Sumário

AMP cíclico (cAMP) inibe a proliferação de várias células tumorais. Nós relatado anteriormente um efeito antiproliferativa dos análogos PKA I-seletivos Camp (8-PIP-AMPc e 8-HA-cAMP) em duas linhas celulares de cancro humano de origem diferente. 8-Cl-cAMP, outro análogo acampamento com propriedades antiproliferativas conhecidos, tem sido investigado como uma potencial droga anticâncer. Aqui, nós comparou o efeito antiproliferativa de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-seletivos em três linhas celulares de cancro humano (ARO, NPA e WRO). os análogos de AMPc PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP e teve efeitos antiproliferativos similarmente potentes sobre as células ARO e NPA BRAF-positivos, mas não nas células WRO BRAF-negativa, em que apenas 8-Cl-cAMP consistentemente o crescimento celular inibido . Embora o tratamento com os análogos de AMPc de PKA I-selectivos foi associada com a interrupção de crescimento, 8-Cl-cAMP induziu apoptose. Para investigar mais as acções de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos, analisou-se os seus efeitos nas vias de sinalização envolvidos na proliferação celular e da apoptose. Curiosamente, os análogos de AMPc PKA I-selectivos, mas não 8-Cl-cAMP, a fosforilação de ERK inibida, ao passo que 8-Cl-cAMP sozinho induziu uma fosforilação progressiva da p38 cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK), através da activação da AMPK pela seu metabolito 8-Cl-adenosina. Importantemente, o efeito pró-apoptótico de 8-Cl-cAMP poderiam ser amplamente prevenida por inibição farmacológica da MAPK p38. No seu conjunto, estes dados sugerem que a 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos, apesar da potência antiproliferativa comparável, actuam através de diferentes mecanismos. Os análogos de AMPc PKA I-selectivos induzem a paragem do crescimento em células que transportam o oncogene BRAF, enquanto 8-Cl-cAMP induzir apoptose, aparentemente através da activação da via de MAPK p38

citação:. Lucchi S, Calebiro D, de Filippis t, Grassi ES, Borghi MO, Persani G (2011) 8-Cloro-AMP cíclico e proteína cinase A I-selectiva de AMP cíclico Os análogos do cancro da Inibição do Crescimento celular por meio de diferentes mecanismos. PLoS ONE 6 (6): e20785. doi: 10.1371 /journal.pone.0020785

editor: Andrew D. Badley, Clínica Mayo, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Janeiro, 2011; Aceito: 09 de maio de 2011; Publicação: 10 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lucchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi parcialmente financiado por fundos do Istituto Italiano Auxologico pesquisa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

AMP cíclico (cAMP) é um antigo e mensageiro químico onipresente, sendo encontrada tanto em procariotas e eucariotas. Nos vertebrados, é um importante mediador intracelular de neurotransmissores e hormonas e regula as funções celulares essenciais, tais como a contracção, a secreção e a replicação. Enquanto AMPc tem um efeito anti-proliferativo na maioria dos tipos celulares, isto fornece um oposto, isto é, Pro-mitótico, estímulo para os neurónios e várias células de origem endócrina [1], [2]. Não surpreende, portanto, os genes que codificam elementos chave da via ato campo como oncogenes ou oncosuppressors, mais primorosamente em endócrino células [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10]. Além disso, uma sobre-regulação de tipo I isoformas da proteína-quinase dependente de AMPc A (PKA) tem sido documentada em várias malignidades [11].

Desde AMPc tem um efeito antiproliferativo em células de tumor, análogos de AMPc de células-permeável têm sido considerados para o tratamento de cancro humano [11]. 8-Cl-cAMP, o mais bem estudado destes compostos, possui propriedades antiproliferativas tanto

in vitro

e

In vivo

e foi avaliada em fase I /II de ensaios clínicos [11], [ ,,,0],12], [13]. No entanto, apesar dos efeitos bem documentados de 8-Cl-cAMP, não há consenso sobre seu mecanismo de ação. Nos estudos pioneiros de o grupo de Yoon Cho-Chung, foi de facto demonstrado que 8-Cl-cAMP modifica a relação entre as subunidades reguladoras da PKA (R) (tipo I vs tipo II) diminuindo os níveis de subunidades IR tipo [11], [14]. Embora este fenómeno foi considerada responsável pelo efeito anti-proliferativo de 8-Cl-cAMP, os resultados dos estudos mais recentes sugerem que os efeitos de 8-Cl-cAMP em vez disso são mediadas pelo seu metabolito 8-Cl-adenosina e são independentes de activação de PKA e /ou alterações da relação entre tipo II subunidades R [15] tipo I e, [16], [17], [18].

Em um trabalho anterior, descobrimos que um par de site específico de Os análogos de AMPc (8-PIP-AMPc e 8-HA-cAMP), o qual, quando utilizado em combinação, activar selectivamente PKA I, tinha um efeito antiproliferativo potente em duas linhas celulares de carcinoma BRAF-positivo (ARO e NPA), mas não sobre as células WRO BRAF-negativas [19]. Neste estudo comparou os efeitos de 8-Cl-cAMP e estes análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre as mesmas linhas celulares de carcinoma (ARO, NPA e WRO), vendo os parâmetros, tais como o crescimento celular, apoptose e modificações de sinalização tecla cascatas que podem ser implicados em seus efeitos antiproliferativos.

resultados

Efeito de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-seletivos sobre a proliferação celular

em primeiro lugar, comparação do efeito antiproliferativo de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos. Para este efeito, foram tratados ARO (cancro do cólon), ANP (melanoma) e células com diferentes concentrações de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivas para vários períodos de tempo WRO (carcinoma da tiróide folicular) (24-96 h) e a viabilidade celular avaliada utilizando o ensaio de MTT. Os resultados indicaram que ambos os tratamentos foram igualmente potentes na inibição do crescimento de células ARO e NPA, enquanto que apenas 8-Cl-cAMP teve um efeito antiproliferativo consistente em células WRO (Figura 1). O efeito de ambos os tratamentos atingiu um máximo após 72-96 h de incubação (dados não apresentados) e foi dependente da dose, com valores de IC50 de 55,3 uM em ARO e 84,8 uM em células NPA para os análogos de AMPc PKA I-selectivos e entre 2,3 e 13,6 mm para 8-Cl-cAMP em todas as três linhas celulares. Consistente com a constatação anterior de que o efeito antiproliferativo de 8-Cl-cAMP é PKA independente e pelo menos parcialmente mediada por seu metabolito 8-Cl-adenosina [15], [16], [17], [18], o efeito de 8-Cl-cAMP foi significativamente inibida pelo tratamento com o inibidor da fosfodiesterase IBMX, o qual bloqueia a conversão de 8-Cl-cAMP a 8-Cl-adenosina. Pelo contrário, IBMX não alterou o efeito antiproliferativo dos análogos de AMPc PKA I-selectivo (Figura S1). Além disso, o efeito anti-proliferativo de 8-Cl-cAMP não pareceu ser mediada por PKC, como o tratamento com um inibidor de PKC não modificou a resposta ao 8-Cl-cAMP (Figura S2).

ARO, células NPA e WRO foram cultivadas durante 72 h na presença das concentrações indicadas de qualquer um dos tipos de cAMP análogo (s) e a viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. PKA I, análogos de PKA I-selectivos utilizados em concentrações equimolares.

Efeito de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre a progressão do ciclo celular e apoptose

Subsequentemente , avaliou-se o efeito anti-proliferativo de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos foi associada com a interrupção de crescimento e /ou apoptose. Esta questão foi abordada por uma combinação de abordagens.

Em primeiro lugar, analisamos os efeitos de 8-Cl-acampamento e os análogos de AMPc PKA I-seletivos sobre o ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo análise do conteúdo de DNA nuclear . Para este fim, as células ARO, NPA e WRO foram tratados com qualquer um dos tipos de cAMP analógico (s) para diferentes períodos de tempo e analisado após coloração do DNA com iodeto de propídio. Tratamento 8-Cl-cAMP foi associada com uma redução de células na fase G0 /G1 e uma acumulação de células na fase S. Além disso, foi acompanhada por um aumento significativo na fracção de células apoptóticas, isto é, aqueles com um teor de ADN sub-G0 /G1. Em contraste, a exposição aos análogos de AMPc PKA I-selectivos não causar um aumento significativo na apoptose. O único efeito apreciável dos análogos de AMPc PKA I-selectivos-se um ligeiro aumento do número de células em G0 /G1 (estatisticamente significativa em células ARO) e uma tendência para uma diminuição das células em S e G2 /fases M, tanto compatível com a acumulação na fase G0 /G1 (Tabela 1).

em seguida, analisou-se a libertação de fragmentos de ADN ligados a histona para o citosol, como um marcador de fragmentação de ADN apoptótico. células ARO, NPA e WRO foram expostos a concentrações sub-máximas dos análogos de AMPc PKA I-selectivos ou 8-Cl-cAMP, e a quantidade de nucleossomas no citoplasma foi avaliado por um ELISA específica. Tratamento 8-Cl-cAMP causou um aumento significativo na fragmentação do ADN em todas as três linhas de células de partida que era detectável a partir de 48 h de incubação. Pelo contrário, não se observou qualquer indução de fragmentação de ADN em células tratadas com os análogos de AMPc PKA I-selectivos (Fig 2A e dados não mostrados)

A:. Efeito sobre a fragmentação de ADN. As células foram expostas ao 8-Cl-cAMP (100 uM) ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos (100 uM cada) durante 48 h e a libertação de fragmentos de ADN ligados a histona para o citosol foi avaliado por um ELISA específica. Os dados são de três experiências independentes. B: efeito sobre a caspase 3/7. As células foram expostas ao 8-Cl-cAMP (100 uM) ou os análogos de PKA I-selectivos de cAMP (100 uM cada) durante 72 h e a actividade da caspase 3/7 foi determinada com um ensaio luminescente. Os dados são de três experiências independentes. * P 0,001 versus as células de controlo. Todos os dados são expressos como a variação em relação a cultura de células de controlo sem fármacos.

Finalmente, como a apoptose está associada com a activação de caspase [20], examinámos o efeito de ambos os tratamentos sobre a actividade da caspase 3 /7, que foi medida utilizando um ensaio luminescente. Um aumento significativo na actividade da caspase 3/7 foi detectada em células ARO, NPA e WRO expostas ao 8-Cl-cAMP a partir de 24 h de tratamento, mas não nas mesmas células tratadas com os análogos de AMPc PKA I-selectivo (Figura 2B ).

em conjunto, estes dados sugerem que 8-Cl-campo, mas não os análogos de AMPc PKA I-seletivos induzida apoptose em células ARO, NPA e WRO.

vias apoptóticas ativado por 8- Cl-cAMP

Para investigar a via envolvida na apoptose induzida por 8-Cl-cAMP, avaliou-se a actividade da caspase 8 (via extrínseca) e caspase 9 (via intrínseca), utilizando ensaios luminescentes específicos. Um (10 min-1 h) activação precoce e transiente de caspase 8, mas não de caspase 9, foi observado (Figura 3), sugerindo que a 8-Cl-cAMP pode induzir a via extrínseca. No entanto, estes dois caspases não mostraram qualquer activação em pontos de tempo mais tardios (24-48 h) (dados não mostrados).

ARO células, NPA e WRO foram expostas ao 8-Cl-cAMP (200 uM) por diferentes períodos de tempo e as atividades de caspase 8 e 9 foram medidos utilizando os ensaios luminescentes específicos. Os dados são de três a seis experimentos independentes. * P 0,05 vs. basal. ** P 0,01 vs. basal. *** P 0,001 vs basal. Todos os dados são expressos como a variação versus o valor basal.

Efeito de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-seletivos sobre os níveis de subunidades de PKA

Uma vez que foi relataram que 8-Cl-cAMP provoca uma diminuição da regulação de Ria e uma sobre-regulação de subunidades RIIβ [14], [21], que comparou os efeitos de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre a expressão das subunidades de PKA R. Para este fim, as células ARO, NPA e WRO foram estimuladas com os análogos de AMPc PKA I-selectivos para diferentes períodos de tempo e os níveis de Ria, RIIα e RIIβ 8-Cl-cAMP ou foram avaliados por análise de Western blot utilizando-specific isoforma anticorpos. O tratamento de células ARO, NPA e WRO quer com 8-Cl-cAMP ou o pKa análogos de AMPc I-selectivos foi associada a uma redução dos níveis da subunidade Ria de expressão, enquanto que os níveis das subunidades restantes não foram afectadas (Figura 4 ).

ARO, células NPA e WRO foram tratadas com 8-Cl-cAMP (100 M) ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos (100 mm cada) para os períodos de tempo indicados. Os níveis de Ria, RIIα e RIIβ foram medidos por análise de Western blot. São mostrados os blots representativos ocidentais (A), bem como os resultados da análise densitométrica de quatro experiências independentes (B). * P 0,01 vs. basal. ** P 0,001 vs basal. Estes dados são expressos como a variação versus o valor basal.

Efeito de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-seletivos sobre ERK 1/2 e Akt

Em um esforço para compreender melhor o mecanismo de acção dos análogos de AMPc PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP e, que, em seguida, examinado o efeito de ambos os tipos de tratamento em duas cascatas principais de sinalização que estão envolvidos no crescimento celular, isto é, a quinase regulada por sinal extracelular 1/2 (ERK) activada proteína quinase mitogénio (MAPK) e o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt.

ERK1 /2 MAPKs estão bem caracterizados que são activados em resposta a estímulos de crescimento e desempenham um papel importante na transformação neoplásica [22]. Além disso, a cAMP foi encontrado para inibir a activação de ERK 1/2 em vários dos tipos de células em que tem um efeito antiproliferativo [1], [2]. Este parece ser o caso, também a células ARO e NPA, onde, como mostramos anteriormente, o efeito antiproliferativo dos análogos de AMPc PKA I-selectivos está associado com uma inibição de ERK 1/2 fosforilação em Thr202 /Tyr204 [19] . Nesta base, foi avaliado o efeito do tratamento com 8-Cl-cAMP sobre a fosforilação de ERK em Thr202 /Tyr204 por análise de Western blot com um anticorpo específico de fosfo. Análise da activação de ERK em pontos de tempo iniciais revelou aumentos transitórios para ambos os tratamentos (Figura S3). Em desacordo com o que foi observado anteriormente, em resposta aos análogos de AMPc PKA I-selectivos, a exposição crónica ao 8-Cl-cAMP não foi associado com uma inibição da tarde e persistente de fosforilação de ERK (Figura 5).

ARO , células de ANF e WRO foram tratados com 8-Cl-cAMP (100 uM) ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos (100 uM cada) para os períodos de tempo indicados. A níveis de ERK 1/2 fosforilada no Thr202 /Tyr204 e ERK total de foram medidos por análise de Western blot. Mostram-se Western blots representativos, bem como a análise densitométrica de três a quatro experiências independentes. As relações de P-ERK /ERK-total são expressos como a variação relativa contra os níveis basais de cada única experiência. * P 0,05 vs. basal. ** P . 0,01 vs. basal

Outra proteína que tem sido implicada na proliferação de células é a serina /treonina-quinase Akt, que é activada por fosforilação e produtos PI3K em Ser473 e Thr308 [23] . Portanto, foram avaliados o efeito do 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre a fosforilação de Akt Ser473 e Thr308, indicativo da sua activação. Consistente com o que nós relatado anteriormente [19], o tratamento com os análogos PKA I-seletivos 8-Cl-cAMP ou não causou modificações relevantes da Akt fosforilação em pontos temporais precoces (Figura S3) e por até 72 h (dados não mostrado).

Efeito de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre a p38 MAPK

8-Cl-cAMP foi mostrado para induzir a fosforilação de p38 MAPK e em HL60 células HeLa [24], [25]. Portanto, avaliou-se o efeito de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos sobre a fosforilação de p38 MAPK. Nós descobrimos que o tratamento de ARO, ANP e as células WRO com 8-Cl-cAMP foi associado com um aumento progressivo da fosforilação da MAPK p38, com início às 24 h de incubação (Figura 6). Pelo contrário, o tratamento com os análogos de AMPc de PKA I-selectivos não modificar o estado de fosforilação da MAPK p38 (Fig 6), excepto para pequenos aumentos transitórios e que não atingiram significância estatística. Além disso, o tratamento com os análogos de PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP ou não causar alterações de fosforilação de p38 MAPK em pontos de tempo iniciais (Figura S3).

ARO, células NPA e WRO foram tratadas com 8- Cl-cAMP (100 uM) ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos (100 uM cada) para os períodos de tempo indicados. Os níveis de fosforilada e total de p38 MAPK foram medidos por análise de Western blot. Mostram-se Western blots representativos, bem como a análise densitométrica de três experiências independentes. P-p38 /rácio de-p38 é normalizado aos níveis basais. * P 0,05 vs. basal. ** P 0,01 vs. basal. *** P . 0.001 vs. basal

Finalmente, avaliamos se o efeito pró-apoptótica de 8-Cl-campo era dependente da ativação p38 MAPK. Para este objectivo, foram tratados durante 48-72 h todas as três linhas celulares com 8-Cl-cAMP na presença ou ausência de inibidores de p38 MAPK selectivos (SB 202190 ou SB203580) e analisou a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo como descrito acima. Curiosamente, a inibição da p38 MAPK impedida em grande medida o efeito pró-apoptótico 8-Cl-cAMP (Figura 7).

As células foram estimuladas com 8-Cl-cAMP (100 pM) quer na presença ou na ausência de inibidores de p38 MAPK (SB203580 ou SB202190 10 uM) durante 72 h e a apoptose foi avaliada por análise de citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. Os dados são de pelo menos três experiências independentes. Os dados são expressos como a variação em relação a cultura de células de controlo. * P 0,05 e ** P . 0,001 em comparação com as células tratadas apenas com 8-Cl-cAMP

Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que o efeito pró-apoptótico de 8-Cl-cAMP em ARO, células NPA e WRO é mediada pelo p38 MAPK.

envolvimento de AMPK na activação de p38 MAPK por 8-Cl-cAMP

Um estudo recente [25] relataram que tenha os efeitos antiproliferativos de 8-Cl-cAMP poderiam ser mediadas por uma activação da proteína quinase activada AMP (AMPK) após a sua metabolização de 8-Cl-adenosina. Para verificar esta hipótese, avaliaram os efeitos de ambos um activador, AICAR, e um inibidor, o Composto C, de AMPK. O tratamento com AICAR imitou os efeitos de 8-Cl-cAMP sobre a fosforilação de p38 MAPK e em 3/7 a actividade da caspase. Além disso, o Composto C foi capaz de evitar, em grande medida, tanto da fosforilação de p38 MAPK e a activação da apoptose induzida por 8-Cl-cAMP (Figura 8).

ARO células, NPA e WRO foram estimuladas com 8- Cl-cAMP (100 uM) ou um ativador de AMPK (AICAR, 1 mM) durante 72 h, quer na presença ou ausência de pré-tratamento com um inibidor da AMPK (Composto C, 2,5 uM). A: os níveis de fosforilada e total de p38 MAPK foram medidos por análise de Western blot. São mostrados os resultados de experiências de transferência de Western representativas, bem como a análise densitométrica de três experiências independentes. Os dados estão normalizados para controlar os níveis. B: caspase 3/7 actividade foi determinada com um ensaio luminescente. São mostrados os resultados de pelo menos três experiências independentes. Os dados estão normalizados para controlar a cultura de células. Legenda: A: Controlo, B: 8-Cl-cAMP, C: AICAR, D: O composto C, E: 8-Cl-cAMP + Composto C, F: AICAR + Composto C. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 vs. controlo. # P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 vs. 8-Cl-cAMP. § P 0,05, §§ P 0,01, §§§ P . 0.001 vs. AICAR

Discussão

análogos de AMPc inibem a proliferação de várias células tumorais. A melhor estudada destes composto é 8-Cl-campo, que tem um efeito anti-proliferativo demonstrado tanto

in vitro

e

in vivo

e foi avaliada em fase I /II de ensaios clínicos [11 ], [12], [13]. Em um estudo recente, que descreveram o efeito antiproliferativo de um par de análogos de cAMP selectivo para a PKA I em linhas de células de carcinoma humano [19]. O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito destes análogos de acampamento para o da bem estudada 8-Cl-cAMP e continuar a investigar o seu mecanismo (s) de ação. Os resultados sugerem que os análogos de AMPc PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP e, apesar de potência semelhante, diferem em tipo de célula-selectividade e mecanismo (s) de acção. Os análogos de AMPc PKA I-selectivos induzem a paragem do crescimento, mas não apoptose, e, como mostrámos anteriormente, os seus efeitos parecem ser mediados por uma inibição da PKA-dependente da activação de ERK. Em contraste, os efeitos de 8-Cl-cAMP são provavelmente exercida pelo seu metabolito 8-Cl-adenosina, são independentes de activação de PKA, e são aparentemente mediada por activação de AMPK e subsequente indução dependente de p38-MAPK da apoptose.

os nossos dados indicam que os análogos de AMPc PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP e tem um efeito antiproliferativo potente de modo semelhante, sugerindo que ambos podem manter um potencial para a terapia do cancro. Os análogos de AMPc PKA I-seletivas parecem exigir a presença de ativação ERK constitutivo, tal como sugerido pelo seu ser altamente ativa apenas nas BRAF

células ARO e NPA mutado-V600E, onde eles inibem ERK fosforilação. Em contraste, 8-Cl-cAMP inibe fortemente o crescimento de células também nas células WRO BRAF-negativo, sugerindo que pode ser eficaz numa gama mais ampla de células cancerosas.

várias descobertas indicam que a 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos actuar através de mecanismos diferentes. Em primeiro lugar, o efeito de 8-Cl-cAMP parece ser principalmente mediada, em concordância com as observações anteriores [15], [16], [17], [18], por seu metabolito 8-Cl-adenosina, que actua através da AMPK, e não por estimulação de PKA, tal como sugerido pelo efeito de IBMX e da activação da AMPK /inibição selectiva; Pelo contrário, IBMX não modifica a resposta antiproliferativa dos análogos de AMPc PKA I-selectivos. Em segundo lugar, 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos produzir modificações de diferentes do ciclo celular. Em particular, 8-Cl-cAMP, mas não os análogos de AMPc PKA I-selectivos, induzir a apoptose. Em terceiro lugar, os análogos de AMPc PKA I-selectivos, mas não 8-Cl-cAMP, reduzir a fosforilação de ERK em células ARO e NPA. Em quarto lugar, 8Cl-AMPc, mas não os análogos de AMPc PKA I-selectivos, aumentam a fosforilação de p38 MAPK.

O mecanismo de acção de 8-Cl-cAMP é altamente debatida. Cho-Chung e seus colegas fizeram uma quantidade considerável de trabalho sobre este tema, cujos resultados indicam que 8-Cl-cAMP induz a inibição do crescimento através do aumento do RI para RII ratio [14], [21]. Por outro lado, estudos mais recentes sugerem que este regulamento não é a principal causa da inibição do crescimento observada [17]. Neste relatório, descobrimos que 8-Cl-cAMP reduz a expressão de Ria em células ARO, NPA e WRO. No entanto, descobrimos que IBMX, que bloqueia a conversão de 8-Cl-cAMP a 8-Cl-adenosina, um metabolito incapaz de activar PKA, reduz significativamente o efeito anti-proliferativo de 8-Cl-cAMP.

A estudo recente [25] demonstraram que 8-Cl-adenosina é capaz de estimular a AMPK, portanto, investigado o envolvimento desta via na apoptose induzida por 8-Cl-cAMP. Os nossos dados mostram que a indução de apoptose por 8-Cl-cAMP é acompanhada pela activação da caspase 3/7, e resultados semelhantes foram obtidos por AICAR, um ativador de AMPK. Além disso, o Composto C, um inibidor de AMPK, evita a indução de caspase 3/7 de ambos AICAR e 8-Cl-cAMP, respectivamente. No fim, propõe-se que o efeito pró-apoptótico de 8-Cl-cAMP é mediada por AMPK.

Além disso, mostra-se que o efeito pró-apoptótico de 8-Cl-cAMP é acompanhada por um aumento progressivo da fosforilação de p38 MAPK. A p38 MAPK é um regulador chave da sobrevivência celular [26], [27], e tem sido implicado no efeito pró-apoptótico de 8-Cl-cAMP em células HL60 e células HeLa [24], [25]. Para investigar se a ativação p38 MAPK é dependente de AMPK empregamos uma estratégia de ativação /inibição semelhante ao adotado para caspase 3/7. Uma vez que o bloqueio da AMPK amplamente prevenida e a activação da AMPK imitou os efeitos de 8-Cl-cAMP sobre a p38 MAPK, os nossos dados sugerem fortemente que a 8-Cl-cAMP, após a conversão no seu metabolito 8-Cl-adenosina activa a p38 MAPK através da estimulação da AMPK.

em uma tentativa de esclarecer o caminho que leva à ativação caspase 3/7, medimos a atividade das caspases a montante 8 e 9, que estão envolvidos na vias extrínseca e apoptóticos intrínsecas, respectivamente. Considerando que não foi observada activação da caspase 9, foi detectado um transiente precoce e só (5 min-1 h), a activação de caspase 8. Estes dados podem indicar o envolvimento da via extrínseca nos efeitos pró-apoptóticos de 8-Cl-cAMP. No entanto, dado o longo atraso observado entre a activação de caspase 8 e 3/7, e a natureza transiente da caspase 8 activação, é possível que outros mecanismos, provavelmente independente de caspases a montante, pode estar envolvida na activação da caspase 3 /7. Curiosamente, embora os mecanismos pelos quais a p38 MAPK activam as caspases pode não são totalmente elucidado, uma possível activação directa de caspase 3 pela p38 MAPK tem também sido relatada [28].

Em conclusão, os nossos dados indicam que ambos os análogos de AMPc PKA I-selectivos 8-Cl-cAMP e tem um efeito antiproliferativo potente semelhante em linhas celulares de cancro de origem diferente. Assim, ambos reter um potencial como drogas anti-cancro. 8-Cl-cAMP parece ser eficaz em uma gama mais ampla de tipos de células e induz a apoptose. Por outro lado, o mecanismo (s) de acção de 8-Cl-cAMP e os análogos de AMPc PKA I-selectivos são diferentes, sugerindo que podem ter perfis farmacológicos e toxicológicos diferentes, bem como propriedades anti-tumorais únicas. Futuro

in vivo

experimentos serão necessários para comparar a sua eficácia e tolerabilidade em modelos de câncer pré-clínicos.

Materiais e Métodos

Produtos Químicos

reagentes de cultura celular foram comprado de Invitrogen (San Giuliano Milanese, Itália). 8-cloroadenosina-3 ‘, 5′-monofosfato cíclico (8-Cl-cAMP), 8-piperidinoadenosine-3′, 5’-monofosfato cíclico (8-PIP-AMPc) e 8-hexylaminoadenosine-3 ‘, 5’cyclic monofosfato (8-HA-AMPc) foram adquiridos a Life Science Institute Biolog (Bremen, Alemanha). O kit de nitrocelulose e membranas BCA foram adquiridos a Pierce Biotechnology (Rockford, IL). PKARIα, PKARIIα, PKARIIβ anticorpos e p-actina foram adquiridos a BD Biosciences Pharmingen (Milão, Itália). anticorpos fosfo-ERK, fosfo-Akt, MAPK fosfo-p38, ERK, Akt e p38 MAPK foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticorpos secundários conjugados a HRP de rato e de coelho foram adquiridos a Chemicon International (Temecula, CA). O kit ECL plus foi comprado de Amersham Biosciences Europe (Freiburg, Alemanha). A morte celular kit de detecção ELISA Plus foi adquirido a partir de Roche Applied Science (Mannheim, Alemanha). A viabilidade celular CellTiter-Blue e caspase-Glo 3/7, 8 ou 9 ensaios foram adquiridos a Promega Corporation (Madison, WI, EUA). 4- (4-fluorofenil) -2- (4-metilsulfinilfenil) -5- (4-piridil) 1H-imidazole (SB203580) foi adquirido a partir de Biosource (Nivelles, Bélgica). 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 4- (4-fluorofenil) -2- (4-hidroxifenil) -5- (4-piridil) -1H-imidazole (SB202190), bisindolyl-maleimida I (GF109203X), AICAR, 6- [4- (2-piperidin-1-iletoxi) fenil] -3-piridin-4-ilpirazolo [1,5-a] pyriimdine (Composto C) e todos os outros reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich (Milão , Itália).

cultura celular

células

ARO, NPA e WRO foram gentilmente cedidas por I. Bongarzone (Milão, Itália). Uma análise recente de perfis de ADN revelou que as células ARO coincidir com a linha de células de cancro do cólon HT-29 e células NPA coincidir com a linha celular de melanoma M14 /MDA-MB-435S [29]. WRO células derivam de um carcinoma da tiróide folicular [30]. Todas as células foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina e 1% de estreptomicina, a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

activação selectiva de PKA I

Para activar selectivamente PKA I, utilizou-se a estratégia utilizada de utilizar simultaneamente dois análogos de AMPc distintas, ou seja, 8-piperidinoadenosine-3 ‘, 5’-monofosfato cíclico (8-PIP-AMPc) e 8-3-hexylaminoadenosine ‘, monofosfato 5’cyclic (8-HA-cAMP), cada um com uma elevada selectividade para a ligação a um ou outro local a (8-PIP-cAMP) ou B (8-HA-AMPc) de PKA tipo I R subunidades [19].

ensaio de proliferação

a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de 3- (4,5-dimetylthiazole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), como previamente descrito [19 ]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços, e 24 h após o plaqueamento foram tratados com as concentrações indicadas de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos (8-PIP-AMPc + 8-HA-AMPc). Para a inibição da PKC, as células foram incubadas durante 30 min com GF109203x antes da adição de 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivos. MTT (0,5 mg /mL) foi adicionada a células de três horas antes da medição, e os cristais de formazano formados, por redução mitocondrial do MTT, foram solubilizados em DMSO /etanol 01:01. O crescimento relativo foi calculado a partir da absorvância a 550 nm, utilizando a equação seguinte: O crescimento relativo (%) = (OD

550nm de poços tratados /OD

550nm de poços de controlo) × 100

Detecção. de apoptótica DNA fragmentação

fragmentação do DNA foi avaliada utilizando o celular kit Morte detecção ELISA Plus. Este ensaio proporciona uma determinação quantitativa dos fragmentos de ADN associada-histona (mono- e oligo-nucleossomas) na fracção citoplasmática de lisados ​​celulares. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços e 24 h mais tarde tratada com 8-Cl-cAMP ou os análogos de AMPc PKA I-selectivas durante 48 h. As amostras foram, então, processadas e analisadas em triplicado, de acordo com as instruções do fabricante.

Determinação das actividades de caspase

actividade de caspase foi medida utilizando o luminescente Caspase-Glo 3/7, 8 ou 9 ensaios , seguindo as instruções do fabricante. Caspase 3/7 actividade foi normalizada para o número de células contidas em cada poço, determinada utilizando o ensaio de viabilidade celular CellTiter-Azul fluorométrico. níveis de activação de caspases 8 e 9 são expressas em relação às amostras não tratadas. Luminescentes e medições de fluorescência foram realizadas utilizando o leitor Fluoroskan Ascent FL multipanel (Thermo Labsystems, Helsínquia, Finlândia).

Análise do ciclo celular por citometria de fluxo

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas em PBS e em seguida fixadas com gelo frio de 70% de etanol. As células fixadas foram lavadas com PBS e coradas com PBS contendo /ml de iodeto de propídio 40 ug e 100 ug /ml de ARNase A a 37 ° C durante 30 min. As amostras foram analisadas com o citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Buccinasco, Itália).

Western blot análise

Para a detecção de subunidades reguladoras da PKA, as células foram lisadas em tampão RIPA modificado contendo inibidores de protease ( Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, 0,1% de SDS, 1% de NP40, 1% de Na desoxicolato, EDTA 2 mM, Na 2 mM de

2VO

4, Na 2 mM de

4P

2O

7, NaF a 2 mM). Para a detecção de ERK, Akt e p38 fosforilação da MAPK, as células foram lisadas com tampão SDS de amostra (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 50 mM de DTT, 0,01% de azul de bromofenol), imediatamente aquecida durante 5 min a 95 ° C e sonicado.