Sumário
Uma assinatura de expressão de genes associados a fase de genes expressos coordenadamente, incluindo o factor de transcrição Slug (SNAI2) e outros marcadores (EMT) transição epitelial-mesenquimal foi encontrado presentes em amostras de genes disponíveis publicamente conjuntos de dados de expressão em vários tipos de câncer, incluindo os cânceres não epiteliais. Os níveis de genes co-expressa expressão variar de maneira contínua e coordenar forma entre as amostras, variando desde a ausência de expressão para a co-expressão forte de todos os genes. Estes dados sugerem que as células tumorais podem passar através de um processo de EMT-like de mesenquimal em graus variados. Aqui mostra-se que, no glioblastoma multiforme (GBM), esta assinatura é associado com o tempo de recorrência após o tratamento inicial. Ao analisar os dados de The Cancer Genome Atlas (TCGA), descobrimos que os pacientes GBM que responderam à terapia e tiveram muito tempo para recorrência níveis baixos tiveram a assinatura em suas amostras de tumor (
P
= 3 × 10
-7). Nós também descobrimos que a assinatura está fortemente correlacionado em gliomas com o putativo marcador CD44 de células estaminais, e é altamente enriquecido entre os genes diferencialmente expressos em glioblastomas contra gliomas de grau inferior. Os nossos resultados sugerem que a longo atraso antes de recorrência do tumor está associada com a ausência da assinatura mesenquimal, levantando a possibilidade de que a inibição desta transição pode melhorar a durabilidade do tratamento de doentes de glioma
citação:. Cheng WY, Kandel JJ, Yamashiro DJ, Canoll P, Anastassiou D (2012) a expressão Assinatura multi-Cancer Gene mesenquimais transição é associada ao tempo prolongado de recorrência em Glioblastoma. PLoS ONE 7 (4): e34705. doi: 10.1371 /journal.pone.0034705
editor: Jeffrey K. Harrison, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de dezembro de 2011; Aceito: 06 de março de 2012; Publicação: 06 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado a partir de royalties de patentes rendimentos do inventor da Universidade de Columbia. A patente está relacionada com a pesquisa descrita no papel. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
uma assinatura de expressão de genes associados a fase de multi-cancro foi recentemente identificado [1], que consiste de um conjunto de genes que são sobre-expressos coordenadamente apenas em amostras de cancro que tenham ultrapassado um determinado estágio específico para cada tipo de cancro . A Tabela 1 contém uma lista de 64 genes correspondentes aos 100 primeiros conjuntos de sondas (tal como apresentado em [1]), da assinatura. A assinatura contém numerosos transição epitelial-mesenquimal (EMT) marcadores [2], [3], [4], tais como o factor de transcrição de indução de EMT Slug (SNAI2), bem como COL5A2, FAP, POSTN, COL1A2, COL3A1, FBN1, TNFAIP6, MMP2, GREM1, BGN, CDH11, SPOCK1, DCN, COPZ2, THY1, PCOLCE, PRRX1, PDGFRB, SPARC, INHBA, COL6A2, FN1, ACTA2. No entanto, o assinatura também está presente mesmo em alguns cancros não epiteliais, tais como neuroblastoma e sarcoma de Ewing. Em cada conjunto de dados, o nível dos genes expressos co-expressão varia de uma maneira contínua através das amostras. Numa experiência recente que também confirmou que a maioria dos genes da assinatura, incluindo α-SMA, são expressos em algumas células de cancro humano xenoenxertados si
In vivo
, mas não nas células de ratinho hospedeiro [5]. Estes resultados indicam que as células cancerosas pode passar através de um processo de transição mesenquimal em diferentes graus variam de ausência total de expressão a uma forte co-expressão dos genes da assinatura, e, por conseguinte, os percursos subjacentes correspondentes são activadas dentro das células cancerígenas, em conjunto com outros percursos no microambiente tumoral fornecendo interacções contextuais.
o nível de expressão média de 64 destes genes pode ser pensado como o nível de expressão que representa uma METAGENE o assinatura, a que nos referimos como o “mesenquimais metagene transição. “Nossa hipótese é que este valor está associado com dados clínicos em glioblastoma multiforme (GBM) para os quais há ricos tais dados disponíveis no The Cancer Genome Atlas (TCGA). Descobrimos que houve de fato forte associação do metagene com o fenótipo “Dias para recorrência do tumor”, definida como o período de tempo de tratamento inicial até a data do diagnóstico ou o reconhecimento da presença e da natureza do retorno de sinais e sintomas de cancro após um período de melhoria. Os pacientes que não apresentaram melhora após a terapia ter uma entrada “nulo” no campo correspondente.
Métodos
Para a análise estatística utilizou-se o somatório do rank dos pacientes com longo tempo de recorrência após a classificação os doentes em termos de METAGENE mesenquimal. Para avaliar a significância estatística, foi calculado o
P valor
de sua definição utilizando a função distribuição empírica. Além disso, foi realizada regressão de Cox entre os dias de recorrência do tumor e ao nível da assinatura de expressão.
Nós também realizada regressão de Cox multivariada em dias de recorrência do tumor, usando tanto os valores de expressão do metagene mesenquimais transição ea quatro subtipos de glioblastoma como co-variáveis.
resultados
a Figura 1 mostra um gráfico de dispersão em que cada uma das 99 amostras para o qual os “Dias para recorrência do tumor” fenótipo tem uma entrada de não-nulo é representado por um ponto que indica o nível de expressão do METAGENE mesenquimal e o número de dias de recorrência do tumor. A figura revela que, dentro do grupo de pacientes que experimentaram uma melhoria após a terapia, os pacientes cujos tumores oito recorreu mais do que três anos seguintes de terapia tem valores muito baixos de expressão do METAGENE. A Figura 2 mostra um mapa de calor dos 64 genes, em que as amostras são classificados em termos da expressão da metagene e oito pacientes para os quais o tempo de recidiva foi mais do que três anos são destacadas em verde. A soma classificação para estes oito pacientes é 1 + 2 + 6 + 7 + 9 + 11 + 16 + 18 = 70. A soma classificação é particularmente bem adaptado como uma medida deste aspecto observado particular da associação dos “Dias para Tumor a recorrência “fenótipo com a expressão de um gene, em que é requerida a ausência de expressão do gene para excepcionalmente longo tempo de recorrência. A probabilidade de a soma classificação sendo ≤70 devido ao puro acaso é estimado como a frequência relativa de tais ocorrências após permutando aleatoriamente os fenótipos dez milhões de vezes e recalcular a soma classificação, concluindo que
P
= 3 × 10
-7, que é também a probabilidade de encontrar que a soma de oito números escolhidos aleatoriamente distintas entre 1 e 99 é menor do que ou igual a 70.
Cada ponto no gráfico de dispersão representa um dos 99 pacientes para os quais os “Dias para recorrência do tumor” fenótipo tem uma entrada não nula. O eixo horizontal mede a média dos níveis de expressão de RMA-normalizados dos 64 genes mostrados na Tabela 1. O eixo vertical mede os dias de recorrência do tumor e a linha ponteada horizontal é traçada no ponto de corte de 3 anos.
as 99 amostras são classificados em termos de nível médio expressão dos genes apresentados na Tabela 1. os oito pacientes para os quais o tempo de recidiva foi mais de três anos são destacadas em verde no 1
st, 2
nd, 6
th, 7
th, 9
th, 11
th, 16
th e 18
th posição, resultando na classificação montante de 70 .
Nós também separou todo o conjunto de 545 amostras de tumores em dois grupos de igual tamanho, contendo alta versus baixos níveis da metagene mesenquimais transição. Dentro das 99 amostras contendo uma “Dias para recorrência do tumor” campo, havia 48 “baixo nível” e 51 amostras de “alto nível”. Foi realizada regressão de Cox entre dias de recorrência do tumor e o nível de expressão da assinatura. A Figura 3 contém as correspondentes curvas de sobrevida de Kaplan-Meier, resultando em uma associação claramente visto com significância estatística de P = 0,0054 usando um teste qui-quadrado.
As amostras tumorais 545 foram divididas em dois grupos de igual tamanho, dependendo seus níveis da METAGENE mesenquimal. São mostradas as curvas de Kaplan-Meier para as amostras correspondentes com entradas nos “Dias para recorrência do tumor” campo.
Em seguida, usamos a soma classificação métrica para identificar quais, entre as individuais 64 genes da Tabela 1 definição do metagene tem a melhor pontuação, esperando que alguns deles teriam posto montante inferior 70. Notavelmente, a melhor gene pontuação foi COL5A1 com grau soma igual a 78 seguido de COL6A2 com a soma classificação igual a 82. Em outras palavras, a pontuação do METAGENE é significativamente melhor do que a de qualquer dos seus genes de componentes individuais. Ainda mais impressionante, depois de fazer pesquisa exaustiva entre todos os 12.042 genes, o topo gene classificado (EFEMP2) tinha soma classificação igual a 75, ainda pior do que isso (70) do metagene. Estes resultados sugerem que o assinatura identificados em [1] compreende um conjunto sinérgica de genes correspondentes a um mecanismo biológico de mesenquimal, que, quando ausente, está associada com aumento do período de tempo de recorrência tumoral no GBM.
Tabela 2 mostra uma lista das 30 melhores genes individuais em termos de sua soma classificação para os “Dias para recorrência do tumor” fenótipo. Nove desses 30 genes, destacadas na Tabela 2, estão entre os 64 genes da Tabela 1, demonstrando o enriquecimento forte (
P
= 3 × 10
-14) de marcadores EMT nesta coleção imparcial de genes associados com o fenótipo.
enquanto todos os casos no conjunto de dados TCGA foram diagnosticados como glioblastoma, a recorrência retardada nestes oito casos é mais uma característica de gliomas de grau inferior. Portanto, foi investigado se os gliomas de grau inferior, também são caracterizadas por níveis mais baixos de a assinatura através da análise do Repositório NCI for Molecular Cérebro Neoplasia dados (Rembrandt) conjunto de dados, que inclui a expressão do gene a partir de ambos glioblastoma, bem como vários tipos de gliomas de grau inferior. Tabela 3 demonstra que, na verdade, não é o enriquecimento forte (sete dos 64 genes da Tabela 1 estão entre os mais bem classificados 30 genes diferencialmente expressos,
P
= 10
-13). Além disso, encontramos forte correlação entre os níveis de expressão do metagene e o marcador de células CD44-tronco cancerosas (
P
= 5 × 10
-56 baseado em montagem de correlação de Pearson para distribuição t). A Figura 4 mostra o gráfico de dispersão correspondente. Estudos recentes mostraram que os níveis elevados de CD44 são expressos nas células estaminais do cancro isoladas a partir de vários tipos diferentes de tumores [6], embora este conceito está ainda em evolução, e também CD44 é expresso numa variedade de outros tipos de células. CD44 tem sido encontrada numa população de células enriquecidas em células estaminais glioma [7]. Também é amplamente expresso em glioblastoma, e os níveis aumentados estão associados com a progressão do glioma e resistência à terapia com [8].
Cada ponto no gráfico de dispersão representa uma amostra de glioma a partir do Repositório NCI for Molecular Cérebro Neoplasia dados ( Rembrandt) dataset. Pontos são codificados por cores vermelho por glioblastomas e azul para gliomas de grau inferior. Os níveis de expressão são RNA normalizado.
A análise de dados de expressão de genes resultou na classificação em vários subtipos de glioblastomas [9], [10], também presente em gliomas de grau mais baixos [11], com características distintas, cada uma das quais é caracterizada pela presença de genes específicos. Curiosamente, CD44 foi encontrado enriquecido nos subtipos mesenquimais em todos estes casos. A funcionalidade dos nossos resultados actuais, no entanto, é que o assinatura mesenquimal utilizado no presente documento reflecte um processo biológico aplicável a vários tipos de cancro, uma vez que foi derivado por meio da análise da sua presença em muitos cancros diferentes [1], em oposição à utilização de classificação métodos em amostras de glioma sozinho para identificar subtipos. Além disso, a associação com o fenótipo é encontrada na ausência, e não a presença, da assinatura
.
Para confirmar que a associação observada com os “Dias para a recorrência do tumor” fenótipo está mais relacionado com a presença de o assinatura mesenquimal, em vez de para a classificação em um subtipo mesenquimais, foi realizada multivariada de Cox regressão em dia para a recorrência do tumor, utilizando ambos os valores de expressão do METAGENE mesenquimal e os quatro subtipos [9] como covariáveis. A variável subtipo é uma variável categórica com quatro tipos (mesenquimais, Clássica, neural e proneural). Para inferir as amostras cujos subtipos não foram dadas no artigo original, foi realizada uma imputação vizinho dez mais próximo com base nos genes assinatura dos quatro subtipos como mostradas no [9]. O resultado mostra que a variável expressão metagene mesenquimais transição é a única covariável significativa (com
P
= 0,049), enquanto o resto das variáveis categóricas não passou o nível de significância de 0,05 (a mínima foi de 0,160 para o subtipo mesenquimais), demonstrando que os “dias de recorrência do tumor” fenótipo é mais significativamente associado à assinatura mesenquimais transição. Os resultados de regressão de Cox, estão apresentados na Tabela 4.
Para comparar directamente a assinatura ainda mais mesenquimal com a do subtipo mesenquimais de [9], foi criado um METAGENE para esta última de modo que podemos avaliar a sua associação com os “Dias para recorrência do tumor” fenótipo medido pela soma rank. Isto foi criado usando a lista de genes, tal como descrito nas informações suplementares do papel, disponível em https://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/gbm_exp. Especificamente, no ficheiro de dados associado, contendo os valores de expressão e chamadas de subtipo para as amostras de núcleo TCGA utilizando os dados escalonados unificadas, há 216 genes identificados como mesenquimais. Estes genes foram ordenadas em termos do seu poder para representar o fenótipo mesenquimal, tal como determinado pelas diferenças entre o componente mesenquimais centroide de cada gene e o componente centróide dos subtipos restantes, que também pode ser considerado como a variação de log-dobra entre a média do gene valor no subtipo mesenquimais e média do gene geral [12] (como citado no arquivo de dados que contém a lista gene ClaNC840 e centroids). Com base nessa classificação, selecionou-se a parte superior 64, de modo que os tamanhos dos dois Metagenes a serem comparados são idênticos. O valor da soma classificação foi de 142 (que teria sido 151 se estiver usando todos os 216 genes). Isto deve ser comparado com o valor correspondente de 70 do METAGENE mesenquimal e com as outras entradas de genes individuais na Tabela 2. Estes resultados confirmam ainda que a associação observada com dias de recorrência do tumor é devido à assinatura mesenquimal multi-cancro , que tem a propriedade notável que o metagene correspondente tem menor soma classificação do que qualquer gene individual.
Discussão
Porque gliomas não são cancros epiteliais, ea assinatura também foi encontrado em outros tipos de câncer não epiteliais , tais como o neuroblastoma e sarcoma de Ewing, o assinatura representa um processo biológico mais geral de mesenquimal, aplicável a todos os cancros sólidos que tentámos. Na verdade, quando o conjunto de genes da Tabela 1 são a entrada para Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) [13] contra o banco de dados assinaturas moleculares (MSigDB), há muitos resultados com
P
valor exatamente igual a ” zero “, correspondente a genes expressos em amostras de maior palco de muitos tipos de câncer, como nasofaringe, cabeça e pescoço, urotelial, linfomas, etc. Esses tipos de câncer não havia participado de nenhuma forma na derivação da assinatura. Esta validação notável da assinatura, apontando para todos os tipos de tipos de câncer em MSigDB sugere que a assinatura pode refletir um mecanismo biológico universal de transição mesenquimal presente na fase invasiva de todos os cancros sólidos, incluindo glioblastoma. Análise de conjuntos de dados relacionados sugere que há múltiplos caminhos afetados compreendem um mecanismo biológico particularmente complexa que aparece para reativar programas de desenvolvimento embrionário. Na verdade, quando se analisa a assinatura de 64 genes contra MSigDB Gene Ontologia conjuntos de dados de processo biológico, os cinco melhores resultados foram todos relacionados ao desenvolvimento (esquelético, órgão, do organismo multicelular, sistema, estrutura anatômica). O componente celular GO proeminente era matriz extracelular, e a proeminente GO função molecular foi de ligação do colagénio.
Recentemente, foi sugerido que “stemness” em células tumorais (caracterizada pela capacidade de ambos os auto-renovar, bem como gerar descendentes diferenciados) pode ser intimamente interligado com passagem por um EMT. Por exemplo, em alguns modelos de EMT foi encontrada para gerar células com as propriedades de células estaminais [14], [15], [16], [17], [18]. Notavelmente, tem sido demonstrado que as células estaminais-como isolados a partir de cancro da mama humano co-expressam níveis elevados de CD44 e níveis elevados de marcadores mesenquimais, incluindo Slug [14]. Além disso, induzindo EMT em células epiteliais mamárias humanas imortalizadas leva a elevados níveis de expressão de CD44 nas células mesenquimais do [14]. A resistência aos fármacos também tem sido associada com a presença de cancro de células estaminais [16], [18], [19], [20], apoiando a noção de que as células-tronco do cancro podem ser responsáveis para a recorrência após a intervenção terapêutica. Por conseguinte, e tendo em conta o forte correlação da assinatura mesenquimal com CD44, uma explicação possível para a ausência da assinatura mesenquimal em pacientes com excepcionalmente longo tempo de recorrência pode ser devido a uma correspondente falta de stemness nas células cancerosas destes pacientes tornando-o mais improvável para o câncer a se repetir após o tratamento. Uma explicação alternativa para a associação observada pode ser fornecida por a transformação para um fenótipo mais mesenquimais [21].
Embora haja diversos factores de indução de transcrição EMT [22], alguns dos quais também são encontrados em ocasionalmente upregulated o assinatura mesenquimal caracterizado por os genes na Tabela 1, Slug é o único encontrado consistentemente regulada positivamente. Ele também foi o único fator de transcrição, tais regulada nos xenoenxertos experimentais [5]. Slug recentemente também tem sido encontrado para ser associado com a invasão de glioma em [23], consistente com os resultados aqui apresentados. Além disso, quando se classificou todos os genes em termos de correlação (usando a medida de informação mútua [24]) da sua expressão com a de Slug nas 99 amostras que analisamos aqui, descobrimos que, curiosamente, os oito melhores entradas ( COL6A3, COL3A1, LUM, COL5A1, COL1A2, COL6A2, COL1A1, PCOLCE) foram todos os genes incluídos em ambas as Tabelas 1, bem como Tabela 2, apoiam a hipótese de que Slug pode ser um regulador mestre do mecanismo biológico responsável pela assinatura. Foi encontrado recentemente [25], no entanto, que a sobre-expressão induzida do factor de transcrição da torção no glioblastoma leva a um aumento da capacidade de invasão e expressão de vários genes na Tabela 1, incluindo Slug, sugerindo que a torção pode desempenhar um papel causal para a transição mesenquimais no glioblastoma
a mesma assinatura também foi encontrado para ser preditiva da terapia neoadjuvante em câncer de mama -. veja, por exemplo, arquivo adicional 6 de [1], em que 7 de 8 amostras no cluster do lado esquerdo do mapa de calor (com baixos níveis de assinatura) tiveram boa resposta à terapia, enquanto 12 das 14 amostras no segundo cluster ( com níveis elevados da assinatura) eram resistentes.
as observações de que (a) todos os pacientes com GBM excepcionalmente longo tempo de recorrência teve níveis extremamente baixos do gene assinatura mesenquimal, e (b) o assinatura mesenquimal é fortemente enriquecida entre os genes underexpressed em gliomas de grau inferior em comparação com os glioblastomas, sugerem que a segmentação do mecanismo biológico subjacente pode fornecer uma nova abordagem para o tratamento adjuvante de gliomas. Além disso, a capacidade de identificar com precisão os componentes do gene assinatura oferece oportunidades únicas para a identificação de potenciais alvos para tal tratamento.
Reconhecimentos
Avaliação é expressa ao Prof. Tian Zheng do Departamento de Estatística da Universidade de Columbia para discussões úteis.