Abstract

Fundo

formação de metástases ósseas são uma consequência comum e incapacitante do câncer de próstata (PAC). O papel potencial de actividade dos osteoclastos em metástases ósseas tampa não está completamente explicado. Neste estudo, nós investigamos

ex vivo

se a atividade osteolítica está presente e como ele é governado em pacientes com PAC com metástases ósseas formando.

Metodologia

Quarenta e seis pacientes afetados pela CAP recém-diagnosticados e controles saudáveis ​​foram inscritos. No momento do diagnóstico, 37 pacientes tinham apenas um tumor primário, enquanto que 9 tinha tumor primário e metástases ósseas formando concomitantes. Em todos os doentes houve nenhuma evidência de metástases para outros locais não ósseos. Para todos os pacientes e controles foram coletadas amostras de sangue e urina. Nós avaliamos a homeostase óssea dos pacientes; fizemos culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para detectar

in vitro

osteoclastog�ese; que doseados soro expressão de moléculas envolvidas no cancro induzido osteoclatogenesis, tal como RANKL, OPG, TNF-alfa, DKK-1 e IL-7. Por Real-Time PCR, quantificamos DKK-1 e IL-7 a expressão do gene em tumores dissecados-micro e cortes de tecidos saudáveis.

principais conclusões

pacientes metastáticos CaP osso mostrou metabolismo interrupção osso com aumento da reabsorção óssea e formação em comparação com pacientes não-metastáticas ósseas e controlos saudáveis. As culturas CaP PBMC mostrou um osteoclastog�ese reforçada em pacientes com metástases ósseas, devido a um aumento do rácio de RANKL /OPG. Detectamos aumento DKK-1 níveis séricos e expressão gênica tecido em pacientes em relação aos controles. IL-7 resultou alta no soro dos pacientes, mas sua expressão gênica tecido foi comparável em pacientes e controles.

Conclusões

Nós demonstramos

ex vivo

que osteoclastogênese é um ativo mecanismo no assentamento tumor de osso formando câncer metastático e que o soro DKK-1 níveis aumentam em pacientes com PAC, sugerindo a investigar profundamente seu papel como marcador tumoral

Citation:. Roato I, D’Amelio P, Gorassini e , Grimaldi A, G Bonello, Fiori C, et ai. (2008) Os osteoclastos são ativos na formação óssea Metástases de próstata pacientes com câncer. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10.1371 /journal.pone.0003627

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2008; Aceito: 15 de outubro de 2008; Publicação: 03 de novembro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Roato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Compagnia di San Paolo e Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Prostate câncer (PAC) é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens [1]. Uma característica típica do PAC é a capacidade de metastatize ao osso, como mais de 80% dos homens que morreram para CAP desenvolveu metástases ósseas [2]. Crescimento do PAC no osso promove lesões principalmente osteoblásticas com áreas osteolíticas subjacentes [1]. Em condições de osteoclastos fisiológica (OC) e a atividade dos osteoblastos é bem equilibrada, mas na condição patológica este equilíbrio (homeostase óssea) é interrompido. O papel do CO em metástases osteolíticas foi claramente demonstrada, e tem sido sugerido que COs pode desempenhar um papel importante nas metástases osteoblásticas bem. As interacções entre células, osteoblastos CaP e COs sugerem que tropismo óssea pode ser causada pela dependência do tumor em um ou mais de osteoblastos /factores derivados de ° C durante o crescimento celular do cancro e manutenção [3].

Demonstrámos anteriormente que os pacientes com metástases ósseas osteolíticas de diferentes tumores sólidos mostraram reforçada osteoclastog�ese espontânea, devido a um aumento da libertação de factores de células T pró-osteoclastogênicos, tais como TNF-alfa, IL-7 e RANKL [4]. O papel de OPG eixo /RANKL no componente osteolíticas de metástases ósseas CAP-mediadas foi elucidado [5], enquanto que o TNF-alfa e IL-7 em funções possíveis lesões ósseas PAC permanecem pouco claras.

Outros factores importantes em biologia óssea são WNTs, uma família de pequenas glicoproteínas segregadas, que inibe a diferenciação OC [6], e estimula a actividade osteoblastogênese mineralização dos osteoblastos [7]. A actividade da família WNT é antagonizada por vários factores segregados tais como proteínas Dickkopf (DKK). Dados recentes relataram DKK-1 expressão em algumas amostras humanas de tumores, sugerindo que uma modulação mediada por câncer de actividade WNT influencia o fenótipo metastático [8], [9].

Esta investigação transversal foi projetado para estudar como osso formando metástases pela CAP afeta a remodelação óssea, formação de OC por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e a produção de fatores osteoclastogênicos e anti-osteoclastogênicos em pacientes afetados por CaP metastático ósseo.

Nós relatamos um aumento osteoclastogénese em pacientes com CaP metastático do osso, devido a um aumento do rácio de soro de RANKL /OPG, sugerindo que a formação melhorada OC desempenha um papel activo na formação de metástases ósseas. Detectamos alta DKK-1 níveis séricos e expressão gênica em pacientes com PAC em comparação com controles saudáveis.

Resultados

A modificação óssea é maior em pacientes com metástases ósseas

Os marcadores de osso volume de negócios foram maiores nos pacientes com metástases ósseas comparação com os doentes metastáticos não-ósseas e controles saudáveis ​​(Tabela 1). Em detalhe, pacientes com PAC não mostrou diferenças significativas na densidade óssea, mas tinha maior PTH, BAP, BGP, TRAPC5b e os níveis de reticulação do que os controles saudáveis. Estes resultados confirmam a ruptura na homeostase óssea com aumento da reabsorção óssea e formação em doentes metastáticos.

osteoclastogênese é aumentada em metástases do osso de CAP

Para avaliar se o aumento da reabsorção óssea em metastático pacientes é devido a um aumento na formação de OC, examinamos a capacidade de

in vitro

PBMC para diferenciar espontaneamente em OCs em pacientes com ou sem metástases ósseas e controles saudáveis.

a diferenciação OC foi demonstrada pela presença de células positivas /TRAP multinucleadas do doente de cancro e de controlo saudáveis ​​PBMC (Fig. 1A-C). Como mostrado na Fig. 1D o número de anticoncepcionais orais foi significativamente maior em pacientes com metástases ósseas (média ± SE, 216,22 ± 39,55) do que em pacientes sem metástases ósseas (112,71 ± 14,76) e nos controles saudáveis ​​(73,55 ± 11,69),

p Art . 0.001

TRAP células multinucleadas positivas foram identificadas como anticoncepcionais orais e contou, em ambos os pacientes e controles saudáveis ​​culturas, (a). O número OC em pacientes com metástases ósseas foi significativamente maior do que em pacientes não-metastáticos ósseas,

p Art 0,004 e em controles saudáveis,

p

. 0,001 (B)

RANKL /OPG é aumentada em pacientes metastático

a fim de investigar os fatores responsáveis ​​pelo aumento da osteoclastogênese em pacientes, nós dosados ​​os níveis séricos de TNF-alfa, RANKL e OPG. Os níveis séricos de TNF-alfa não foram significativamente diferentes entre os três grupos (dados não apresentados), enquanto que foi observado um aumento significativo na relação de RANKL /OPG em soros metastática óssea (19,62 ± 6,52) em comparação com pacientes não-metastáticas (5,48 ± 2,48) e controles saudáveis ​​(6,89 ± 2,6),

p

. 0,03

nível de IL-7 soro é aumentada em pacientes com câncer

Nós medidos IL-7 níveis séricos de pacientes e controles. Séricos de IL-7 níveis foram significativamente maiores em pacientes com metástases ósseas (média ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) do que nos controles saudáveis ​​(7,07 ± 1,27 pg /ml), p 0,001. Nós doseados comparáveis ​​de IL-7 em níveis não metastático do osso (19,75 ± 3,55 pg /ml) e pacientes ósseas metastáticas (19,86 ± 2,01 pg /ml), (Fig. 2a). Este resultado levou-nos a investigar se as células tumorais foram responsáveis ​​pelo aumento da produção de IL-7; portanto, nós examinamos a expressão quantitativa IL-7 no tampão e nos tecidos saudáveis ​​da próstata. As células de tumor expressa níveis baixos e comparáveis ​​de IL-7 em pacientes e controlos saudáveis ​​(Fig. 2B). Isto sugere que o aumento de circulação de IL-7 pode depender da produção pela célula do sistema imunitário, tais como linfócitos T e B [4].

IL-7 níveis séricos em doentes com /sem metástases ósseas e em controles saudáveis ​​foram medidos por ELISA. metastática óssea (

p Art 0,01) e pacientes metastáticos não-ósseas (

p Art 0,03) apresentaram níveis séricos de IL-7 significativamente mais elevados em comparação com controles saudáveis ​​(A). PAC e tecidos saudáveis ​​foram analisados ​​por PCR em tempo real, a fim de quantificar a IL-7 a expressão do gene. A quantização IL-7 foi expressa como a IL-7 em β-Actina (o gene de controlo) do número de cópias de plasmídeo. O histograma mostrou IL-7 níveis de expressão comparáveis ​​no tampão e tecidos saudáveis.

DKK-1 expressão é maior em pacientes com PAC

Os dados da literatura relatou que DKK-1 está envolvido no osso homeostase [8]. Nós dosado nível sérico DKK-1 em pacientes com PAC e controles saudáveis. pacientes com PAC apresentaram maiores níveis DKK-1 do que os controles saudáveis,

p Art 0,004 (Fig. 3A). Para avaliar se ou não DKK-1 é produzida por tecidos de câncer, estudamos a sua expressão no PAC e tecidos saudáveis ​​por RQ-PCR. Nossos dados demonstraram que o tecido CaP expressa significativamente mais DKK-1 do que o tecido saudável, p . 0.001 (Fig. 3B)

DKK-1 níveis foram dosados ​​em pacientes de soro com /sem metástases ósseas e controles saudáveis ​​por ELISA. metastática óssea (

p Art 0,004) e os doentes metastáticos não-ósseas (

p Art 0,01) apresentaram níveis séricos DKK-1 significativamente maiores em comparação com controles saudáveis ​​(A). PAC e tecidos saudáveis ​​foram analisados ​​por PCR em tempo real, a fim de quantificar a expressão de DKK-1gene. O DKK-1 foi expressa como quantização DKK-1 em β-Actina (o gene de controlo) do número de cópias de plasmídeo. O histograma apresentaram maiores DKK-1 níveis de expressão em Cap do que em tecidos saudáveis,

p

. 0,001 (B)

Discussão

O câncer de próstata freqüentemente desenvolvem osso formando metástases; deixa de ser uma atividade osteolítica rápida está presente em metastático em comparação com pacientes não-metastáticos [10]. Os mecanismos através dos quais CaP promove remodelação óssea aberrante não estão claramente definidos. A divulgação de nidificação tumor no osso pode fornecer novas ferramentas para o diagnóstico precoce de metástases ósseas e sugerir novos regimes terapêuticos para o controle da progressão da PAC. O objetivo do nosso estudo foi investigar como o componente osteolítico de metástase óssea afeta a remodelação óssea, formação de OC por PBMC, ea produção de osteoclastogênicos e anti-osteoclastogênicos fatores em pacientes acometidos por CaP metastático ósseo.

No seleção de casos de PAC, decidimos para evitar pacientes com doença metastática avançada, uma vez que regimes terapêuticos pode representar um viés para a nossa análise. No presente estudo, nós temos um desequilíbrio entre o osso e o número dos pacientes não-metastáticas óssea, o que depende da presença de uma quantidade menor de metastático do osso em comparação com pacientes com PAC metastático não-ósseos no diagnóstico [3]. Na verdade, na história natural da doença, metástases ósseas são um evento frequente, mas tarde [11].

A renovação óssea foi aumentada em pacientes com metástases ósseas, em particular, observou-se tanto um aumento na formação óssea e marcadores de reabsorção. nível de PTH foi ligeiramente aumentada em pacientes com metástases ósseas, em comparação com controles saudáveis, de acordo com a capacidade de PTH para promover o crescimento ea capacidade de invasão das células cancerosas da próstata nos ossos [12]

.

O aumento observado na reabsorção óssea e os já demonstraram osteoclastog�ese espontânea em pacientes com câncer com metástases osteolíticas [13] nos levou a investigar osteoclastog�ese de PBMC dos pacientes CaP

in vitro

. formação OC foi maior em pacientes com metástases ósseas em comparação com os doentes metastáticos não-ósseas e controles saudáveis. Para identificar os fatores responsáveis ​​pelo aumento da formação de OC, medimos moléculas principalmente envolvidas na osteoclastogênese, tais como TNF-alfa, RANKL, OPG, IL-7 e DKK-1. Os níveis séricos de TNF-alfa não foram significativamente aumentados em pacientes com CaP, de forma diferente a partir de outros tumores metastáticos óssea, onde o TNF-alfa desempenha um papel importante na osteoclastog�ese [14]. Caso contrário, o RANKL /OPG foi mais elevada em pacientes com metástases ósseas, explicando o aumento da osteoclastogénese e de acordo com os dados da literatura anteriores [15].

A interacção entre as células tumorais, o sistema imunológico e o tecido ósseo se tornou objeto relevante de estudo intensivo. Desde IL-7 envolvimento em metástases ósseas foi anteriormente demonstrada em outros tumores [4], [16], investigamos esse problema mostrando um aumento no soro IL-7 níveis em pacientes com PAC com e sem lesões ósseas. O aumento de IL-7 pode explicar o Augment RANKL /OPG, uma vez que a IL-7 estimula a produção de RANKL a partir de células T [17]. Foram avaliados IL-7 de expressão gênica no tampão e tecidos da próstata normais, mostrando a expressão de IL-7 comparável em câncer de próstata e tecidos normais. Este resultado difere dos seus dados publicados sobre o cancro do pulmão, onde o tecido de tumor expressas mais elevados níveis de IL-7 em comparação com a célula de [18]. Nós sugerimos que esta discrepância poderia ser devido ao tipo de tumor diferente e comportamento metastático do osso, como câncer de pulmão provoca metástases osteolíticas, enquanto CaP produz principalmente osso formando lesões. O aumento do nível de soro de IL-7 pode depender de activação do sistema imunitário contra o tumor. De facto, tem sido demonstrado anteriormente que as células T e B produzem IL-7, em ambos os tumores e outras patologias associadas a reabsorção óssea [4], [19], [20]. sinalização Wnt desempenha um papel importante no desenvolvimento de osso, uma vez que inibe a diferenciação OC [6], e estimula a actividade osteoblastogênese mineralização dos osteoblastos [7]. proteínas Wnt também são expressas por boné e pode promover a invasão óssea tumor [21]. DKK é um inibidor solúvel de sinalização Wnt canónica [22]. Um estudo recente associa DKK-1 expressão em cancro da mama com a presença de metástases ósseas [23]. Os dados referentes a DKK-1 expressão em Cap são escassos: alguns autores relatam um DKK-1 expressão aumento de lesões ósseas, mas não nos tumores primários [8]. Salão

et al

informou que Cap-derivado DKK-1 está envolvido na atividade osteoblástica em metástases ósseas, uma vez que DKK-1 de sinalização pode explicar a mudança da resposta óssea às células da PAC osteolítico para osteoblástica e vice-versa [24 ]. Neste trabalho, estudamos apenas os pacientes com metástases ósseas formando, portanto, não somos capazes de correlacionar a atividade osteolítica induzida por células PAC e DKK-1 expressão, como descrito anteriormente [8]. No entanto, encontramos uma grande quantidade de DKK-1 em amostras sorológicas de pacientes com câncer e uma expressão de gene reforçada DKK-1 em tecidos boné, sugerindo que os DKK-1 níveis séricos aumentaram em pacientes com PAC pode depender da secreção das células PAC. Este resultado vai estudar profundamente a fim de avaliar o papel potencial da DKK-1 como marcador tumoral no PAC. Além disso, pode-se especular que as células CaP estimular o ambiente da medula óssea para aumentar a liberação DKK-1 através de mecanismos desconhecidos. Em nossos pacientes com metástases ósseas, os níveis séricos DKK-1 são ligeiramente aumentada em comparação com pacientes não-metastáticos, sem diferença estatisticamente significativa. Isso pode depender de nossa baixo número de pacientes, mas investigando um grande número de pacientes, esperamos mostrar a diferença entre os dois grupos, confirmando os dados da literatura [23].

Materiais e Métodos

pacientes e marcadores de renovação óssea

o projeto experimental e todos os estudos realizados sobre os pacientes foram aprovados pelo Comitê de Ética da Instituição (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Giovanni Battista em Torino) e consentimento informado por escrito da pacientes e controlos saudáveis ​​foi obtido. A população estudada incluiu 46 pacientes afetados pela CAP recém-diagnosticados (37 tinha apenas um tumor primário, enquanto que 9 tinha tumor primário e metástases ósseas formando concomitantes) e 20 homens saudáveis. Em todos os doentes houve nenhuma evidência de metástases para outros locais não ósseos. Foi demonstrado que a perda de estrogénios afectam significativamente a formação de osteoclastos [25]. Assim, estudamos tampa que, sendo um único tumor do sexo masculino, evita por padrão todos os possíveis vieses devido às variações cíclicas de estrogênio e queda nos níveis de estrogênio na pós-menopausa em mulheres. Pacientes e controles foram pareados por idade e índice de massa corporal. A densidade mineral óssea (DMO) foi medida por emissão dupla absorciometria de raios-X com um Hologic QDR 4500 na coluna lombar e colo do fêmur, tanto em pacientes e controles. Foram excluídos os indivíduos com doenças de má absorção intestinal, outro tipo de estado nutricional deficiente, osteoporose secundária ou tomar medicamentos activos na remodelação óssea ou terapia anti câncer. A presença de metástases ósseas foi confirmada usando a cintilografia óssea

99Tc e outros estudos de imagem de acordo com a prática clínica padrão.

A fim de investigar o status metabolismo ósseo, os pacientes e controles foram submetidos à análise de marcadores clínicos padrão do metabolismo do osso, tal como PTH no soro, fosfatase alcalina óssea (BAP), cálcio, fosfato, osteocalcina (BGP) e desoxipiridinolina urinária (reticulações urinário) [26]. Em particular, a reticulação de dosagem foi escolhida na prática clínica para monitorizar a doença metastática óssea e a resposta aos tratamentos anti-reabsorção tal como bifosfonatos [27], [28]. Como marcadores de reabsorção óssea também medido Tartarato Resistente fosfatase ácida 5b (TRAP5b) em soros [29], por kit BoneTRAP ELISA (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, Fin). marcadores sorológicos, tais como PSA e graduação histológica, de acordo com Gleason, foram registrados para todos os pacientes incluídos no estudo [30], [31]. Todas as medições bioquímicas foram realizadas em uma única amostra de sangue ou urina em um único ponto do tempo por disciplina.

As culturas de células

Como descrito anteriormente [13], para todos os pacientes e controles saudáveis, PBMC foram isolado a partir de sangue periférico e cultivadas em α-MEM, suplementado com 10% FBS, penicilina a 100 U /ml e estreptomicina 100 ug /m (Cambrex, Bio Ciência, Walkersville, MD), sem adição de factores estimuladores exógenos, tais como m-CSF e RANKL. Após 15 dias, as culturas foram parados, OCs maduros foram identificadas como células multinucleadas contendo três ou mais núcleos e positivo para a expressão TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

As citocinas dosagem

a fim de avaliar factores envolvidos na osteoclastog�ese a quantidade de RANKL total no soro (livre e OPG-ligado), OPG, TNF-alfa, IL-7 e DKK-1 foram determinados pelo kit de ELISA disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram ensaiadas em duplicado e os dados foram expressos como valores médios. As sensibilidades foram: 1,56 a 30000 pg /ml para RANKL total (Apotech Corporation, Epalinges, CH); 0 a 4000 pg /ml para a OPG; 0,12 a 32 pg /ml de TNF-alfa; 0,1 a 16 pg /ml para IL-7 (R D sistema, Abingdon, Reino Unido) e 0,38-50 pmol /L para a DKK-1 (Biomedica, Wien, A)

ARN extracção a partir de formalina. , tecidos fixos embebidos em parafina (FFPE) Tampa

Nós extraídos RNA de FFPE PAC e tecidos saudáveis. Para 19 pacientes, obteve-se amostras de tumor e blocos de tecido saudáveis, foram selecionadas as áreas de tumor nas seções hematoxilina /eosina pelo microscópio e dissecados manualmente. O ARN foi isolado a partir de FFPE bloco de tecido tampa (10 uM secções) utilizando o kit de isolamento de RECOVERALL total Ácido Nucleico (Ambion, Huntingdon, Reino Unido). 1 mg de RNA foi convertido até cDNA de cadeia simples pela High-Capacity cDNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK).

Geração de plasmídeo paciente padrão

iniciadores de PCR para IL -7, DKK-1 e β-actina foram concebidos utilizando o software Primer Express e v2.0 sintetizados pela Applied Biosystems (Warrington, UK). A IL-7 e as sequências de p-actina foram anteriormente publicados [18], enquanto que as sequências de DKK-1 foram: sentido 5′-GGAAGCGCCGAAAACG-3 ‘e anti-sentido 5′-ACACACATATTCCATTTTTGCAGTA-3’. Os produtos de PCR fresco purificadas de 80-pb para a IL-7, 75-BP para a DKK-1 e 78 pb para β-actina foram directamente clonados utilizando TA Cloning Kit duplo promotor (Invitrogen, Carlsbad, CA) como previamente descrito [18] . Os clones positivos foram sequenciados para confirmar a sua identidade. 10 ug do plasmídeo seleccionado para os genes foram digeridos com 8 L de Hind III de enzima de restrição durante a noite a 37 ° C. plasmídeos linearizados foram finalmente purificado com NucleoSpin limpar kit de extração (Macherey-Nagel, Düren, D), ressuspenso com 1 × TE e OD

260 foi determinada. número de cópias foi calculada a partir da concentração de plasmídeo, peso molecular médio dos nucleótidos (660 g /mol) e plasmídeo inserir mais de comprimento.

em tempo real A análise quantitativa de IL-7 e DKK-1 a expressão do gene de

Considerando a maior quantidade de IL-7 de soro e DKK-1 em pacientes com PAC, tanto com e sem metástases ósseas, nós decidimos investigar se estes factores são produzidos por células de tumor. Foi realizada análise quantitativa de IL-7 e DKK-1 expressão por Real-Time PCR quantitativa (RQ-PCR), β-actina foi o controle de limpeza. análise RQ-PCR de IL-7 e DKK-1 foi levada a cabo utilizando o sistema iCycler iQ ™ (Bio Rad, Hercules, CA, EUA). As sondas TaqMan foram desenhados usando software Primer Express e v2.0 sintetizados pela Applied Biosystems (Warrington, UK). IL-7 e β-actina TaqMan sondas específicas foram anteriormente usadas [18], enquanto que a sonda de DKK-1 era (5′-ATGCGTCACGCTATGTGCTGCC-3 ‘). Todas as sondas foram marcadas na extremidade 5 ‘com 6-carboxi fluoresceína (FAM) e na extremidade 3’ com 6-carboxi-tetrametil rodamina (TAMRA). As reacções para a IL-7, DKK-1 e quantificação β-actina foram realizados num volume final de 25 ul com 2 ul de ADNc de amostra, 1 × iQ Supermix (Bio Rad, Hercules, CA, EUA), 0,3 uM de cada iniciador 0,4 pM e das sondas. Os iniciadores de PCR foram as mesmas utilizadas para a IL-7, DKK-1 e clonagem β-actina. As condições de amplificação para a quantização foram: 95 ° C durante 15 minutos, 50 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos, 58 ° C para a IL-7, a 60 ° C para a DKK-1 e β-actina durante 1 minuto

. analisa

estatística

as análises estatísticas foram realizadas pelo programa Statistical Package for the social Sciences (spssx /pc) software 15.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). As variáveis ​​contínuas foram expressas como média e desvio padrão. A fim de comparar os pacientes com e sem metástases ósseas e controles, foi realizada uma análise de uma maneira de variância (ANOVA). correcção de Bonferroni foi levada a cabo para as comparações múltiplas. Para explorar o efeito das variáveis ​​contínuas analisados ​​na formação OC, nós montado um modelo de regressão linear pelo procedimento passo maneira. A expressão gênica de DKK-1 e IL-7 foi comparada entre tumor e tecido saudável por meio do teste t de Student pareado. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para a

p Art .. 0,05

Reconhecimentos

Agradecemos Raffaele Troiano de assistência técnica