Abstract
O câncer colorretal (CRC) é um dos tipos de câncer mais comum em países desenvolvidos. Para identificar as redes moleculares e processos biológicos que estão desregulados no CRC comparado a mucosa do cólon normal, aplicamos Gene Set Análise de Enriquecimento a dois conjuntos de dados de transcriptoma independentes, incluindo um total de 137 CRC e dez amostras de mucosa do cólon normais. Oitenta e dois conjuntos de genes, tal como descrito pela Enciclopédia Kyoto de genes e banco de dados de genomas tinha alterado significativamente a expressão do gene em ambos os conjuntos de dados. Estas redes incluídos associada com a divisão celular, a manutenção de ADN, e metabolismo. Entre as vias de sinalização com as alterações conhecidas em genes-chave, o “rede de sinalização fosfatidilinositol”, que compreende parte da via PI3K, foi encontrado desregulamentado. Os genes regulados negativamente nesta via incluídos vários membros da família de proteínas fosfolipase C, e a redução da expressão de dois destes,
PLCD1
e
PLCE1
, foram validados com sucesso em biópsias de CRC (n = 70) e linhas de células (n = 19) por análises quantitativas. A repressão de ambos os genes foi encontrado associado com
KRAS
mutações (
P
= 0,005 e 0,006, respectivamente), e observou-se que os carcinomas estáveis microssatélites com expressão
PLCD1
reduzida mais frequentemente tinha
TP53
mutações (
P
= 0,002). Metilação do promotor análises de
PLCD1
e
PLCE1
realizada em linhas celulares e biópsias de tumor revelou que a metilação de
PLCD1
pode contribuir para expressão reduzida em 40% dos carcinomas instáveis microssatélites . Em conclusão, nós identificamos vias significativamente desregulados no CRC, e validado repressão da
PLCD1
e
expressão PLCE1
. Isto ilustra que a abordagem GSEA podem orientar descoberta de novos biomarcadores em câncer
Citation:. Danielsen SA, Cekaite L, Agesen TH, Sveen A, Nesbakken A, Thiis-Evensen E, et al. (2011) fosfolipase C Isoenzimas desregulamentados em câncer colorretal – Insights adquirida com Gene Set Enriquecimento A análise do transcriptoma. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10.1371 /journal.pone.0024419
editor: Baochuan Lin, Naval Research Laboratory, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de maio de 2011; Aceito: 10 de agosto de 2011; Publicação: 01 de setembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Danielsen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado por doações do Cancer Society norueguês (https://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: não PR-2006-0442, incluindo bolsas de doutoramento de Tha SAD e; GEL:. PR-2008-0163; RIS : PR-2007-0166), por uma concessão do Conselho de Pesquisa em Rikshospitalet-Radiumhospitalet Saúde Empresarial (RAL: incluindo uma bolsa de doutoramento para aS), por uma concessão da Autoridade de Saúde Noruega Regional do Sudeste (http: //www .helse-sorost.no /omoss /Inglês /Sider /Page.aspx) (RAL: PR-2009-093, incluindo concessão de pós-doc para LC) e bolsa da Fundação norueguesa para a Saúde e Reabilitação (http: //www. extrastiftelsen.no/) através dos fundos extra (ETE: HF-52015/002). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer colorretal (CRC; MIM # 114500) está em terceiro lugar na incidência de câncer em todo o mundo com uma estimativa de 1,2 milhões de novos casos por ano [1]. De acordo com a Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC) as taxas de sobrevida em 5 anos para pacientes diagnosticados com a fase I e fase IV CRC, são 93% e 8%, respectivamente, assim, o prognóstico do paciente é altamente dependente do estágio do tumor no momento do diagnóstico [2 ]. CRC desenvolve através de fases distintas histopatológicos de lesões precursoras benignos para tumores malignos, conhecida como a sequência adenoma-carcinoma. O desenvolvimento é determinada pela acumulação progressiva de alterações genéticas e epigenética de genes específicos, e conservada redes que exercem efeitos pleiotrópicos sobre as células de cancro são frequentemente alvo de sinalização. Tipicamente, os tumores malignos caracterizam-se pelo fenótipos moleculares instabilidade microssatélite (MSI), instabilidade cromossomal (CIN), e o fenótipo ilha CpG methylator (CIMP) [3]. Os genes mais comumente alterados durante o desenvolvimento CRC formam a base para estes fenótipos e envolvem várias vias de sinalização e redes (Figura 1A).
A) genes-chave específicas nos diversos fenótipos CRC durante o desenvolvimento de lesões precursoras de carcinomas . Genes em negrito representam MAPK, PI3K e redes TP53 sinalização, e seu estado de mutação foram previamente determinado [38]. B) A figura mostra como parte da rede de fosfatidil inositol interage com a via PI3K canónica. Genes de que os dados de status de mutação são utilizados para a associação analisa no presente trabalho são coloridos em azul, rosa e marrom. Abreviaturas: GPCR, L-receptor acoplado a proteína; RTK, receptor tirosina quinase.
O RNA mensageiro (mRNA) perfil de expressão estudos têm fornecido uma melhor compreensão dos papéis de vários genes importantes na iniciação e progressão do câncer, inclusive CRC [4]. Apesar do crescente conhecimento dos padrões de expressão de genes individuais, bem como as assinaturas de genes promissora, menos visão foi obtida em alterações de redes moleculares e vias de sinalização a partir da grande quantidade de dados gerados em tais estudos. Ao aplicar a abordagem estatística de Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) para dados de expressão gênica, interagindo genes cujos níveis de expressão são coordenadamente mudou podem ser exploradas [5]. O método GSEA leva em consideração a expressão de todos os genes dentro de uma anotada conjunto de genes /via. Existem várias bases de dados e definições de genes definir que ligam genes por suas anotações funcionais. Os termos mais amplamente utilizado é a base de dados Gene ontologia (GO), que se baseia numa combinação de atribuição computacional e manual de genes que ir [6]. No entanto, estes termos não correspondem diretamente para vias conhecidas. A Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) é um banco de dados via molecular da curadoria manualmente e atualizados com freqüência metabólicas, reguladoras e vias de sinalização [7]. Usando este banco de dados de forma conservadora anotada, a redundância na estrutura aninhada de associações de genes representados por termos GO pode ser evitado. Em comparação com as análises de expressão de genes individuais, GSEA fornece insights sobre as mudanças de expressão coordenados de genes dentro de vias, portanto, alterado caminhos e genes aqui não conhecidos por serem envolvidos na carcinogênese puderam ser identificados sinalização.
A importância do fosfatidilinositol canônica 3-quinase (PI3K) no cancro foi estabelecida em numerosas publicações, durante a última década [8]. Esta rede de sinalização tem efeitos sobre vários fenótipos cancerosas-crítico, tais como a proliferação celular, sobrevivência, metabolismo e crescimento tumoral [8]. Um ramo de rede sobrepõe-se com a rede de sinalização fosfatidilinositol que é mediar sinais através de fosfolipase C (PLC), proteínas (Figura 1B). Esta rede provavelmente crosstalks com a MAPK e vias TP53, vias importantes no desenvolvimento CRC. A família de proteínas PLC compreende treze isozimas divididos em seis subtipos distintos, β, γ, δ, ε, ζ, e η, com base na estrutura e mecanismos de activação reguladoras. As isozimas PLC conter vários domínios comuns, bem como domínios específicos do subtipo, que pode torná-los capazes de regular as reacções independentes de lipase [9]. Além disso, eles são solúveis e principalmente localizadas no citosol, mas tornam-se translocado para a membrana do plasma, em resposta à activação do receptor [10]. Na membrana que hidrolisar fosfatidilinositol (4,5) fosfato (PIP
2) e gerar o importante segundo mensageiro diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-triphospate (IP
3). Desequilíbrio dos níveis de fosfatidilinositol (PIP
2 e PIP
3) foi mostrado para induzir defeitos na actividade do canal, o tráfico, e polaridade celular normal [9]. Assim, a regulação correta dos fosfoinositídeos por exemplo enzimas PLC é essencial e regulação aberrante contribui para várias doenças humanas, incluindo câncer [9].
Ao explorar a expressão do gene de processos predefinidos biológicos e circuitos moleculares em dois CRC e conjuntos de dados normais da mucosa do cólon obtidos utilizando diferentes plataformas de microarray, foi identificada uma lista de caminhos significativamente alterados pela expressão diferencial de genes no CRC. Nós selecionamos a “rede de sinalização fosfatidilinositol” e dois dos componentes desregulados nele,
PLCD1
(HGNC: 9060) e
PLCE1
(HGNC: 17175), para estudos detalhados e compararam os resultados com dados clínico-patológicos e estado de mutação de vários genes conhecidos a ser alterado no CRC.
Resultados
caminhos desregulamentado KEGG em CRCs
no total, 152 conjuntos de genes KEGG estavam presentes em ambos conjuntos de dados de expressão de genes. Destes, 33 GSEA revelou significativamente regulada positivamente e 49 downregulated significativamente os processos biológicos e em vias CRC comparado com a mucosa de cólon normal (
P
≤0.05; Figura 2). Onze redes significativamente alterados apresentaram escores de enriquecimento opostas entre os conjuntos de dados, enquanto que 44 foram encontrados significativamente alterada em apenas um dos conjuntos de dados. redes KEGG significativamente desregulados em CRC comparado com a mucosa normal em ambos os conjuntos de dados são listados na Tabela S1 (N = 82). O fato de que estas vias foram encontrados significativamente alterada (
P
≤0.05) em dois conjuntos de dados analisados de forma independente, obtidos a partir de diferentes plataformas de microarray, dá um risco de apenas 1/400 para cada caminho para ser incluído como significativamente alterada apenas por acaso. Assim, nenhuma correcção adicional para o teste múltiplo é realizada (este também é responsável para a parte superior da Tabela 1). Os 82 redes incluem conjuntos de genes responsáveis por características celulares de cancro gerais, vários circuitos metabólicos, bem como cascatas de sinalização mais famosos tais como o TP53 e MAPK. A parcela de níveis de expressão de genes em amostras de CRC
contra
amostras de mucosa de cólon normais para todos os genes no as três redes mais regulada negativamente em CRC três mais regulada positivamente e são mostrados na Figura S1, e seus genes estatisticamente expressos diferencialmente estão listadas nas tabela S2.
o diagrama mostra que os resultados do GSEA foram altamente reprodutível com 33 e 49 caminhos em conjunto para cima e reprimidos através dos dois conjuntos de dados, respectivamente.
The Sims “sistema de sinalização fosfatidilinositol”
o “sistema de sinalização fosfatidilinositol” foi uma das vias moleculares encontradas a ser reprimidos no CRC comparação com mucosa normal,
ou seja
ter mais reprimidos de genes regulada. Um total de 22/59 e 27/76 genes que cumpriram os critérios de qualidade foram significativamente desregulado no CRC nos conjuntos de dados e HuEx AB, respectivamente (Figura 3, Tabela 1). Dos 11 genes encontrados em ambas as séries desregulada, compreendendo quinases, quinases inositol diacilglicerol, e fosfolipases, dois foram significativamente regulada positivamente, ao passo que nove foram regulados negativamente. Curiosamente, encontramos quatro lipases subregulado (
PLCD1
,
PLCD3
,
PLCE1
, e
PLCG2)
que foram isozimas pertencentes à fosfolipase intimamente relacionado C (PLC) família de proteínas.
PLCD1
e
PLCE1
, os dois genes PLC no “sistema de sinalização fosfatidilinositol” mais significativamente regulada negativamente em comparação com as amostras normais da mucosa nos conjuntos de dados HuEx e AB, respectivamente, foram escolhidos para posterior validação .
no total, 38 genes no “sistema de sinalização fosfatidilinositol” foram alterados em um ou ambos conjunto de dados, onze genes foram encontrados desregulamentado em ambos os conjuntos de dados.
Validação de
PLCD1
e
PLCE1
expressão de mRNA
de reversa quantitativa de transcrição-PCR,
PLCD1
e
PLCE1
foram claramente reprimida em amostras de tecido canceroso em comparação com o normal mucosa (
P
= 3 × 10
-16 e
P
= 4 × 10
-15), confirmando a regulação baixa encontrada nos dados de expressão microarray (Figura 4) . Todos os anos analisados linhas celulares de cancro do cólon, também exibido repressão significativa dos dois genes em comparação com mucosa normal (
P
= 2 × 10
-10 e
P
= 1 × 10
-8).
Os níveis de expressão
PLCD1
e
linhas celulares PLCE1
no CRC e câncer de cólon avaliados por RT-PCR foram significativamente regulada negativamente em relação ao cólon normal mucosa.
PLC
valores de expressão associados a variáveis genéticas e clínico-patológicos
Curiosamente, havia fortes associações entre a baixa expressão de ambos
PLCD1
e
PLCE1
e
KRAS
mutações em amostras de CRC (Tabela 2). Além disso, níveis reduzidos de expressão
PLCD1
foram significativamente associados com
TP53
mutações e o fenótipo MSS. Para ambos os genes PLC, os níveis de expressão foram reduzidos em fases mais avançadas da doença. valores de expressão de
PLCE1
foram diminuídos em estágio II (
P
= 0,06) e significativamente diminuída em tumores estádio III (
P
= 0,005), em comparação com o estágio I tumores . No entanto, este não foi o caso para a doença metastática distante (estágio IV). A mesma tendência também foi visto em
PLCD1
, onde os níveis de expressão foram significativamente menores em fase III em comparação com a fase I (
P
= 0,03). Não foram encontradas associações entre o
PLCD1
e
PLCE1
expressão e mutações no
BRAF
,
PIK3CA
, ou
PTEN
. Para Tabela 2 deve notar-se que, devido a múltiplos testes (n = 16), há um risco de falsos associações significativas.
Análise
metilação do promotor de
PLCD1
e
PLCE1
PLCD1
e
PLCE1
poderiam ser alvos para metilação do promotor desde que seus níveis de expressão foram baixas em CRC em comparação com amostras de mucosa do cólon normais. Ambos os genes possuem ilhas CpG nos seus promotores e tornou-se a sua expressão regulada positivamente em linhas celulares tratadas com agentes epigenética reactivação (5-aza-2’desoxicitidina; AZA e Tricostatina A; TSA). metilação parcial ou completa da
PLCD1
promotor foi encontrado em 79% (15/19) das linhas celulares de cancro do cólon, detectada por qualitativa, bem como quantitativa reação em cadeia da polimerase específicas de metilação (MSP e qMSP, respectivamente ). As quatro linhas celulares restantes foram completamente não metilado. O estado de metilação das linhas celulares de cancro de cólon foi confirmada por sequenciação de bissulfito utilizando dois conjuntos que não se sobrepõem de pares de iniciadores, abrangendo um total de 69 locais de CpG. Não houve associação entre a metilação e MSI-status das linhas celulares. Para carcinomas primários, apenas nove dos 70 (13%) amostras foram metilado, como avaliado pela MSP e qMSP. A maioria dos tumores considerados positivos para a metilação apresentado valores baixos PMR (mediana 5,69). Curiosamente, oito dos nove tumores foram metilados MSI, originando uma frequência de metilação de 40% (8/20) neste subgrupo. Além disso, todos os tumores MSI metilados tinham mutações em
BRAF
, enquanto o tumor MSS metilado foi tipo selvagem. Para
linhas celulares de cancro PLCE1,
apenas um dos 19 cólon mostrou metilação do promotor. Isto foi confirmado por seqüenciamento bissulfito cobrindo 47 locais CpG. Devido à baixa
PLCE1
frequência promotor metilação entre as linhas celulares, amostras de tecido não foram submetidos à metilação analisa.
Discussão
Ao explorar a expressão de genes dentro de vias moleculares pré-definidos em dois conjuntos de dados independentes transcriptoma CRC, identificamos várias redes e componentes que nela estão desregulados no CRC e pode contribuir para a carcinogênese molecular.
o “ciclo celular” foi não surpreendentemente o gene mais extensivamente alterada definido em nossas análises. Sua regulamentação adequada é essencial para garantir a correta transmissão de informação genética de uma geração para a próxima, assim, a desregulamentação de vários componentes do ciclo celular é definido como características cancerígenas. A nossa descoberta está de acordo com vários estudos comparáveis de CRC onde os conjuntos de genes restrita exclusivamente a vias relacionadas com o cancro [11] e vários bancos de dados on-line com mais vias gerais, têm sido explorados [12] – [14]. Os CRCs exibida mudanças de expressão em várias vias metabólicas,
ie
“A fosforilação oxidativa” foi a rede metabólica mais significativamente regulada negativamente em ambos os conjuntos de dados, ao passo que o metabolismo das purinas, pirimidinas, e os N-glicanos, para além da “das pentoses fosfato via “foram regulados positivamente. O metabolismo da purina e pirimidina foram recentemente encontrada para ser regulada positivamente em adenomas também em comparação com a mucosa normal, indicando que as alterações destas redes são eventos precoces na tumorigénese [14]. Reprogramação do metabolismo energético foi recentemente lançado como uma característica emergente de câncer, e os resultados são também de acordo com o que Otto Warburg descrito há meio século, conhecido como o “efeito Warburg”. Ele identificou uma mudança no metabolismo da glucose a partir de fosforilação oxidativa a glicólise aeróbica em células tumorais [15]. Limitando o metabolismo em grande parte a glicólise permite a conversão de intermediários glicolíticas em nucleósidos e aminoácidos. Isto, por sua vez, facilita a biossíntese de macromoléculas e organelos necessários para o aumento da produção de novas células. Também foram encontrados processos biológicos que envolvem a replicação do ADN e várias formas de mecanismos de reparação de ADN desregulado nos conjuntos de dados. Estes sistemas fundamentais são frequentemente colocar fora de jogo não só no cancro, mas também em outras doenças e síndromes, ressaltando a gravidade de não ser capaz de copiar os ADN ou reparar erros de uma forma correta.
Além de traços mais gerais de células de câncer, circuitos centrais em CRC como MAPK-, TP53-, e fosfatidilinositol sistemas, onde normalmente um ou poucos jogadores de destaque são relatados para ser freqüentemente alterada no nível do DNA (devido a mutações pontuais de sinalização, amplificações e /ou exclusões; [8], [16]), foram encontrados significativamente desregulamentado em nossas análises. Isto implica que a expressão do gene alterado de vários membros menos “famosos” nas vias também contribuem na carcinogênese colorretal. Neste estudo observou-se que genes como
PIK3CA
e
PTEN
foram expressas em amostras de tumor, mas não em níveis significativamente diferentes de tecido do cólon normal em ambos os conjuntos de dados. Nós e outros têm mostrado que estes genes frequentemente sofrem alterações no ADN ou os níveis de proteína em vez de por alterações na expressão de ARNm [8], [17] – [19]
De forma a revelar os genes adicionais em. o “sistema de sinalização fosfatidilinositol” envolvidos na tumorigênese, exploramos o nível de todos os seus componentes expressão como anotado em KEGG. Ambas as fosfatases inositol, quinases diacilglicerol, e fosfolipases foram encontrados para ter expressão alterada. Entre as enzimas fosfolipase, os membros da família fosfolipase C foram bem representada, indicando um papel importante para esta família de CRC. Isto foi sublinhado por RT-PCR análises validar que os níveis de expressão de
PLCD1 Comprar e
PLCE1
foram amplamente regulada negativamente no CRC comparado a mucosa do cólon normal. A repressão do
PLCD1
está de acordo com os resultados apresentados por Nomoto e colegas em 1995, onde eles relatam níveis indetectáveis de proteína PLCD1 em linhas celulares de cancro do cólon oito e níveis diminuídos em doze dos treze carcinomas do cólon em comparação com a sua amostras pareadas normal da mucosa [20]. Vários grupos têm sugerido um papel para PLCD1 na regulação do ciclo celular L
1 /S-posto, no entanto, não são contraditórias resultados se a mesma tivesse uma função supressora de tumores oncogénicos ou [21] – [23]. Com base nos achados, sugerimos a última função de
PLCD1
no CRC. Resultados semelhantes também foram relatados para os carcinomas de células escamosas esofágicas (CICAc), gástrico e cancro da mama [21], [24] – [26]. Curiosamente, os níveis de baixa expressão
PLCD1
foram fortemente associada a mutações no
TP53
e
KRAS
bem como tumores do fenótipo MSS; Embora o significado biológico destas associações permanece a ser determinada.
A repressão observada de
PLCE1
, o segundo gene investigada em detalhe, é suportada pelos resultados de Sorli
et ai
. que também demonstraram níveis significativamente reduzidos de expressão de mRNA em amostras de cólon e recto e linhas celulares de cancro do cólon, bem como por Wang e colegas que relataram uma frequência de perda de 36% de heterozigose (LOH) do 10q23 onde
PLCE1
está localizado e regulação negativa de PLCE1 21/50 em amostras de cancro colorectal em comparação com o tecido normal, combinando [27] – [29]. Além disso, observou-se que os níveis de expressão
PLCE1
foram diminuindo com mais estágios avançados, o que indica que a repressão deste gene é benéfico para a progressão do câncer. Notavelmente, o nível aparece a subir quando chegar metastático doença (estágio IV), um fenômeno previamente descrito para
PLCD1
e
PLCD3
no cancro da mama [24]. No entanto, o cuidado deve ser feita ao interpretar os resultados para o grupo atual estágio IV, como apenas sete tumores estão incluídos. Os níveis de expressão de
PLCD1
e
PLCE1
foram correlacionados, e como esperado, redução da expressão de ambos os genes foi associada a fases mais avançadas do tumor (dados não apresentados). No entanto, os níveis de expressão individual e os níveis de expressão de ambos os genes combinados não se correlacionaram com a sobrevivência do paciente (dados não mostrados). Curiosamente, como para
PLCD1
, baixa expressão de
PLCE1
foi fortemente associado com mutações em
KRAS
. Desde PLCE1 é encontrado para ser tanto um efector a jusante e a montante das proteínas ras da família [30], a correlação de mutada
KRAS
com os níveis reduzidos de expressão mais provavelmente desempenha um papel fundamental na tumorigénese CRC. Além disso, foi recentemente relatado que a sobre-expressão de PLCE1 em uma linha de células de cancro do cólon inibiu a proliferação de células tumorais, reduziu o número de colónias formadas, reduzida de migração, e aumento da apoptose [29], sugerindo um papel supressor de tumor para este gene no CRC.
em seguida, investigou se os níveis de expressão reduzidos de
PLCD1
e
PLCE1
poderia ser devido a hipermetilação do promotor. Esta é uma forma comum para inativar genes supressores de tumor, e ambos os phopholipases foram apresentadas como candidatas a hipermetilação do promotor [27]. No entanto, isso tem até agora só foi confirmada em
PLCD1
no intervalo de 52-62% em CICAc metilação, cancro gástrico e da mama [21], [25], [26]. Nossos resultados de qMSP e seqüenciamento bissulfito não pode confirmar
PLCE1
como um alvo para este tipo de silenciamento epigenético, e apesar de alta frequência de metilação em linhas celulares de cancro do cólon, metilação no
PLCD1
promotor pode explicam apenas uma expressão reduzida de um subgrupo dos carcinomas. Curiosamente, porém, descobrimos que todos, mas um dos tumores metilados eram MSI, produzindo uma frequência de metilação de quase quarenta por cento entre os carcinomas com reparo de defeitos incompatibilidade. Além disso, os tumores MSI metilados foram localizadas no lado direito do intestino e teve
BRAF
mutação, em linha com o fenótipo CIMP [3].
Ao submeter dois conjuntos de dados de transcriptoma CRC para GSEA , nós identificamos um número de conjuntos de genes desregulados estatisticamente significativas na CRC, e mostrado que esta abordagem pode guiar descoberta de novos alvos moleculares e biomarcadores para o câncer. Verificação análises de genes seleccionados dentro de uma das vias de sinalização desregulados identificados,
PLCD1
e
níveis PLCE1
, confirmados reduzidas destes transcritos em CRC em comparação com amostras de mucosa normal. Tanto um supressor de tumor e do tumor promoção do papel destes genes e produtos de proteínas têm sido sugeridos em relação ao desenvolvimento de cancro, de acordo com o tecido de origem [9]. Os presentes dados suportam um papel supressor tumoral de
PLCD1
e
PLCE1
no CRC, que para
PLCD1
possivelmente pode ser explicada por um mecanismo epigenético em microssatélites carcinomas instáveis.
Materiais e Métodos
Ética declaração
O consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos incluídos. Todas as amostras foram retiradas da biobancos pesquisa como parte de projetos de pesquisa aprovados de acordo com diretrizes éticas nacionais. As séries biobanco foram registradas de acordo com a legislação nacional e é aprovado pelo Comité Regional Medical Ética em Pesquisa (REK Sudeste S-09282c2009 /4958, Biobank 2781; REK Sul: 2003, S-02126, Biobank 296-2005-174211 ).
conjuntos de dados de transcriptoma
Dois conjuntos de dados independentes transcriptoma tecido colorectal profiling gerados anteriormente em nosso laboratório foram usados para este estudo GSEA [31], [32]. Os dados brutos são acessíveis através da Expressão Gênica do NCBI Omnibus repositório público de dados de microarranjos (números de acesso GSE25071 e GSE24550). O primeiro conjunto de dados inclui perfis de expressão gênica de 46 CRCs e quatro amostras da mucosa do cólon normais obtidos com 1700 plataforma de Applied Biosystems (Applied Biosystems por Life Technologies, Foster City, CA, EUA; AB) [31]. O segundo conjunto de dados de expressão gênica contém 91 CRCs e seis amostras da mucosa do cólon normais gerados usando os Affymetrix GeneChip Exon Human 1.0 matrizes ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA; HuEx) [32]. Não houve amostras de sobreposição entre os dois conjuntos de dados de microarranjos. Um resumo dos dados clínicos de doentes incluídos nos conjuntos de dados podem ser encontrados na Tabela S3.
Amostras de tecidos e linhas celulares de cancro
O paciente amostras incluídos na verificação alvo análises constituído um subconjunto da tumores utilizadas no conjunto de dados HuEx (n = 70) e 17 amostras normais da mucosa do cólon (incluindo seis do conjunto de dados HuEx). Todas as amostras foram retiradas de pacientes submetidos a cirurgia primária para CRC no Hospital Universitário de Oslo, Aker, Oslo, entre 2005 e 2008. As amostras da mucosa do cólon normais foram retiradas de áreas livres da doença na margem de ressecção das amostras de CRC (≥10 cm de o tumor). Uma descrição clínico-patológico podem ser encontrados na Tabela S4.
linhas celulares de cancro do cólon Nineteen (Co115, Colo320, EB, FRI, HCT15, HCT116, HT29, IS1, IS2, IS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, e V9P) foram incluídos no estudo, e estão completamente descritas em [33]. Estas foram cultivadas sob condições padrão que vai ser concedido mediante pedido. Seis das linhas de células (HCT15, RKO, SW48, HT29, LS1034, e SW480) foram sujeitos a tratamento usando a droga epigenética desmetilante AZA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA; 1 uM durante 72 horas), o inibidor de histona desacetilase de TSA (Sigma-Aldrich; 0,5? M durante 12 horas), e uma combinação de ambos os fármacos (1 uM durante 72 horas AZA e 0,5 uM de TSA adicionado as últimas 12 horas). Em paralelo, as mesmas linhas celulares foram cultivadas sem tratamento durante 72 horas. Todas as linhas celulares disponíveis comercialmente foram autenticado utilizando o kit AmpFLSTR Identifiler Amplificação por PCR (Applied Biosystems).
Isolamento de ácidos nucleicos
ADN a partir de linhas celulares de cancro do cólon e do tecido do cólon fresco congelado foi extraído por um protocolo padrão de fenol /clorofórmio. ARN a partir de tecido de tumor foi extraído utilizando o Kit Qiagen AllPrep ADN /ARN Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), enquanto que o ARN a partir de amostras de mucosa de cólon normais e de linhas celulares de cancro de cólon foi isolado por o Kit Ambion RiboPure ™ (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), respectivamente. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos dos fabricantes.
Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA)
Para conjuntos de genes GSEA foram definidos de acordo com a coleta via de KEGG (Homo sapiens (humanos) Solte 53,0 ) [7]. A análise foi realizada usando o pacote GSEABase em [34] Bioconductor /R versão 2.9.2. Os dois conjuntos de dados de CRC expressão gênica por microarrays
contra
mucosa do cólon normal foram independentemente submetido a GSEA. pré-processamento dos dados foi realizada como descrito anteriormente [31], [32]. gama interquartil (IQR) foi usado como uma medida de variabilidade. Genes com IQR 0,5 foram excluídos das análises ainda mais com GSEA. Para genes alvo por vários grupos de transcrição (HuEx) ou sondas (AB) foi utilizado o repórter com maior variabilidade. Os genes não atribuídas às vias KEGG também foram excluídos da análise. Um total de 3.361 e 4.797 genes com um papel anotada em 205 e 220 vias KEGG foram avaliados para os conjuntos de dados AB e HuEx, respectivamente. Vias que incluíram menos de 10 genes anotados foram removidos de análises posteriores, deixando 167 e 185 percursos nos respectivos conjuntos de dados. Frente e verso, de duas classes t-testes assumindo variâncias iguais em toda a CRC e amostras normais foram realizadas para todos os genes incluídos. Uma pontuação de enriquecimento gene conjunto foi calculada como a soma de t-estatísticas observadas para os genes no conjunto, dividida pela raiz quadrada do número de genes no conjunto. conjunto de genes
P
-Valores foram calculados com base no vetor de probabilidades de as estatísticas t através dos genes incluídos [35].
A validação dos níveis de expressão PLCD1 e PLCE1 por quantitativa Transcription- reverso PCR
o ARN total a partir de tecido de CRC e amostras de mucosa normal foi convertido em ADNc, utilizando o High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems). O ADNc de dois controles endógenos,
ACTB
(Hs99999903_m1) e
GUSB
(Hs99999908_m1), bem como de cDNA dos genes
PLCD1
(Hs00979908_m1) e
PLCE1
(Hs00275279_m1) foi amplificado separadamente em 384 bem-placas tal como descrito pelo fabricante (Applied Biosystems). A expressão de genes foi avaliada em tempo real utilizando o HT 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). As amostras foram analisadas em triplicado e o valor médio foi utilizado para análise de dados. Uma diluição em série de ADNc a partir do ARN humano de referência universal (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) foi utilizado para gerar a curva padrão. Os níveis de expressão
PLCD1
e
PLCE1
foram normalizados em relação ao valor médio dos controles endógenos.
tratamento com bissulfito e ensaio de metilação do promotor projeto
Antes a MSP qualitativa e quantitativa e sequenciação bissulfito, 1,3 ug de DNA de cada amostra foi tratada bissulfito de sódio usando o Epitect bissulfito Kit (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.