Abstract

ácido lisofosfatídico (LPA) é um lípido bioativo que aumenta a proliferação de células de cancro do ovário, migração e invasão

em vitro

e estimula a metástase peritoneal

in vivo

. LPA é gerado através da acção de autotaxina ou fosfolipases, e degradação começa com a remoção de fosfato lipídico fosfo (LPP) dependente do fosfato. Embora os efeitos do LPA sobre a progressão do cancro do ovário são claras, não foram relatados os efeitos do metabolismo do LPA dentro do microambiente do tumor em metástase peritoneal. Nós examinamos a contribuição da actividade da fosfatase lipídica ao câncer de ovário metástase peritoneal utilizando camundongos deficientes na expressão LPP1. deleção homozigótica do LPP1 (LPP1 KO) resulta em níveis elevados e menor volume de negócios de LPA

in vivo

. Dentro de 2 semanas da injeção intraperitoneal de células de câncer de ovário de rato singênica, observamos semeadura tumor aumentada em camundongos LPP1 KO em relação ao tipo selvagem. No entanto, o crescimento do tumor estabilizou nos ratinhos KO LPP1 por 3 semanas enquanto que os tumores continuaram a crescer nos ratinhos de tipo selvagem. A diminuição da carga de tumor foi acompanhada por um aumento da apoptose e nenhuma alteração na proliferação ou a angiogénese. O crescimento do tumor foi restaurado e apoptose revertida com a administração exógena de LPA. Em conjunto, estas observações demonstram que os níveis elevados de LPA por si só em murganhos KO LPP1 não inibem o crescimento do tumor. Em vez disso, os dados apoiam a noção de que qualquer das concentrações LPA elevada ou metabolismo alterado LPA afeta outras contribuições de promoção do crescimento do microambiente do tumor

Citation: Nakayama J, Raines TA, Lynch KR, Slack-Davis JK (2015. ) Diminuição peritoneal Crescimento cancro do ovário em ratos que faltam Expression of Lipid fosfato Fosfoidrolase 1. PLoS ONE 10 (3): e0120071. doi: 10.1371 /journal.pone.0120071

Editor do Academic: Tanya V. Kalin, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, United States |

Recebido: 08 de setembro de 2014; Aceito: 03 de fevereiro de 2015; Publicação: 13 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Nakayama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Câncer /National Health Institute concessão CA142783 suportado JKS-D e KRL, que também foi apoiado pelo National Institutes of Health Ciências Médicas gerais conceder GM067958-09. TAR foi apoiada por um suplemento de diversidade para CA142783. JN foi apoiado pela Universidade de Virginia Gynecologic Programa de Bolsas de Oncologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

ácido Lysophsphatidic (LPA) é um lípido bioativo que regula várias funções celulares críticas para tumorigênese e metástase incluindo a proliferação, sobrevivência e reorganização do citoesqueleto, migração, invasão e produção de citocinas [1-5]. A importância do LPA a progressão do cancro do ovário foi estabelecida quando ele foi identificado como um factor de crescimento em ascites malignas [6]. LPA estimula atividades celulares através de pelo menos três (LPA1, LPA2 e LPA3) e talvez até 6 receptores acoplados (LPA4-6) G-proteína. LPA1 é expressa em normal, epitélio de superfície do ovário; a expressão de LPA2 LPA3 e é induzida nas células cancerosas [2]. Após a ligação do seu receptor, o LPA estimula a proliferação de células de cancro do ovário, através da activação de Gα12 [4]. Todos os três receptores de regular a migração de células de câncer de ovário e invasão diretamente ativando Rac pró-migratória e vias de sinalização Rho-dependentes [1,7]. Além disso, o LPA promove o crescimento do cancro do ovário e metástase indirectamente, estimulando a produção de proteases (MMPs e activador de plasminogénio uroquinase) [8,9] e de citocinas (IL-6 e IL-8), que desempenham um papel na invasão do cancro do ovário e metástase [10]. LPA ligação a LPA2 LPA3 ou aumenta a produção de IL-6, IL-8, e VEGF. Na verdade, knockdown de LPA2 ou LPA3 diminui a produção de IL-6, e sua sobre-expressão leva ao aumento dos níveis séricos de IL-6 e VEGF, o aumento da carga tumoral e tempos de sobrevivência encurtado em um mouse modelo de cancro do ovário metástase peritoneal; modulação de LPA1 não teve efeito significativo neste estudo [11].

LPA é produzida por uma variedade de células dentro do microambiente do tumor, incluindo plaquetas, células mesoteliais, adipócitos, células endoteliais e células de cancro do ovário [12,13 ], e na ausência de cancro, as concentrações são firmemente mantida abaixo de 1 uM. Níveis de LPA são significativamente elevados no plasma e ascite (até 50 uM) de mulheres com cancro do ovário [14], e o aumento de plasma LPA tem sido sugerido como um biomarcador para o cancro do ovário [15]. Os membros da fosfolipase A

1 (PLA

1) e PLA

2 famílias remover uma cadeia de ácidos graxos a partir do ácido fosfatídico para formar LPA. Autotaxina (ATX), um lisofosfolipase extracelular D também gera LPA após a remoção de colina de lisofosfatidilcolina. PLA

2 e autotaxina são elevados em pacientes com câncer ovariano [16,17], e existe um loop de feedback positivo entre o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e produção ATX por células de cancro do ovário [18].

LPA catabolismo é iniciada por phosphohydrolases lipídicas fosfato (LPP), tipos 1, 2 e 3, que removem o fosfato para gerar monoacilglicerol (MAG). MAG é ainda clivada por lipase monoacilglicerol para liberar a cadeia de ácidos graxos a partir de glicerol. LPP1 expressão e LPP3 é reduzida em cancros do ovário humano, com relação ao tecido normal do ovário [19], enquanto forçado sobre-expressão de ambos os LPP1 ou LPP3 diminui tumorigénese de células de cancro do ovário em modelos de ratos, presumivelmente, de diminuição dos níveis de LPA [19,20].

Além de regular ovário proliferação de células cancerosas, sobrevivência, migração e invasão

in vitro

, a capacidade de LPA para promover a invasão de câncer de ovário e de crescimento tem sido demonstrado em modelos de ratos com metástase peritoneal; injecção diária ou implante de bombas que produzem concentrações elevadas de LPA aumento da carga de tumor no imunitária comprometida e modelos de murganho singeneicas [21,22]. No entanto, não foram relatados os efeitos do metabolismo do LPA dentro do microambiente do tumor em metástase peritoneal. Procurou-se determinar se a atividade prejudicada LPA fosfatase (especificamente LPP1) afetou o câncer de ovário metástase peritoneal. Em vez de orientar a actividade LPP1 nas células tumorais, examinámos o efeito de perda LPP1 no microambiente tumoral utilizando ratinhos sem LPP1 expressão após a inserção de um exão-Trap (LPP1 KO) [23] e células de cancro do ovário do rato singeneico [24] . A actividade da fosfatase lipídica em murganhos KO é LPP1 diminuiu acentuadamente (35-95%) em vários tecidos, incluindo aqueles encontrados no interior da cavidade peritoneal. Para além disso, o plasma LPA é metabolizado 4 vezes mais lentamente do que os ratinhos de tipo selvagem, e as concentrações plasmáticas de LPA são significativamente elevados nos ratinhos KO LPP1 [23]. Aqui, nós relatamos que o crescimento do câncer de ovário peritoneal em camundongos LPP1 KO foi elevada tão cedo quanto 2 semanas após o início em relação aos controlos de tipo selvagem; No entanto, enquanto a carga tumoral continuou a aumentar em ratinhos de tipo selvagem, que estabilizou após 3 semanas em ratinhos sem expressão LPP1. A diminuição da carga de tumor foi acompanhada por um aumento da apoptose e nenhuma alteração na proliferação ou a angiogénese. Os dados de um ensaio de angiogénese plugue matrigel não revelar defeitos em camundongos LPP1 KO. Além disso, a administração exógena de LPA estimularam o crescimento do câncer de ovário em igual extensão no tipo selvagem e ratinhos LPP1 KO. Em conjunto, estas observações apoiam a noção de que os ratinhos KO LPP1 qualquer falta um factor de promoção do crescimento crítica ou produzir um inibidor do crescimento do cancro do ovário, o que pode ser superada pelo aumento do LPA a seguir à administração exógena.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Transfecção

ID8 células foram generosamente fornecidos pelo Dr. K. Roby (Universidade de Kansas) [24] e cultivadas em DMEM suplementado com 4% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina , 100 ug /mL de estreptomicina, 5 ug /ml de insulina, 5 ug /ml de transferrina, e 5 ng /mL de selenite de sódio. Eles foram passadas duas vezes através de ratinhos C57BL /6 para aumentar e diminuir de tumor ter uma cinética de crescimento. A linha celular resultante, ID8ip2, foi transduzida com lentivírus que expressa luciferase (GeneCopoeia, Rockville, MD), e que expressam estavelmente as populações (ID8ip2Luc) foram obtidos após selecção puromicina (2 pg /mL) durante 2 semanas.

Rato câncer de ovário peritoneal metástase

Todos os experimentos com animais foram realizados após a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade da Virgínia. Seis a oito semanas de idade, tipo selvagem do sexo feminino (C57BL /6) ou ratos LPP1 hipomórfico (LPP1 KO) foram injectados por via intraperitoneal (IP) com 10

6 células ID8ip2Luc em 200 mL PBS. As experiências foram efectuadas com grupos de 3-5 ratos por genótipo e /ou de tratamento; o número total de ratinhos analisados ​​(n) está indicado na legenda da figura. Os ratinhos foram observados 2-3 vezes por semana por pessoal de laboratório e monitorizados para sinais de perturbação (isto é, alterações na aparência, respiração, actividade, etc.) e pesados; ratos que mostram sinais de desconforto ou perder maior do que 15% do peso corporal foram sacrificados e examinados para tumor. LPA (18: 1, Sigma-Aldrich) foi suspenso em 0,5% de albumina de soro de bovino isenta de ácidos gordos em tampão fosfato salino (PBS) a uma concentração de 100 pmol /L, e 200 uL foram entregues IP uma vez ao dia, começando um dia após a iniciação do tumor e continuada durante 6 semanas. A administração diária de veículo serviu como controle negativo. Carga tumoral foi monitorizado semanalmente por medição da emissão de luz a seguir à administração luciferina IP como uma indicação da actividade da luciferase utilizando um sistema de imagiologia IVIS (Molecular Core, Universidade da Virgínia). O fluxo total (fotões /sec) foi determinada para toda a cavidade abdominal. Após o término experimental, os ratinhos foram sacrificados e a carga do tumor avaliada em cima necropsia pela contagem do número de nódulos tumorais, e pesando o omento (principal local de implantação do tumor) e quaisquer nódulos tumorais adicionais. Fixadas em formalina, tecidos embebidos em parafina foram seccionados e H . E manchado (University of Virginia Research Histologia Core) para avaliar a carga microscópica do tumor, a extensão da invasão peritoneal e índice mitótico

Imunohistoquímica

Uma seção do tumor contendo omento por rato foi submetido a imunohistoquímica para Ki67 (1:. 500, monoclonal de coelho, Epitomics, Cat # 4203-1), caspase 3 (1: 500, policlonal de coelho, Cell Signaling, Cat. # 9661), CD31 (células endoteliais; 1:.. 4, policlonal de coelho, Abcam, Cat # ab28365), ou VCAM-1 (1: 800, policlonal de coelho, Abcam, Cat # ab134047) (Universidade de Virgínia biorrepositório pesquisa em tecidos Instalação). Resumidamente, as secções foram fervidas em pH baixo (Ki67, CD31) ou pH alto (caspase 3 clivada, VCAM-1) EnVision FLEX alvo Retrieval Solution (Dako) e corados com as concentrações indicadas de cada um dos anticorpos. complexo antigénio-anticorpo foi detectado usando Envision Dual Link (Dako) seguido de incubação com 3,3′-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB +) cromogénio (Dako) e contrastadas com hematoxilina. Ki67, e caspase 3 clivada coloração foi quantificado somando o número de células de tumor coradas positivamente e negativamente em 5 (ampliação de 400x) campos de alta potência por secção (secção de uma por rato) para calcular as células positivas por cento. A extensão da formação de vasos foi determinada por contagem do número de vasos corados CD31 e normalizando-a área total do tumor (descrito e calculada utilizando o ImageJ) 200X por campo (5 campos por secção, uma secção por ratinho). A percentagem de células mesoteliais expressando VCAM-1 membranoso foi marcado positivo em . 50%

Matrigel plugue angiogênese ensaio

Crescimento matrigel reduzido fatores (BD Biosciences) foi misturado com ID8ip2Luc células condicionado meios (1: 1) ou com 1 ug /ml de FGF, 20 ug /ml de VEGF [25] e injectada subcutaneamente em 10 de tipo selvagem ou 8 ratinhos KO LPP1. Cada rato recebeu uma ficha de matrigel com meios condicionados e um com FGF /VEGF. Após 10 dias, os ratinhos foram sacrificados, e tampões de Matrigel foram recuperadas, fixadas em formalina a 10%, embebida e seccionada, e coradas para CD31 para marcar vasos. O número total de vasos positivos CD31 em cinco campos de ampliação 200X por plugue foi contado. Fichas não foram recuperados a partir de todos os murganhos; o número de fichas para cada genótipo e estímulo angiogênico é indicado na legenda da figura.

Análise Estatística

Todos os dados foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism software 6. luminescência dados foram analisados ​​utilizando a análise de duas vias da variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. One-way ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey foi utilizado para analisar os pesos omento e coloração de tecido de ratinhos tratados com LPA ou veículo. A incidência de tumores invasivos ou VCAM-1 coloração foi analisada pelo teste exato de Fisher. Os demais dados foram analisados ​​com um teste t não pareado ou o teste de Wilcoxan-Mann-Whitney, dependendo se os dados eram paramétricos.

Resultados

semeadura tumor Aumento do peritônio em camundongos LPP1 KO

Embora a contribuição de LPA para o crescimento do cancro do ovário e progressão tem sido estudada extensivamente [1,2,4,7-11], os efeitos do LPA sobre o metabolismo progressão do cancro são mal compreendidos. Nós investigamos o efeito do volume de negócios LPA redução no crescimento do câncer de ovário e de progressão usando ratos peritoneal metastáticas sem o fosfatase lipídica, LPP1 (LPP1 KO) e uma linha de células de cancro do ovário do rato singênica, ID8ip2Luc.

In vivo

imagens de ratos após injecção intraperitoneal (IP) de células ID8ip2Luc reveladas aumentaram a luminescência em camundongos LPP1 KO em relação ao tipo selvagem dentro de 2 semanas (Fig. 1A). O exame físico da cavidade peritoneal após a necropsia 2 semanas após a iniciação do tumor mostrou nenhuma indicação de nódulos de tumor (dados não apresentados) e não houve diferença nos pesos do omento (principal local de metástases de tumor) entre genótipos (S1 Fig.) ou de não- portadores de tumor ratinhos (dados não mostrados). No entanto, a avaliação de H E secções coradas do omento revelou a presença de nódulos de tumor (S1 microscópicas Fig.), Consistente com observações anteriores [26]. Importante, significativamente mais nódulos microscópicas foram observadas em Bucim de ratinhos KO LPP1 em comparação com o tipo selvagem (Fig. 1B). Além disso, os ratinhos LPP1 KO eram mais propensos a abrigar lesões invasivos (Fig. 1C, S1 Fig.) Que coincidiam com mesotelial VCAM-1 de expressão (Fig. 1D, S1 Fig.), Que promove a invasão tumoral do mesotélio [26]. Em conjunto, estas observações indicam que a perda de LPP1 no microambiente tumoral facilita a sementeira do tumor e mesoteliais invasão da cavidade peritoneal.

ID8ip2Luc células de cancro do ovário foram injectadas IP em ratinhos C57BL /6 (WT) ou LPP1 KO. (A) Ratinhos (WT n = 10; LPP1 KO n = 12) foram fotografadas semanalmente após o início do tumor para monitorar o crescimento do tumor. Os dados representam médias fluxo total (fótons /segundo) ± err std e foram analisados ​​por ANOVA 2-way, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. (B) O número total de nódulos tumorais microscópicas foram contadas em um indivíduo, seleccionado aleatoriamente, H E secção corada de omento por ratinho obtidos após 2 semanas de iniciação do tumor (WT n = 7; LPP1 KO n = 8). Os dados representam a média ± err std; p = 0,0069 determinada pelo teste t de Student. (C) A percentagem de tipo selvagem ou LPP1 KO (a partir de (B)) com ratinhos invasivos (barras a cheio) ou não-invasiva (inclui nenhum tumor; barras ponteadas) tumores 2 semanas após a iniciação do tumor. Número de murganhos por resultado é indicado. Significância determinada pelo teste exato de Fisher. (D) A percentagem de tipo selvagem ou LPP1 KO (a partir de (B)) com ratinhos (barras sólidas, positivos) ou sem (barras ponteadas, negativos) mesotelial VCAM-1 por coloração IHC 2 semanas após a iniciação do tumor. Número de murganhos por resultado é indicado. Significância determinada pelo teste exato de Fisher.

crescimento do tumor diminuiu e aumentou a apoptose em LPP1 ratos KO

Enquanto o microambiente de ratos LPP1 KO favorece a implantação do tumor na cavidade peritoneal, ratinhos de tipo selvagem mostrou carga tumoral equivalente indicado por luminesence no prazo de 3 semanas após o início (Fig. 1a). Mais notavelmente, seguiu-se o crescimento do tumor sólido em ratinhos de tipo selvagem como mostrado pelo aumento da luminescência ao longo do tempo enquanto que os tumores nos ratinhos estabilizadas LPP1 KO em 3 semanas (Fig. 2A e 2B). Além disso, os murganhos do tipo selvagem tinham aumento do número de nódulos tumorais macroscópicas que enchem a cavidade peritoneal e aumentou o volume de tumor determinado por pesagem do omento e tumores associados (Fig. 2C e 2D). Para determinar se a ausência de crescimento do tumor nos ratinhos KO LPP1 era devido a uma menor proliferação ou aumento da apoptose, os tumores foram coradas para o marcador proliferativa Ki67 ou caspase 3 clivada, como um marcador da apoptose. Tumores derivados de tipo selvagem e ratinhos LPP1 KO tinham níveis equivalentes de proliferação (Fig. 3A). No entanto, os tumores de ratinhos KO tinha LPP1 3 vezes mais células que coram positivamente para a caspase 3 clivada em comparação com o tipo selvagem (Fig. 3B), indicando um aumento significativo na apoptose. Portanto, enquanto a perda de LPP1 no microambiente tumoral facilita a sementeira do tumor, é suficiente para sustentar o crescimento do tumor ao longo do tempo devido, pelo menos em parte a um aumento na apoptose.

Após a injecção IP de células ID8ip2Luc, os ratinhos foram fotografadas semanalmente para monitorizar o crescimento do tumor cineticamente. (A) imagens de luminescência representativos de tipo selvagem e ratinhos KO com LPP1 tumor tomadas a intervalos de 2 semanas. (B) Quantificação do fluxo total (fotões /segundo) foi determinada semanalmente para o tipo selvagem (n = 10) e LPP1 KO (n = 12) ratinhos. Os dados representam a média ± err std; p 0,001 determinada por 2-way ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. (C) Os dados representam o número de nódulos de tumores macroscópicos por ratinho determinados 8 semanas após a iniciação do tumor. Ratos com muitos nódulos para contar foram atribuído um valor de 200. Os dados representam mediana, com 25

th e 75

th percentis; p = 0,02 determinado utilizando o teste de Wilcoxan-Mann-Whitney. (D) O volume do tumor foi determinada por pesagem do omento (principal local de formação de tumores) e todos os nódulos tumorais associadas 8 semanas após a iniciação do tumor; cada ponto indica um rato individual. Os dados representam mediana, com 25

th e 75

th percentis; p = 0,0031 determinada pelo teste t de Student.

Os tumores recolhidos 8 semanas após o início foram seccionados e corados para Ki67 (A) ou caspase 3 (B). A coloração foi quantificada através da contagem do número de células positivas e negativas a partir de 5 campos de alta potência (400X) de tumores por ratinho, 5 ratinhos por grupo. Os dados são apresentados como a percentagem positiva. Box e bigodes gráficos mostram mínimo, 25

percentil, mediana, 75

percentil e valores máximos. * P 0,001, teste t de Student.

A angiogénese não é alterada em ratinhos KO LPP1

apoptose aumentou em ratinhos KO LPP1 poderia ocorrer como um resultado de uma falta de nutrientes ao tumor fornecido devido à angiogénese com defeito, a ausência de um factor pró-sobrevivência ou a presença de um indutor da morte celular. De fato, os ratos que faltam expressão LPP3 são embrionário letal devido a um defeito na angiogênese [27]. Para determinar se a angiogénese foi defeituoso em ratinhos KO LPP1, os tumores foram coradas para o marcador CD31 endotelial. Como mostrado na Fig. 4A, tumores de tipo selvagem e ratinhos LPP1 KO tinham níveis similares de coloração CD31. Para avaliar mais objetivamente se houve uma alteração intrínseca na angiogénese, foi realizado um ensaio de plugue matrigel. Resumidamente, Matrigel incorporado com meios condicionados de células de tumor ou de FGF e VEGF foi implantado nos flancos de ratinhos de tipo selvagem ou LPP1 KO para estimular a angiogénese (S2 Fig.). media de células tumorais condicionado estimulado um número equivalente de navios em tipo selvagem e ratinhos LPP1 KO (Fig. 3b). FGF /VEGF estimulada a formação de vasos em maior medida em ratinhos KO LPP1 em comparação com o tipo selvagem (Fig. 3C). Em conjunto, estas observações indicam que a apoptose aumentada e diminuição em anexo, em carga tumoral nos murganhos LPP1 KO não foi devida a um defeito na angiogénese.

(A), os tumores de ratinhos de 8 semanas após o início foram seccionados e corados para CD31, e o número total de vasos positivos CD31 por área de tumor a partir de 5 campos de alta potência (HPF; 200X) por rato para o tipo selvagem (WT, n = 5) e LPP1 KO (n = 5) ratos é traçado. O número total de vasos positivos para CD31 observada em 5 HPF de tampões de Matrigel contendo meio condicionado a partir de células ID8ip2Luc (B) ou FGF /VEGF (C) é traçado (ver Materiais e Métodos). Os dados são apresentados com caixa e bigodes como descrito para a Fig. 3. * p = 0,0083, teste t de Student.

administração do factor de crescimento exógena supera supressão do tumor em ratos LPP1 KO

crescimento do tumor reduzido na ausência de defeitos na angiogênese é indicativo a falta de um ambiente que promove o crescimento nos ratinhos KO LPP1. Tal ambiente pode envolver uma variedade de componentes, incluindo a falta de um factor de promoção do crescimento (pró-sobrevivência), a presença de um inibidor de crescimento (indutor de morte celular), a incapacidade de recrutar células auxiliares necessárias para promover o crescimento, inadequado interacções célula-célula dentro do tumor ou a qualquer combinação destes ou efeitos adicionais. Nossa hipótese é que a administração exógena de altas concentrações de um fator de crescimento que substituem as consequências negativas do ambiente inibidor do crescimento. LPA é um estimulador bem estabelecido de crescimento celular do cancro do ovário [2,4]. A administração diária de LPA foi relatado para estimular o crescimento de células cancerosas do ovário humano em ratinhos imunes comprometidos [21], e tumores no modelo do cancro do ovário do rato ID8 [22]. Portanto, foi testada a capacidade do LPA de estimular o crescimento do tumor em ID8ip2Luc LPP1 KO em comparação com ratinhos do tipo selvagem. A administração diária de LPA aumentaram significativamente o crescimento do tumor em murganhos de tipo selvagem a partir de 4 semanas após o inicio e culminou em 3 vezes mais luminescência em comparação com ratinhos de tipo selvagem sem LPA exógeno (Fig. 5A), consistente com observações anteriores [22]. LPA também estimulou o crescimento de tumores em ratinhos KO LPP1 na mesma medida observada em ratinhos de tipo selvagem tratados com LPA (Fig. 5A). Em ambos os casos, o LPA aumento da proliferação de células de tumor (Fig. 5B). Surpreendentemente, o LPA diminuiu o número de células que coraram positivas para a caspase 3 clivada ao nível encontrado em tumores de ratinhos de tipo selvagem, com ou sem LPA (Fig. 5C). Os dados indicam que a entrega de concentrações aumentadas de LPA inverte o ambiente de crescimento negativa encontrada em ratinhos KO LPP1.

ID8ip2Luc células de cancro do ovário foram injectadas IP em tipo selvagem (WT, n = 19) ou LPP1 KO (n = 20) ratinhos. Os ratinhos receberam injecções diárias de LPA (n = 6 WT, n = 7 LPP1 KO) ou de veículo (n = 13 para ambos os genótipos) começando no dia após a injecção do tumor. (A) Os ratinhos foram fotografadas semanalmente após o início do tumor para monitorar o crescimento do tumor. Os dados representam médias totais de fluxo (fótons /segundo) ± err std; * P 0,001, 2-way ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Os tumores foram recolhidos 6 semanas após o início, seccionados e corados para Ki67 (B) ou caspase 3 (C). Quantificação de Ki67 e caspase 3 foi obtida através da determinação da percentagem de células coradas positivamente em 5 campos de alta potência (400X) por ratinho, 5 ratinhos por grupo. Os dados são apresentados com caixa e bigodes como descrito para a Fig. 3. ** p 0,0001, 2-way ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey.

Discussão

LPA é um importante regulador do crescimento de cancro do ovário e metástase. Para além dos níveis aumentados encontrados em ascites, que é acompanhado por um aumento da actividade de ATX, os próprios tumores têm expressão de novo de receptores do LPA (LPA2 e LPA3) [2], e a diminuição da expressão de LPP1 e LPP3 [19,20]. Aqui, nós examinamos a contribuição do metabolismo LPA em células não-cancerosas dentro do microambiente do tumor no estabelecimento e crescimento do câncer de ovário dentro da cavidade peritoneal. A perda da expressão LPP1 dentro do microambiente do tumor levou a um aumento da sementeira do tumor após a injecção IP de células de cancro do ovário; No entanto, o crescimento subsequente foi dificultada, que foi acompanhada por um aumento da apoptose e não há defeitos na proliferação de células de tumor, angiogénese ou macrófagos e recrutamento de linfócitos (dados não mostrados). Estas observações indicam que a perda de LPP1 cria um ambiente insuficiente para suportar o crescimento do tumor, talvez devido à falta de factores pró-sobrevivência ou a presença de inibidores de crescimento.

LPP1 ratinhos KO são caracterizados como tendo aumentado os níveis de plasma e LPA volume de negócios LPA reduzida [23]. LPA estimula muitos aspectos da biologia das células de cancro do ovário, incluindo a proliferação, sobrevivência, migração e invasão [2,4]. De fato, observou-se um aumento na mesotelial invasão e tumor semeadura logo após o início do tumor em ratos LPP1 KO. LPA tem sido relatado para estimular a invasão mesotelial em modelos de cultura de células [13] e

In vivo

[22], apesar de um mecanismo ainda não foi definida. Anteriormente, foi demonstrado um papel para a VCAM-1 expressos no mesotélio na regulação de invasão do cancro do ovário in vitro e in vivo [26]. Curiosamente, os ratinhos KO LPP1 tinha uma maior incidência de mesotelial expressão VCAM-1, oferecendo a possibilidade de que o LPA pode regular a expressão de VCAM-1 para promover a invasão mesotelial. Estudos adicionais são necessários para determinar se este é o caso.

Enquanto ratos LPP1 KO aumentaram semeadura tumor na presença de níveis elevados e volume de negócios de LPA reduzida, o crescimento do tumor subsequente foi prejudicado e acompanhado por aumento da apoptose, uma resultado que contradiz bem estabelecida pró-crescimento, efeitos pró-sobrevivência de LPA. Os mecanismos pelos quais a perda de LPP1 no microambiente tumoral pára o crescimento do tumor não são claras. Uma possibilidade é que o LPA elevada como resultado da deficiência de LPP1 afecta outros componentes celulares do microambiente do tumor para impactar negativamente o crescimento do tumor. O microambiente do tumor contém uma mistura complexa de citocinas, factores de crescimento e vários tipos de células, incluindo células endoteliais e imunes que funcionam em conjunto para promover o crescimento do tumor [28]. Embora o aumento da apoptose em tumores de ratinhos KO LPP1 poderia ser devido à falta de fornecimento de nutrientes ao tumor, observou nenhum defeito na angiogénese. LPA tem sido relatado para estimular a migração e sobrevivência de macrófagos [29-31], facilitar a transmigração de linfócitos [29,32] e inibir a actividade citotóxica de células T e células NK [33,34], todos os quais se espera que promover o crescimento do tumor. Não foi encontrada nenhuma diferença nos números de macrófagos ou linfócitos (B, T e NK), em tumores a partir de ratinhos do tipo selvagem e KO LPP1 (dados não mostrados). No entanto, é possível que os tumores de ratinhos KO LPP1 têm diferentes subconjuntos de células imunitárias (ou seja, a falta de pró-tumoral ou sobre-representação de anti-tumor) e /ou regulação alteradas da sua actividade.

Os efeitos de perda de LPP1 no crescimento do tumor pode ser devida a alterações no metabolismo de outros fosfoglicéridos. Além de LPA, LPP1 atua sobre outros fosfoglicéridos, incluindo o ácido fosfatídico e esfingosina 1-fosfato (S1P) [35], que em concentrações elevadas induz a morte celular do cancro do ovário [36]. No entanto, observou-se nenhuma diferença na concentração plasmática de S1P entre o tipo selvagem e ratinhos KO LPP1 (dados não mostrados). A concentração de outros fosfoglicéridos não foi medido. É importante considerar que o volume de negócios de LPA e /ou outros fosfoglicerídeos pode ser tão importante como a sua concentração absoluta.

Em conjunto, os dados aqui apresentados indicam que a perda de LPP1 cria um ambiente insuficiente para suportar o crescimento do tumor . fornecimento exógeno de concentrações mais elevadas de LPA foi capaz de superar o ambiente inibitório para estimular o crescimento do tumor e diminuir a apoptose demonstrando que o LPA estimula o crescimento de células tumorais, independentemente de quaisquer potenciais efeitos negativos causados ​​pela perda de expressão LPP1. Outras investigações dos mecanismos (incluindo potenciais alvos celulares) responsáveis ​​pelo crescimento do tumor reduzido na ausência de LPP1 iria fornecer informações adicionais importantes sobre os efeitos da fosfoglicerídeos e seu metabolismo no microambiente do tumor, bem como componentes dentro do microambiente que podem ser importantes na promover a progressão do câncer de ovário.

Informações de Apoio

S1 Fig. Caracterização de tumores e VCAM-1 em expressão LPP1 ko e ratinhos de tipo selvagem 2 semanas após a iniciação do tumor.

Bucim (A) foram removidos e pesados ​​2 semanas após o início do tumor a partir de ratinhos do tipo selvagem e KO LPP1. Cada ponto indica um único indivíduo, e os dados representam a média ± err std. (B) com H E coradas secções de omento foram avaliados para tumores microscópicos e a extensão da invasão. As setas indicam o mesotélio; As setas indicam tumor. Os tumores não-invasivos foram caracterizados como tendo uma interface lisa entre o tumor e o tecido subjacente. tumores invasivos foram classificados como aqueles Spidering através e tendo sobre o tecido subjacente, neste caso, a gordura omental. (C) Bucim de tipo selvagem (painel superior) e LPP1 KO (painel inferior) os ratinhos foram obtidos 2 semanas após a iniciação do tumor e coradas para expressão de VCAM-1 utilizando IHC (ver Materiais e Métodos). Imagens representativas retratam o mesotélio (setas) e VCAM-1 coloração positiva (setas) nos ratinhos KO LPP1 com a falta de reactividade de VCAM-1 no mesotélio de ratinhos de tipo selvagem

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120071 .s001

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S2 Fig. . Imagens representativas do ensaio de tampão de Matrigel

Imagens representativas de vasos positivos para CD31 (indicados por setas) nos tampões de Matrigel contendo meio condicionado a partir de células ID8ip2Luc (A) ou o FGF /VEGF (B) são mostrados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0120071.s002

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