e propriedades funcionais do enterócito normal, maduro, e foram nomeados Caco-2

WT. O padrão de crescimento de células Caco-2

WT é não-invasiva e IEC iniciar a polarizar no sentido de confluência, comparável a Caco-2 parental. Em contraste, a Caco-2-RST4-D299G adoptar um fenótipo agressivo de células de carcinoma do cólon [35], e foram denominado Caco-2

D299G. O crescimento acelerado de Caco-2

D299G é altamente invasivo e IEC permanecem num estado indiferenciado, apesar de confluência. Os fenótipos descritos anteriormente foram reproduzidas em 3 clones de Caco-2

WT e 3 clones de Caco-2

D299G [35].

linhas celulares adicionais derivadas de pacientes com adenocarcinoma colorretal humano foram adquiridos da ATCC: 174T LS (cat # CL-188; muito 3.752.718), HT-29 (cat # HTB-38; muito 1.467.609), HCT-116 (cat # CCL-247; muito 60.286.831) e SW480 (cat # CCL- 228; [36]), que todos variavelmente expressar MUC2 [37-39]. Caco-2, HT-29 e HCT 116 foram crescidas em teor elevado de glucose (4,5 g /L) DMEM (Life), SW480 em de Leibovitz L-15 (vida) e LS 174T em EMEM (ATCC). Todos os meios foram suplementados com 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Vida ou PAA) e 10% de FBS (Thermo; lote RYF35911), excepto Caco-2, que recebeu 20% de FBS. Todas as linhas celulares foram rotineiramente testados negativo para micoplasma (MycoAlert

™; Lonza).

plasmídeo constrói e transfecção estável

Clones de miExpress eGFP-marcado

™ miRNAs precursores de miR -205 (cat # HmiR0026-MR04) e miR-373 (cat # HmiR0347-MR04) e correspondente precursoras miARN mexidos clone de controlo (miR-C) para o vetor pEZX-MR04 (cat # CmiR0001-MR04), bem como clones de mCherry tagged miArrest

™ inibidores de miRNA de miR-205 (α-miR-205; cat # HmiR-AN1314-AM02), miR-373 (α-miR-373; cat # HmiR-AN0461-AM02) e miRNA correspondente inibidor mexidos clone de controlo (α-miR-C) para o vetor pEZX-AM02 (cat # Cmir-AN0001-AM02) foram obtidos a partir de GeneCopoeia (Rockville, EUA). Plasmídeos (EndoFree Maxi, Qiagen) de miRNAs foram estavelmente transfectado em inibidores de Caco-2

WT e miRNA enterócitos-like em carcinoma-como Caco-2

D299G, respectivamente. A transfecção foi executada em um poli-D-lisina revestido placa de 12 poços utilizando o plasmídeo de 1 ug /poço (Lipofectamina LTX, Thermo Fisher). subclones estáveis ​​foram seleccionados com 1 ug /ml de blasticidina e 1-3μg /ml de puromicina (Invivogen). 14-34 subclones por plasmídeo foram expandidas e rastreados para a expressão eGFP /mCherry por microscopia fluorescente. Entre os 2-7 restantes candidatos por plasmídeo, subclones individuais foram escolhidos com base em melhores níveis de expressão de maturidade miR-205 e miR-373 por meio de análise qPCR.

Antes de experimentos, as células (0,7-3 x 10

5/2 mL) foram cultivadas durante 8 dias, a menos que indicado de outra maneira. O meio condicionado a partir de Caco-2

D299G foi concentrada utilizando Amicon (3 kDa) unidades de filtragem centrífuga-4 Ultra (Millipore) e incubadas com Caco-2

WT durante 18 h.

CD-1

nu /nu

modelo de xenotransplante

fêmea CD-1

nu /nu

ratos (Charles River) foram alojados em condições livres de patógenos específicos rigorosos no Biotério Central, Hospital Universitário de Essen, Alemanha. Protocolos cumpriram a lei alemã para uso de animais vivos e o estudo foi aprovado pelo-Rhine Westphalia Agência Estadual do Norte para a Natureza, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor. xeno experiências foram realizadas, tal como previamente descrito [35]. Sob anestesia induzida por isoflurano, CD-1

nu /nu

ratos (

n

= 4) com idade de aproximadamente 7 semanas foram injetados

s

.

c

. nos flancos com suspensões de 1 x 10

6 células individuais em 200 ul-alta concentração Matrigel

® /PBS (1: 1). Os ratos foram injectados

i

.

p

. (0,5 mg em 500 ul) a cada 5

th dia com anticorpos GM1 policlonal anti-asialo para eliminar a atividade das células natural killer. Os tumores foram medidos com compassos digitais e volume tumoral (

V

) foi calculada utilizando a fórmula:

V

= 0,4 x

a

x

b

2 [

a

: comprimento;

b

: width]. Todos os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical. Os tumores foram retirados após 11 ou 23 dias a partir de ratos mortos, cortada,-fixados em formalina e embebidos em parafina e secções transversais (5 �) foram coradas. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados.

RNA /extração de miRNA e em tempo real qPCR análise de expressão

amostras de células foram congeladas em trizole (RNA) ou Qiazol ( miARN) a -80 ° C. O ARN total a partir de células foi extraído (Kit RiboPure, Thermo Fisher Scientific) e purificado (Kit RNeasy, Qiagen). miARN foi isolado utilizando o Kit de miRNeasy (Qiagen). amostras de tecidos FFPE foram cortados em secções de 10 um de espessura após macrodissection (para enriquecer o conteúdo região-de-interesse, conforme necessário). miARN foi extraído a partir de um a seis secções sequenciais do mesmo bloco de parafina utilizando o Kit miRNeasy FFPE (Qiagen) com a solução desparafinização (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. miARN (1 ug) foi transcrito em ADNc utilizando o estojo miScript II RT (Qiagen). A análise em tempo real qPCR foi realizado usando o kit de um-passo QuantiFast SYBR Green RT-PCR (Qiagen) sobre o sistema de amplificação em tempo real (Eppendorf) “EP realplex

2 Mastercycler”. QuantiTect Primer ensaios (Qiagen) foram utilizados como os pares de iniciadores específicos para o gene. Os níveis de expressão de miARN foram analisados ​​utilizando miScript Primer Ensaios (Qiagen) com o miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) no sistema de tempo real “EP realplex

2 Mastercycler”. número de cópias de transcrições individuais foram relacionados a GAPDH (mRNA) ou RNU6 (miRNA) como controles endógenos (x /100.000 cópias) e normalizados, como indicado.

análise de proteínas por immunoblotting

As proteínas foram isoladas a partir de células cultivadas em tampão de lise gelado (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1% de Triton-X (Thermo Fisher Scientific), suplementado com PhosSTOP /fosfatase completas Mini inibidores da protease mistura comprimidos e PMSF 1 mM ( Roche)). A imunotransferência foi realizada como descrito anteriormente [36]. Para confirmar carga de proteína iguais, géis foram corados com SimplyBlue (Thermo Fisher Scientific) e transferências foram sondado com anti-GAPDH. blots representativos de pelo menos 2 experiências independentes são apresentados.

ELISA

As concentrações de TFPI CHI3L1 e em sobrenadantes de cultura de células foram determinadas usando a quitinase-3-1 como o ser humano e do Factor Tecidular Inibidor da Via Quantikine kits ELISA (R D Systems), de acordo com as instruções do fabricante

o exame histopatológico, imunofluorescência, imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

a análise histopatológica

a análise histopatológica.. foi realizada por H e e mancha de reacção ácido periódico de Schiff (PAS) de acordo com protocolos padrão

imunofluorescência

As células foram cultivadas em poli-D-lisina lâminas de 8 câmaras bem… Dependendo anticorpos primários (Tabela S2), as células foram fixadas com paraformaldeído (Electron Microscopy Sciences) ou acetona (100%). As células foram bloqueadas durante 60 min à temperatura ambiente e incubados com anticorpos primários ou fluorescente marcado numa câmara humidificada o /n a 4 ° C. AlexaFluor

® anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com 647 foi usado como anticorpo secundário, se necessário. As experiências de controlo foram realizadas com o controlo do isotipo IgG (Santa Cruz). Após a montagem com Vectashield Meio de Montagem com ou sem DAPI (Vector Laboratories), coloração de imunofluorescência foi avaliada usando seccionamento óptico com confocal (Axiovert 100M com LSM510) ou iluminação estrutural (Axio Observer.Z1 com ApoTome) microscópios (Zeiss). A opção multitrack e digitalização sequencial para cada canal foram usadas para eliminar qualquer conversa cruzada dos cromóforos.

imuno-histoquímica.

xenoenxertos FFPE-seções foram coradas de acordo com as instruções do fabricante (Cell Signaling) .

TEM.

as células foram cultivadas durante 8 dias em inserções (0.4μm tamanho dos poros), fixado com gelado glutaraldeído 2% e processados ​​pela Facilidade TEM core, Heinrich-Heine Universidade, Düsseldorf, Alemanha. Em resumo, as células foram pós-fixadas em osmiumtetroxid em tampão fosfato Millonig`s, contrastado com uranylacetate, desidratados em concentrações crescentes de etanol e embebidos em Spurr. As secções foram cortadas em um ultramicrotome e micro-representados graficamente com um microscópio eletrônico de transmissão (Hitachi-H600) a 75kV (5000x ampliação).

Análise da adesão celular, invasão, proliferação e chemoresistance

celular aderência.

Redução adesividade intercelular pode permitir a invasão de câncer e metástase pela dissociação celular a partir de ninhos de câncer. células epiteliais diferenciadas, que formam associações célula-célula e célula-substrato apertados, a tripsina-resistente, enquanto as células mesenquimais, que não têm esses mecanismos de adesão, são sensíveis ao tripsina [40]. Para testar se o miR-205 e miR-373 pode diminuir a adesão, foi utilizado o ensaio de tripsinização diferencial. Para a avaliação da adesão celular por tripsinização diferencial, as células foram cultivadas em poli-D-lisina lâminas de 8 câmaras bem durante 3 dias, lavou-se uma vez e, em seguida, incubadas com 0,05% de tripsina /EDTA a 0,02% (PAN-Biotech) durante 2 min. reacção enzimática foi parada pela adição de meio de cultura inteiro. As células remanescentes foram fixadas com 3,7% de paraformaldeído durante 15 minutos e coradas com solução hemalum de Mayer (Merck).

Invasão.

Uma vez que as células cancerígenas são capazes de dissociar a partir do tumor primário, que podem invadir o tecidos circundantes. Para a invasão das células tumorais [35], as células (1,3 x 10

5/2 ml) foram cultivados em BD Biocoat Matrigel

®-pré-revestidas transwells 6 poços por 25 dias. Células invasoras da membrana foram de metanol-fixadas e coradas com violeta de cristal de 0,26% (Sigma).

Proliferação e quimioresistência.

Clinicamente, resistência a drogas de tumores pode permitir a progressão da doença. Nós examinamos a proliferação de células basais e sensibilidade à quimioterapia de rotina (MTX) por Titer celular 96

® AQ

ueous One Solution (baseado em MTS) de Proliferação Celular Ensaio da Promega.

A análise de imagem

Para histopatologia, imuno-histoquímica, citologia (adesão celular e ensaios de invasão), imagens de alta resolução foram capturados usando o sistema Aperio ScanScope (Aperio Technologies) e visualizados usando software escopo imagem (versão 11.2.0.780, ImageScope). Para a microscopia de imunofluorescência, adquiriu imagens foram processadas utilizando LSM510 v3.2 ou 2012 software ZEN Blue (Carl Zeiss). Em todas as experiências, pelo menos 4 locais individuais de captura de imagem foram escolhidos ao acaso para cada amostra. resultados morfológicos foram considerados significativos somente se pelo menos 70% das seções digitalizados por campo exibiu o efeito observado.

A análise estatística

O teste exato de Fisher foi utilizado para tabelas de contingência para comparar as proporções de pacientes. O teste de classificação assinado Wilcoxon foi utilizado para comparar a expressão miRNA entre pares combinados de tumores e tecidos humanos normais dentro do mesmo subgrupo câncer. O teste t não pareado foi utilizado para comparar a expressão miRNA entre os diferentes subgrupos de câncer e em todos os outros experimentos, salvo indicação em contrário. Todos os testes foram bicaudais (GraphPad Prism Software versão 5.04) e um

p valor

de 0,05 foi considerado significativo. Todos os dados são expressos como média ± SEM.

Resultados

Os níveis de expressão de miR-205 e miR-373 são aumentados em cancros do cólon humano produtoras de mucina

Nós investigamos a papel de miR-205 e miR-373 na fisiopatologia de diferentes subtipos histológicos de cancro colo-rectal, avaliando a sua expressão, em conjunto com a de outras miARNs, em amostras de adenocarcinoma do cólon humano convencional, mucinoso e UC-associado. Foram examinados tecidos tumorais Apenas combinado com não-neoplásicas, margens cirúrgicas normais adjacentes (R

0) de cada paciente. Os níveis de expressão de miR-205 e miR-373 foram especificamente aumentado nos dois subgrupos de adenocarcinoma do cólon associadas com a produção de mucina (cancros colorrectais relacionados-UC mucinosos e crónicas) em relação à mucosa do cólon normal adjacente (Figura 1A e 1B). De nota, a expressão de miR-205 foi ligeiramente superior no câncer UC-associado em comparação com (não-UC) câncer mucinoso. Não foram identificadas diferenças significativas no miR-205 e miR-373 expressão em tecido de tumor do cólon emparelhado e mucosa normal correspondente de pacientes com adenocarcinoma do cólon convencional (não-mucinoso). Ambos os miARNs foram igualmente expressa em níveis baixos em toda a tecidos de cólon livres de tumor entre os três subgrupos de pacientes. Em contraste, o miR-1, miR-10a e miR-133a foram regulados negativamente nos tecidos tumorais humanos CRC, independentemente do tipo histológico (S1A, S2A e S3A Figs).

Os níveis de expressão de (A) miR- 205 e (b) miR-373 são significativamente regulada em mucinoso humana (

n

= 20) e UC crónica (

n

= 13) áreas de tumor CRC em relação ao combinado R

0 margens, tal como determinado por qPCR. Em contraste, não se observam diferenças significativas no miR-205 e miR-373 expressão entre emparelhado CRC convencional (

n

= 18) tecido do tumor e na mucosa normal correspondente. (C) Embora enterócito semelhante Caco-2

WT mostram baixos níveis de miR-205 e miR-373 expressão, ambos os miARNs são significativamente regulada positivamente em células Caco-2

células D299G carcinoma semelhante do cólon, tal como avaliado por qPCR . (D) A eficiência de transfecção de miR-205 /miR-373 precursores ou inibidores é confirmada por qPCR em recém-gerados (ver Materiais e Métodos) Caco-2

WT /miR-205, Caco-2

WT /miR -373, Caco-2

D299G /a-miR-205 e Caco-2

D299G /α-miR-373 clones (n = 3 por clone). Os resultados são apresentados em relação à expressão RNU6 miARN. Os dados são apresentados como médias ± SEM (ns: não significativo, *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p Art 0.001, ****

p Art 0,0001; a, B: Wilcoxon signed-rank para comparação entre grupos combinados (R

0 vs. tumor), caso contrário, não pareado t-teste; C, D:. teste t não emparelhado)

Clinicamente, cancros do cólon mucinoso exibida uma distribuição estágio do tumor mais progressivo no diagnóstico inicial quando comparado ao convencional ou CRC UC-associado (Tabela 1). doença avançada com metástase órgão distante no momento do diagnóstico foi mais frequentemente observada em pacientes com CCR com o subtipo mucinoso do que em pacientes com tumores UC convencionais ou crónicas. No entanto, nós não identificar quaisquer correlações entre estágios do câncer (incluindo grau histológico) miR-373 níveis de expressão de miR-205 e e em qualquer subtipo.

A expressão de miR-205 e miR-373 é regulada no carcinoma do cólon células

in-vitro

em seguida, teve como objetivo determinar os efeitos de miR-205 e miR-373 em biologia e função celular no epitélio intestinal normal e neoplásico

in vitro

. Nós estabelecemos anteriormente dois

in-vitro

modelos de enterócitos-like (Caco-2

WT) e indiferenciado, carcinoma do cólon-like (Caco-2

D299G) células humanas polarizados, [35 ], tal como descrito em

Materiais e Métodos

. Usando tempo real qPCR, encontramos (Fig 1C) que Caco-2

WT mostraram baixos níveis de miR-205 e miR-373 expressão, enquanto ambos os miRNAs foram significativamente upregulated em Caco-2

D299G. Além disso, o miR-1, miR-10a e miR-133a foram diminuiu acentuadamente em Caco-2

D299G em comparação com Caco-2

WT (S1B, S2B e S3B Figs). Nós também rastreados outras linhas de CRC, mas eles não conseguiram revelar padrões de expressão de miRNA semelhantes aos observados no tecido do cólon humano (S4 Fig). Decidimos continuar usando esses sublinhas IEC (Caco-2

WT e Caco-2

D299G), porque eles idealmente espelhado nossos resultados de amostras de adenocarcinoma colorretal normal e mucinoso emparelhados expressão miRNA de pacientes.

Usando transfecção estável com precursores de miRNA ou inibidores, geramos (ver Materiais e Métodos) miR-205 que expressam e miR-373 expressando Caco-2

clones WT (Caco-2

WT /miR-205; Caco-2

WT /miR-373), bem como o miR-205 de inibição e miR-373 de inibição de células Caco-2

clones D299G (Caco-2

D299G /α-miR-205; Caco -2

D299G /α-miR-373). Como controlos negativos, mexidos clones que expressam o vector foram utilizados (Caco-2

WT /miR-C; Caco-2

D299G /α-miR-C). A sobre-expresso de pré-miR-205 e miR-pré-373 foram transformadas com sucesso para aumentar a expressão de madura miR-205 e miR-373 em células Caco-2

WT, respectivamente, tal como foi confirmado por análise de qPCR (figura 1D). Superexpressão dos inibidores de miR-205- e miR-373- levou à diminuição da expressão de maturidade miR-205 e miR-373 em Caco-2

D299G.

miR-205 induz aumento da produção de mucina, enquanto miR-373 faz com que a desdiferenciação

Como se mostra na figura 2A-2D, o clone de controlo de Caco-2

WT /miR-C demonstraram uma monocamada colunar do normal, IEC polarizada com a produção de mucina regular, enquanto que o controle clone Caco-2

D299G /α-miR-c mostraram uma monocamada achatada de doenças neoplásicas, células indiferenciadas com menos produção de mucina. superexpressão estável de miR-205 em Caco-2

WT formação induzida por células secretoras que contêm grandes vesículas com conteúdo Lucent pálidos que ocupam quase todo o citoplasma (Fig 2A). produção de mucina foi detectada por PAS (figura 2B) e TEM mostraram grandes vesículas no citoplasma apical com menos material de electrões denso (Figura 2C), sugestivo de substâncias mucóides. Análise por imunofluorescência confirmados aumento da produção de MUC2 em Caco-2

WT /miR-205 (Fig 2D). Em contraste, a sobre-expressão de miR-373 em Caco-2

WT características de células pouco diferenciadas e heterogêneos que crescem em folhas planas, que se assemelhavam neoplásica Caco-2 induzida

D299G /α-miR-c (Fig 2A-2D ). Supressão de miR-373 invertida algumas das características neoplásicas de células Caco-2

D299G. inibição estável de miR-373 em Caco-2

D299G levou a organização das células epiteliais polarizadas, que se assemelhava diferenciada Caco-2

WT /miR-c (Fig 2A-2D).

( AD) Caco-2

WT superexpressão de miR-205 ou miR-373 exibição significativas alterações morfológicas quando comparado ao grupo controle Caco-2

WT /miR-c. Em contraste, a supressão de miR-373 inverte algumas das características neoplásicas de células Caco-2

D299G. Imagens representativas (

n

≥ 2 amostras /clone) mostrando (A) H E coloração (bar, 200 um), (B) PAS (bar, 200 um), (C) TEM (bar, 5m) e (D) coloração de imunofluorescência com anti-MUC2 (AlexaFluor

® 647; amarelo) e DAPI (azul), avaliada por microscopia óptica de corte (bar, 50 um), são mostrados. estrela preta indica vesícula (C); setas brancas indicam muco (B) ou MUC2 (D) estruturas -positivas.

miR-205 e miR-373 perturbar a integridade da barreira epitelial intestinal

Para entender melhor as alterações morfológicas induzidas por miR-205 e miR-373, foi realizada uma série de experiências de coloração de imunofluorescência para avaliar os efeitos sobre a organização estrutural do citoesqueleto de actina (Figura 3A), a distribuição de barreira associada-juncional apertado ZO-1 (Figura 3B) e fosfo- p-catenina (Fig 3C) e formação do fuso mitótico (Fig 3D). A sobre-expressão de miR-205 em células Caco-2

WT mediada desarranjo do citoesqueleto de actina e diminuiu a expressão de ZO-1 na membrana celular, mas não alterou figuras mitóticas. A sobre-expressão de miR-373 em células Caco-2

WT causado perturbação e redistribuição irregular dos filamentos de actina, apertado juncionais ZO-1 e fosforilado β-catenina para o citoplasma, o que implica a função de barreira e cerca de epitélio intestinal comprometida. Além disso, núcleos aumentados de Caco-2

WT /miR-373 revelou perturbações graves do fuso mitótico, comparável a Caco-2

D299G /α-miR-c. Em contraste, a inibição de miR-373 em células Caco-2

D299G promovido aperto epitelial por polarização apical dos filamentos de actina e re-estabelecimento de ZO-1 e fosfo-β-CATENIN- a integridade da barreira associado, reduzindo assim o fenótipo mesenquimal de pouco diferenciado Caco-2

D299G. Notavelmente, Caco-2

D299G /α-miR-373 mostrou metáfases mitóticas normais, comparáveis ​​a Caco-2

WT /miR-c. No entanto, a inibição de miR-205 em células Caco-2

D299G não alterar a aparência do tipo fibroblastos com a desorganização do citosqueleto de actina, redistribuição citoplasmática de ZO-1 e figuras mitóticas aberrantes.

Expressão de miR-205 e miR-373 diferencialmente (A) altera actina do citoesqueleto arquitectura, influências (B) ZO-1 e (C) fosfo-β-catenina -associated a integridade da barreira, e (D) induz a formação de células multinucleadas com fusos multipolares. Imagens representativas (

n

≥ 2 amostras /clone) de coloração de imunofluorescência com (A) phalloidin (AlexaFluor

® 647;

branco

; barra amarela, 20.29μm [distância de 3-dimensional ], bar branco, 100 um), (B) anti-ZO-1 (AlexaFluor

® 647;

branco

; bar, 50 um) e DAPI (

azul e), (C ) fosfo-β-catenina (AlexaFluor

® 647;

verde

; bar, 50 um) e DAPI (

vermelho) e (D) anti-fosfo-histona H3 (PacificBlue <