2D

Abstract

Neste estudo nós nos concentramos em proteínas sensíveis à gravidade de duas linhas celulares de cancro da tiróide humana (ML-1; RO82-W-1), os quais foram expostos a um clinostat 2D (clino), uma máquina de posicionamento aleatório (RPM) e ao normal 1

g

-Condições. Depois de um período de três (3-D) – ou sete dias de cultura (7d) sobre os dois dispositivos, verificou-se ambos os tipos de células em crescimento em três dimensões dentro de esferóides multicelulares (MCS) e também as restantes células aderentes (AD) para o balão de cultura, enquanto 1

g

-control culturas, apenas se formam monocamadas aderentes, a menos que o fundo do prato de cultura foi coberto por agarose. Neste caso, as citocinas IL-6 e IL-8 facilitaram a formação de MCS em ambas as linhas celulares utilizando a técnica líquida de sobreposição em 1

g

. ML-1 de células cultivadas em RPM ou os montantes clino libertado de IL-6 e MCP-1 no sobrenadante, que foram significativamente elevados em comparação com um

g

-Controla. A libertação de IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, a eotaxina-1 e VEGF aumento dependente do tempo, mas não foi significativamente influenciada pelas condições de gravidade. Depois de 3D sobre a RPM ou clino, uma acumulação de F-actina em torno da membrana celular foi detectável nas células DA de ambas as linhas celulares. IL-6 e IL-8 a estimulação de células ML-1 para 3d e 7d influenciado os conteúdos de proteína de SS

1-integrina, talina-1, Ki-67, e beta-actina de modo dependente da dose em células aderentes. O ß conteúdo

1-integrina diminuiu significativamente no AD e amostras de MCS em comparação com 1

g

, enquanto talina-1 foi expressa superior em MCS do que as populações AD. A proliferação marcador Ki-67 foi elevada em amostras de DA em comparação com 1

g Comprar e amostras de MCS. O teor de ß-actina de células R082-W-1 permaneceu inalterado. células ML-1 não exibiu mudança nas ß-actina em culturas RPM, mas uma redução na clino amostras. Assim, concluímos que a microgravidade simulada influencia a liberação de citocinas em células de câncer de tireóide foliculares, ea produção de ß

1-integrina e talina-1 e prevê um efeito idêntico em condições de microgravidade reais.

Citation : Svejgaard B, Wehland M, Ma X, Kopp S, Sahana J, Warnke E, et al. (2015) Efeitos comuns em células de câncer exercida por um posicionamento da máquina aleatória e uma Clinostat 2D. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10.1371 /journal.pone.0135157

editor: Yoshiaki Taniyama, Osaka University Graduate School of Medicine, JAPÃO

Recebido: 31 de janeiro, 2015; Aceito: 19 de julho de 2015; Publicação: 14 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Svejgaard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. os autores gostariam de agradecer a Agência Espacial alemã (DLR; (DG) BMWi projeta 50WB1124 e 50WB1524), a Agência Espacial Europeia (ESA; ESA-CORA-GBF-2011 -005 projeto dispositivo de comparação; ESA-CORA-GBF- 2013-001 projeto TIREÓIDE 3) (DG), Universidade de Aarhus, Dinamarca (DG), a Universidade de Regensburg (JG), e DGLRM (Programa de Fellow nova por EW e GA) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

voos espaciais prolongados muitas vezes causam problemas de saúde deletérios em seres humanos. Um número de efeitos voo espacial têm sido extensivamente estudadas no passado e avaliação [1-4]. Alguns dos efeitos podem ser explicados pela fisiologia bem conhecido; por exemplo. a falta de tensão gravitacional sobre os resultados da musculatura das pernas de uma rápida perda de massa óssea e muscular, e a falta do vector gravitacional provoca problemas relacionados com o equilíbrio e movimentos oculares [1]. Tinha-se demonstrado que anulação da gravidade influencia os mecanismos moleculares das células directamente [3]. As células expostas à microgravidade real ou simulado alterar o seu comportamento a expressão do gene e proteína [5-7], aumentar a apoptose [8, 9], retardar o crescimento das células [10] e alterar o citoesqueleto [11-13]. Além disso, os agregados multicelulares foram detectadas, que se assemelhavam aos órgãos a partir do qual as suas células foram derivadas [14].

Nos últimos anos, tornou-se evidente que os estudos sobre o comportamento de células cancerosas no espaço pode apoiar a investigação do cancro da Terra [15]. Agora é de interesse para comparar as funções de proteínas distintas na adaptação celular a alteração das condições ambientais (microgravidade). Nós caracterizada várias linhas de células de câncer de tireóide humanos cultivados em condições de microgravidade real e simulada com o objectivo de encontrar possibilidades de reduzir a agressividade de células cancerígenas [16-18]. Desde experimentos sob microgravidade verdadeira isto é, possibilidades de voos espaciais são raros e caros [16], uma grande parte dos estudos foi realizada utilizando dispositivos destinados a simular a microgravidade na Terra [3, 19]. No entanto, cada dispositivo afecta as células não só pela prevenção da sedimentação, mas também pelas características do seu modo de operação, que incluem hipergravidade transiente ou vibração [20]. Por conseguinte, considerou-se que algumas observações feitas em células cultivadas sobre um dispositivo de simulação de microgravidade pode não ser unicamente devido a evitar a sedimentação de células, mas também devido a efeitos específicos do dispositivo [18]. Além disso, observaram-se também que os efeitos são específicos para tipos definidos de as linhas de células da tiróide [21]. A fim de investigar a influência da gravidade alterada no nível celular, estudámos células de cancro diferentes em diferentes dispositivos de simulação de acordo com protocolos de microgravidade comparáveis. Anteriores à caracterização, células da tireóide humanos FTC-133, ML-1, e HTU-5 foram cultivadas na Aleatório Posicionamento Machine (RPM, Fig 1A) [17], mas apenas as células FTC-133 sobre o RPM eo 2D rotação rápida -Clinostat (clino, Fig 1B) [18] e no espaço [16, 22, 23]. As experiências revelaram vários aspectos e apontou para proteínas do citoesqueleto e citocinas como os principais alvos de efeitos de microgravidade [3, 19, 22, 23]

A:. Aleatória Posicionamento Machine (RPM) e B:. 2D-Clinostat

neste estudo investigou o impacto da microgravidade simulada usando o RPM e os dispositivos clino em duas linhas humanos foliculares cancro da tiróide celulares (ML-1, RO82-W-1) de forma paralela, quer para três (3-D) ou sete (7D) dias, respectivamente, as citocinas antes selecionados e proteínas do citoesqueleto foram quantificados. Para avaliar o possível papel das citocinas IL-6 e IL-8 para a expressão de proteínas seleccionadas em células de cancro da tiróide, estudou-se o impacto da aplicação de IL-6 e IL-8 em Ki-67, SS

1- integrina, talina-1, e proteínas beta-actina em células aderentes ML-1. Além disso, nós focada sobre o papel das citocinas IL-6 e IL-8 em ML-1 e formação de esferóides RO82-W-1 utilizando a técnica de sobreposição de líquido sob uma

g

-Condições [24]. Citocinas e proteínas do citoesqueleto, cuja libertação ou expressão foi alterada, respectivamente, são discutidas no que diz respeito às suas funções específicas no cancro da tiróide

Métodos

As linhas celulares

ML-1. linha de células.

monocamadas de ML-1 células carcinoma folicular [25] foram cultivadas em ambos o RPM ou clinostat. A linha de células ML-1 derivado de um tumor recorrente de um carcinoma da tiróide folicular (pT4 fase) pouco diferenciado de uma mulher de 50 anos de idade [25]. A linha celular tem um tempo de duplicação de 4 dias. As células pegar a glicose, secretam tireoglobulina, tiroxina e triiodotironina e são tumorigénica em ratinhos nus.

UCLA RO82-W 1-line celular.

A linha de células RO82-W-1 foi estabelecido pelo Estour

et al

. em 1989 [26]. A linha celular foi adquirida a Sigma-Aldrich Chemie (Munique, Alemanha). Esta linha celular derivada da metástase de um carcinoma folicular num paciente do sexo feminino. Embora o tumor primário de RO82-W-1 libertada tiroglobulina (Tg) para a circulação, a absorção de I131 era inferior a 2% [26]. células RO82-W-1 são Tg-positivos e também são tumorigénico em ratinhos nus [26].

Ambos linhas de células foram cultivadas em meio RPMI-1640 a 37 ° C e 5% de CO

2. O meio foi suplementado com 100 ug /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina e 10% de FCS (Biochrom tudo, Berlim, Alemanha).

Como ambas as linhas de células foliculares da tiróide humana malignas retinha a capacidade de sintetizar Tg , que representam modelos valiosos para o estudo dos carcinomas foliculares humanos.

Processo de Cultura celular

24 horas antes das experiências, as células de ambos os tipos foram semeadas em frascos de qualquer corrediça (Thermo Scientific, Roskilde, Dinamarca) com uma área de crescimento de 9 cm

2 para o clino ou em frascos T25 (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha), com uma área de cultivo de 25 cm

2 para o RPM. As células de cada tipo de frascos de cultura foram randomizados para serem cultivados como controles de solo estáticos (1

g

-condition) ou de um dos dispositivos. imagens de contraste de fase foram capturados. As imagens morfológicas de células RO82-W-1 são apresentados na Figura 2. clino e as experiências foram realizadas em RPM individuais incubadoras a 37 ° C, e controles de solo foram sempre mantida ao lado das experiências na mesma respectiva incubadora, descansando sob uma estática

g

-Condições. Células de ambos os tipos foram colhidas após dias 3d e 7d

A:. Células carcinoma folicular cultivadas em 3D na estática 1

g

. As células proliferaram como monocamada 2D. B: RO82-W-1 células incubadas em 3d sobre o RPM. As setas mostram agregados 3D (esferóides multicelulares; MCS). As inserções mostram natação esferóides 3D no sobrenadante. C: MCS formada na clino após 3 dias. D: RO82-W-1 de células cultivadas durante 7 dias na clino. As setas mostram esferóides 3D. A inserção mostra um esferóide flutuar no sobrenadante. E: RO82-W-1 de células cultivadas durante 7 dias a estática 1

g

-Condições crescer, bem como uma monocamada confluente. F: 7 dias de idade MCS formada sobre a RPM (setas) pode ser detectada e as células RO82-W-1 aderentes

Efeitos de IL-6 e IL-8 em aderente ML-1. As células cultivadas em um

g viajantes – condições

células ML-1 a partir de stocks congelados foram cultivadas em frascos T75 em meio RPMI 1640 até chegarem subconfluência (3-5 dias). Em seguida, as células foram subcultivadas em 5 T175 e, logo que eles chegaram subconfluência que foram subcultivados de novo em 20 frascos T175. Depois de obter subconfluentes, as células foram tratadas com meio RPMI veículo 1640 ou com 0,03 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /mL de IL-6 ou 1 ng /ml, 10 ng /mL, 45 ng /mL ou 100 ng /mL de IL-8 concentrações, respectivamente [27-29]. Nós também aplicado para o grupo IL-6 0,03 ng /mL e para a IL-8 45 ng /mL, porque estas concentrações foram liberados no sobrenadante por células mL-1 após 7 dias.

10 T175 frascos ( 2 T175 sem IL-6 ou IL-8 e 8 T175 com diferentes concentrações de IL-6 ou IL-8) foram cultivadas na incubadora (1

g

) de 3d, e um outro conjunto de 10 para T175 7d.

Após 3d 7d ou o meio em frascos de cultura foi rejeitado, as células foram raspadas em 10 ml de DPBS e centrifugadas em 6000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante foi removido, o sedimento foi dissolvido em 1 mL de DPBS e centrifugou-se novamente em 6000 rpm durante 15 minutos. Os peletes foram imediatamente utilizado para a extracção de proteínas, análise de transferência de Western de beta-actina, SS

1-integrina, talina-1 e Ki-67 e a seguir densitometria [17,19]. Os resultados são apresentados na Fig 3.

análises de transferência de Western e de dados são dados densitométricos. A, C: beta-actina, 3d e 7d; B, D: ß

1-integrina, 3d e 7d; E, G: Ki-67, 3 e 7 dias; F, H: Talin-1, 3 e 7 dias. IL-6 doses: 0,03 ng /mL; 1 ng /mL; 10 ng /mL e 100 ng /mL. O ng dose de 0,03 /mL é a quantidade máxima de IL-6 liberada pelas células ML-1 no sobrenadante e medido por MAP (colunas em cinzento escuro). IL-8 doses: 1 ng /mL; 10 ng /mL; 45 ng /mL e 100 ng /mL. A dose de 45 ng /mL é a quantidade máxima de IL-8 liberada pelas células mL-1 no sobrenadante e medido por MAP (colunas escuro-cinza).

Líquido-sobreposição técnica

esferóides multicelulares de tumores foram produzidos com a ajuda da técnica de sobreposição de líquido-[24]. células de cancro da tiróide da linha de células ML-1 e a linha de células de UCLA RO82-W-1 colhidas de crescimento aderente monocamadas confluentes foram plaqueadas em placas de ensaio de 96 poços múltiplos revestidos-agarose (Nunc GmbH, Wiesbaden, Alemanha) a uma concentração de 4000 células /200 uL de meio RPMI 1640 e foram incubadas a 37 ° C e 5% de CO

2. As células foram estimuladas com veículo, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /mL e 100 ng /mL) e IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /mL e 45 ng /mL). Depois 3D e 7d fotos foram tiradas e os resultados apresentados na Figura 4.

A1-A7: contraste de fase microscópicas fotos tiradas depois de 3d. células ML-1 cultivadas em poços de agarose-revestido, tratados com veículo ou diferentes doses de IL-6 ou IL-8, respectivamente. A8: esferóide 3 dias de idade e as células aderentes ML-1 na clino. B1-B7: Fotos tiradas após 3d. células RO82-W-1 de cancro da tiróide cultivadas em poços revestidos por agarose, tratado com veículo ou diferentes doses de IL-6 ou IL-8, respectivamente. B8: esferóide 3 dias de idade e as células aderentes RO82-W-1 na clino. C1-C7: As fotos tiradas após 7d. células ML-1 cultivadas em poços de agarose-revestido, tratados com veículo ou diferentes doses de IL-6 ou IL-8, respectivamente. B8: esferóide de 7 dias de idade, e a população de células aderentes ML-1 após a incubação na clino 2D. D1-D7: imagens de contraste de fase tomadas após 7d. células RO82-W-1 de cancro da tiróide cultivadas em poços revestidos por agarose, tratado com veículo ou diferentes doses de IL-6 ou IL-8, respectivamente. D8:. 7 dias de idade MCS e aderentes células RO82-W-1 após cultura na clino

Aleatório posicionamento da máquina

O RPM foi comprado de ADS, o ex-Espaço Holandês , Leyden, na Holanda (Fig 1A). A sua construção e função foi descrita anteriormente por van Loon [30]. É constituída por dois quadros rotativos independentes dentro uns dos outros. Nas nossas experiências, o RPM foi operado no modo “aleatório” (60 ° /s), em que a direcção se altera continuamente e de forma aleatória. Ao longo do tempo, o vetor de gravidade da Terra é anulado. Durante os experimentos, o RPM foi carregado com até 15 T25 cm

2 frascos que foram corrigidos para a placa de aterramento da máquina. Com efeito, todos os frascos residia dentro de uma distância de 7,5 cm a partir do centro de rotação. Na velocidade relativamente baixa (60 ° /s) do RPM, a força centrífuga experimentada por células, mesmo nos pontos mais afastados do centro de rotação é considerado negligenciável [30].

2D Clinostat

o dispositivo 2D clino (fabricado pela DLR, Colónia, Alemanha, a Fig 1B) consiste de seis braços que permitem a rotação das amostras em torno de um eixo perpendicular à força de gravidade [31]. Cada braço giratório foi carregado com 4 frascos de slides, para um total de 24 frascos por prazo. No clino, o vetor de gravidade é ao acaso pela rotação rápida e constante. Grande cuidado foi tomado para assegurar que todos os frascos seleccionados para clinorotation estavam livres de bolhas de ar que, de outra forma induzir o movimento de fluidos caótico. O clino 2D rotação constante a 60 rpm gera acelerações residuais dentro da distância de 3 mm em torno do centro de rotação da ordem de 0,012

g

, enquanto as células localizadas na maior experiência distância de até 0.036

g

[18, 31]. Embora o limite relacionadas com a gravidade das células cancerosas da tiróide é desconhecida, apenas as células localizadas dentro da distância de 3 mm em torno do eixo de rotação foram colhidas para análise, o que significa que essas células tinham experimentado uma aceleração residual muito baixo.

medições de pH

O pH foi medido com um Metrohm 827 no medidor de pH mais de 1 hora após o término experimento. Todas as medições foram realizadas duas vezes, e as amostras foram mantidas em tubos Eppendorf fechado até medição para evitar reacções com gases atmosféricos.

microscopia de contraste de fase

O Axiovert 25 Microscope (Carl Zeiss Microscopia, LLC, EUA) foi utilizado para a observação visual da morfologia das células. analisa

Western blot

análises Western blot, imunotransferência, e densitometria foram realizadas de acordo com protocolos de rotina [32-37]. Os anticorpos seguintes foram usadas para quantificar os antigénios: Anti-beta-actina, e anti-talina-1 foram utilizados a uma diluição de 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EUA); , bem como anti-integrina beta

um anticorpo (Epitomics, Burlingame, EUA); Ki-67 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, EUA (diluição 1: 500); o anticorpo secundário, ligado a HRP foi utilizado a uma diluição de 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EUA). Como um controle de carga gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (ABR-Affinity BioReagents, Golden, EUA; diluição: 1:10 000) foi utilizado

As membranas foram analisados ​​usando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda. , MD, EUA;. https://rsb.info.nih.gov/ij/), para a quantificação das bandas densitrometric

F-actina coloração

F-actina foi visualizado pela coloração com rodamina-faloidina (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) e os núcleos foram corados com Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA), tal como publicado anteriormente [36, 37]. As amostras foram montadas com Vectashield (Vector, Burlingame, CA, EUA) e analisadas microscopicamente. As amostras manchadas F-actina foram examinadas usando um Zeiss 510 META invertido microscópio confocal de varredura a laser (Zeiss, Alemanha), equipado com uma Plan-Apochromat 63 × 1,4 objetiva. E emissão de comprimentos de onda de excitação foram: λexc = 488 nm e = λem ≥505 nm para FITC. Posteriormente, as amostras foram analisadas com a ajuda do programa de análise de imagem Scion Imagem (Versão 1.63 MacOs, Scion Corporation, EUA).

medições de citocinas por tecnologia de múltiplos analitos Profiling

A libertação de citocinas foi investigada por meio de perfis de analitos múltiplos (MAP), como descrito anteriormente [18, 22]. Para cada condição, cinco sobrenadantes foram recolhidos após 72 horas e armazenados a -80 ° C até o ensaio. O MAP foi realizado pela empresa Myriad RBM (Austin, Texas, EUA), que determinou a citocinas humanas do seleções MAP A e B.

medição de citocinas por método imunoenzimático

IL-6, IL-8, MCP-1 e proteínas libertadas a partir de células RO82-W-1 nos sobrenadantes de cultura de células durante RPM e clino experiências foram detectadas por ELISA adquiridos de R D systems [38]. Os testes ELISA foram realizados de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante.

Avaliação Estatística

SPSS 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para avaliação estatística. O teste de Mann-Whitney-U-teste foi realizado para comparar um g e condições de s-ig, bem como células aderentes s-ig e S-ig células MCTS. Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (SD). Os valores de p 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

As células das linhas celulares de cancro da tiróide folicular ML-1 e RO82-W-1 foram cultivadas em 3d e 7d no RPM, por clino 2D e em laboratório estático normal de 1

g

-Condições. Até ao sétimo dia, o pH manteve-se na gama normal, independentemente do facto de as células foram cultivadas em RPM, sob uma

g

ou na clino. No entanto, as células permaneciam em crescimento numa monocamada apenas se a cultura foi realizada sob uma

g

, enquanto que, quando cultivados sob condições de gravidade alterada, a células divididas em duas populações de células que um composto restantes aderente, enquanto que a outra células continha 3D formando agregados semelhantes às descritas para as células de FTC-133 [18].

recebeu resultados semelhantes com células as RO82-W-1 e ML-1. Ambos os tipos de células proliferaram como as células RO82-W-1 apresentada na figura 2 como uma monocamada aderente (Fig 2A e 2E) e como esferóides multicelulares sobre a RPM (Fig 2B e 2f) e o clino (fig 2C e 2D). Não houve diferenças em termos de número de esferóides de cada linha celular que surgiu em ambos o RPM ou clino. Ambos os dispositivos entregue esferóides de tamanhos diferentes (máx. De diâmetro 0,4 mm) em ambos os pontos de tempo, como mostrado na Figura 2B, 2C, 2D e 2F. Desprendimento de células AD começou cedo e separação celular e formação esferóide ocorreu também após 7d.

Impacto da IL-6 e IL-8 em células mL-1 cultivadas sob um

g

-Condições

IL-6 (0,03 ng /mL e 1 ng /mL) a estimulação aumentou a quantidade de beta-actina e SS

1-integrina em células aderentes mL-1. Além disso, a IL-8 (1, 10 e 45 ng /ml) aumentou o conteúdo de proteína beta-actina nestas células, enquanto que as doses única mais elevadas (10-100 ng /ml), elevam o teor de proteína de SS

1-integrina no prazo de 3 dias (Fig 3A e 3B).

Após 7d, um aumento foi encontrado para a proteína beta-actina em todas as amostras tratadas com IL-6, bem como nas amostras tratadas com 1 e 10 ng /ml de IL -8 (Fig 3C). O SS

proteína 1-integrina foi induzida por 0,03 ng /mL, bem como por 10 ng /ml de IL-6, ao passo que apenas 10 ng /ml de IL-8 induzida a quantidade da proteína depois de um dia de estimulação 7 (Fig 3D).

Além disso, ambas as citoquinas (IL-6 e IL-8, todas as doses) induziu um aumento do teor de proteína Ki-67 depois de 3d (Figura 3E). Após 7d, todas as doses de IL-6, bem como 1 ng /mL e 100 ng /ml de IL-8 aumentou a quantidade de proteína Ki-67 em células ML-1 (Figura 3G). Em contraste, o teor de proteína talina-1 foi claramente reduzida por IL-6 e IL-8 de aplicação para o meio. As doses baixas de IL-6 e todas as doses de IL-8 eram eficazes (Figura 3F) durante o 3-dia-1

g

-experiment. Outro resultado foi encontrado após 7d. IL-6 de estimulação resultou em um aumento de talina-1 (Figura 3H). Uma conclusão semelhante foi observada em amostras tratadas com IL-8 (1, 10 e 45 ng /ml) da linha de células ML-1.

Estas experiências definidas, em primeiro lugar, a óptima de IL-6 e IL-8 as doses para a expressão de proteínas distintas sob 1

g

-Condições e em segundo lugar, as doses para testar o seu impacto na formação de MCS utilizando o método de sobreposição de líquido (ver abaixo e figura 4).

impacto da IL-6 e IL-8 sobre a formação esferóide com menos de 1

g

-Condições

Depois de 3d, células mL-1 só mostrou agregados de células soltas, quando cultivadas sob um

g

-Condições de agarose. 10 e 100 ng /ml de IL-6 e 1, 10 e 45 ng /ml de IL-8 tratamento resultou em uma melhor agregação das células ML-1 para esferóides, quando elas são cultivadas em poços revestidos-agarose (Liquid-sobreposição técnica) (Fig 4A1-4A7). RO82-W-1 de células formadas grandes agregados irregulares após 3 dias de incubação-em poços revestidos com agarose. Ambas as citocinas melhorou a formação de RO82-W-1 esferóides multicelulares usando o método líquida de sobreposição (Fig 4B1-4B7).

Depois de 7d, as células ML-1 mostrou agregados celulares formados irregulares em agarose. Os grupos tratados com citocinas continha várias esferóides densos após uma semana de estimulação (figura 4C). Os esferóides ML-1 formadas na clino foram semelhantes aos esferóides líquida de sobreposição tratados com 45 ng /ml de IL-8 (Fig 4C7 e 4C8).

Após 7d, as células RO82-W-1 cresceram na forma de esferóides multicelulares densas, bem como células individuais que nadam no sobrenadante em cavidades revestidas com agarose. aplicação de citocinas para a forma reforçada ligeiramente o tamanho dos esferóides (Fig 4D1-4D7).

Os esferóides de ambos os tipos de células formadas depois de a IL-6 e IL-8 de tratamento exibiram uma morfologia similar à que foi produzido após MCS incubação na clino (Fig 4A8, 4B8, 4C8 e 4d8).

liberação de citocinas pelos mL-1 células

a medição das citocinas da citocina Humano seleções MAP a e B foi detectada IL 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-a e da eotaxina-1 em sobrenadantes de várias culturas de células. Medimos a cerca de 32 pg /ml de IL-4 e IL-7 em sobrenadantes de culturas de células de três dias de idade, independentemente do facto de as células terem sido incubadas na RPM, na clino ou na estacionária 1

g

-control. Após uma com 7 dias de exposição, os sobrenadantes de cultura celular continha cerca de 47 pg /ml de IL-4 e cerca de 43 pg /ml de IL-7, independentemente das condições de cultura (Fig 5A e 5C). Um fenômeno similar foi observado em relação à IL-8 e VEGF-A. Cerca de 710 pg /ml de VEGF-A e 11000 pg /ml de IL-8 foram encontradas nos sobrenadantes de culturas de três dias de idade, independentemente do facto de as células terem sido incubadas na RPM, na clino ou sob estacionária 1

g

-Condições. Após uma com 7 dias de exposição, o VEGF-A e as concentrações de IL-8 foram aumentadas para cerca de 3000 pg /ml de VEGF-A e cerca de 35.000 pg /ml de IL-8 foram detectados, novamente sem diferença significativa no que diz respeito às condições de cultura (Fig 5D e 5F). Tomados em conjunto, Figura 5A, 5C, 5D e 5F mostram que o teor de IL-4, IL-7, o VEGF-A e IL-8 nos sobrenadantes de cultura foram reforçadas nos 7 dias de amostras, em comparação com o ácido 3- dia-amostras, enquanto uma influência significativa da exposição das células ao RPM ou clino não pode ser visto por estes tipos de citocinas 4

a:. IL-4, B: IL-6, C: IL 7, D: IL-8, e: MCP-1, F: proteínas VEGF-a libertadas por células ML-1 no sobrenadante após uma 3 e 7 dias de exposição à RPM ou Clinostat 2D, determinada por multi Profiling -Analyte do sobrenadante. RPM: Máquina de Posicionamento aleatória; Clino: 2D Clinostat; * P 0,05

Em contraste, a acumulação de IL-6 e MCP-1 em sobrenadantes de cultura das diferentes claramente dependia das condições de cultura. A libertação de 27 e 33 pg /ml de IL-6 foi encontrada nos sobrenadantes de amostras de RPM após 3d e 7d de cultura, respectivamente, enquanto uma quantidade de 22,5 pg /ml de IL-6 foi medido em relevante 1

g

-Controla (Fig 5B). Do mesmo modo, uma concentração de 24 e 36 pg /ml de IL-6 foi encontrada nos sobrenadantes de amostras clino depois de um dia de experiência 7 3- e, respectivamente, ao passo que cerca de uma quantidade de 25 pg /ml de IL-6 foi medido em relevante 1

g

-Controla (Fig 5B). Além disso, os níveis de proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) alterado, quando a cultura de células foi executada em dispositivos de simulação de microgravidade. Sob condições normais de gravidade, de cerca de 600 pg /mL de MCP-1 foram encontrados após 3 dias e entre 700 e 750 pg /mL ao fim de 7 dias, enquanto que as concentrações de MCP-1 aumentou 750-950 pg /mL no RPM e de 700 a 1000 pg /mL no clino (Fig 5E).

Além dos seis citocinas mostrados na figura 5, buscamos outras citocinas como mostra a Tabela 1. no entanto, não detectamos mais citocinas liberadas na sobrenadante durante 3 dias de cultura de células sob qualquer condição. A libertação de IL-17 e eotaxina foi detectável nas amostras cultivadas durante 7 dias na clino, sobre a RPM, bem como sobre o solo, sem diferenças significativas em concentrações de cerca de 1 pg /ml (IL-17) e 15 pg /mL (eotaxina) (Tabela 1).

liberação de citocinas por células RO82-W-1 |

Nós investigamos a liberação de citocinas selecionados no sobrenadante de células RO82-W-1 após um de 3 dias de exposição ao RPM ou os dispositivos clino. A quantidade de IL-6 foi significativamente elevados a partir de 56,9 pg /mL a 75,2 pg /mL no RPM (Fig 6A). Um resultado similar foi obtido por IL-8 (Fig 6B). aumento não significativo para ambas as citocinas foram medidos para as amostras-clino.

A secreção da MCP-1 de células RO82-W-1 foi muito menor do que a libertação de células ML-1 (Figuras 5E e 6C ). Cultura de RO82 W-1 em células RPM ou o clino embotados completamente a libertação de MCP-1 (Fig 6C)

A:. IL-6, B: IL-8, e C: MCP- 1 proteínas libertadas pelas células RO82-W-1 de cancro da tiróide para o sobrenadante após 3 dias de exposição ao RPM ou clino 2D, determinado pela técnica de ELISA. RPM: Máquina de Posicionamento aleatória; Clino: 2D Clinostat; * P . 0,05

Efeitos de microgravidade simulada no citoesqueleto

Uma vez que estudos anteriores mostraram que as proteínas do citoesqueleto de diferentes tipos de células são gravemente afectados pela microgravidade [11-13, 37, 39-41], foi realizada a coloração de F-actina em células cultivadas em RPM e na clino 2D para 3D e 7d. Após 3 dias, uma acumulação da actina F ao longo da membrana celular exterior era visível em células ML-1, bem como em RO82-W-1 de células cultivadas na clino e as RPM (Fig 7). Após 7 dias, as células foram completamente confluentes e overgrew uns aos outros. Um espessamento da membrana externa foi encontrado em ambas as condições (1

g

e simulado de microgravidade), mas foi mais pronunciado no RPM e o clino

CA:. ML-1-3 dias -experimentar. A: ML-1 células, 3d, 1

g

-condition: células normais com o normal citoesqueleto de actina F B: células ML-1, 3d, acumulação de F-actina na membrana celular exterior (setas amarelas ) após RPM-exposição. A seta marca o branco descolamento de agregados de células a partir da camada de células aderentes. C: células ML-1, 3d, camadas mais espessas de actina F na membrana celular exterior (setas amarelas). D-F: ML-1 7-dias-experimento. D: células ML-1, 7d, 1

g

-condition: células normais confluentes com citoesqueleto de actina F normal. E: células ML-1 cultivadas em RPM durante a 7d revelou camadas mais espessas de actina F na membrana externa (de inserção). F: A 7 dias de exposição das células ML-1 para o clino induziu alterações similares do citoesqueleto de actina F. A inserção mostra fibras de relógio de F-actina com as membranas celulares. G-I: RO82-W-1 de 3 dias de experiência. L: citoesqueleto de actina F normal das células RO82-W-1. H: Formação de MCS (setas amarelas), após 3 dias de incubação no-RPM. Uma acumulação de F-actina na membrana celular exterior é visível (setas amarelas). I: RO82-W-1 cultivadas em 3D na clinostat revelaram uma clara espessamento das fibras F-actina (setas). Inserção: 3D MCS. J-L: RO82-W-1 com 7 dias de experiência. J: citoesqueleto de actina F de células confluentes RO82-W-1 crescido a 1

g

. K, L: MCS a formação de células RO82-W-1 após rpm- (K) e clino-exposição (G). As setas indicam a MCS 3D e um engrossamento de fibras de F-actina nas membranas externas.

análises de Western blot de β-actina na ML-1 células revelaram uma diminuição após 7d de clinorotation (Fig 8A ), mas a proteína permaneceu inalterada depois de 7d RPM-exposição. A exposição das células ML-1 ao RPM e clinostat induzida reduções significativas de β

1-integrina em AD e células MCS após 7d (Fig 8B). Talina-1 de proteína foi significativamente reduzido em apenas células DA, quando as células ML-1, foram incubadas na clino (Figura 8C). Ki-67 de proteína, uma proteína nuclear, associado com o processo de proliferação celular, foi significativamente elevada nas células DA em comparação com o MCS e 1

g

-control células de ambos os dispositivos (Figura 8D).

análises de Western blot de AD: células ML-1 após um 7 dias de exposição no RPM e clino. A: ß-actina, B: ß

1-integrina, C: talina-1 e D: proteínas Ki-67. Diferenças claras entre os dois dispositivos são encontrados para ß-actina. análises de Western blot de E-H: RO82-W-1 após um células sete dias de exposição em RPM e o clino. E: ß-actina, F: ß

1-integrina, G: talina-1 e H: Ki-67 proteínas. Não houve alteração no conteúdo de beta-actina de RO82-W-1 de células cultivadas sobre a RPM ou clino para 7d. A quantidade de ß

1-integrina e Ki-67 foi comparável à das culturas ML-1 cultivadas em s-μ

g

. * P . 0,05

Nenhuma alteração no beta-actina foi encontrado em células RO82-W-1 após um 7 dias de cultura sobre o RPM ou clino (Fig 8E). O teor de proteína de beta-actina permaneceu constante.