Abstract

Fundo

activação aberrante de vias de sinalização leva muitos dos processos biológicos fundamentais que acompanham a iniciação e progressão tumoral. fosforilação inadequado de intermediários nessas vias de sinalização são uma lesão molecular frequentemente observado que acompanha a ativação indesejável ou a repressão de vias pró e anti-oncogênicos. Portanto, espera-se que os métodos que, directa consulta sinalização ativação da via através de ensaios de fosforilação em biópsias de câncer individuais para fornecer importantes insights sobre a “lógica” molecular que distingue o câncer e tecido normal de um lado, e permite estratégias de intervenção personalizadas sobre o outro.

resultados

o primeiro documento, o maior conjunto disponível de sítios de fosforilação de tirosina que são, individualmente, diferencialmente fosforilada no cancro do pulmão, proporcionando assim um conjunto imediata de alvos de drogas. Em seguida, desenvolvemos um romance metodologia computacional para identificar vias cuja actividade fosforilação está fortemente correlacionada com o fenótipo do cancro do pulmão. Por fim, demonstrar a viabilidade de classificar os cânceres de pulmão baseado em assinaturas de fosforilação com múltiplas variáveis.

Conclusões

assinaturas de fosforilação altamente preditivos e biologicamente transparentes de câncer de pulmão a comprovar a existência de um conjunto robusto de mecanismos de fosforilação (capturado pelas assinaturas) presente na maioria dos cancros do pulmão, e que distinguir de forma segura cada cancro do pulmão do normal. Esta abordagem deveria melhorar o nosso entendimento do cancro e ajudar a orientar o seu tratamento, uma vez que as assinaturas de fosforilação de proteínas e destacar vias cuja fosforilação deve ser inibida de modo a evitar a proliferação desregulada

citação:. Wu CJ, Cai T, K Rikova , Merberg D, Kasif S, Steffen M (2009) A assinatura Predictive A fosforilação de câncer pulmonar. PLoS ONE 4 (11): e7994. doi: 10.1371 /journal.pone.0007994

editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de agosto de 2009; Aceite: 16 de outubro de 2009; Publicação: 25 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (R01 HG003367-01A1 a SK), ea American Lung Association (RG-52430-N para MS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. D.M. e K. R. são funcionários da Vertex Pharmaceuticals e Cell Signaling Technology, respectivamente. Nem a empresa forneceu quaisquer fundos diretos para este manuscrito ou teve algum papel na análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Essas relações não alteram a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais, conforme detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Ao nível molecular, cancros são doenças heterogêneas , decorrentes de fatores genéticos, agentes cancerígenos ambientais e aleatória, mutação somática [1]. A fosforilação de proteínas é um regulador chave da actividade da proteína [2], e em particular, a modificação dos resíduos de tirosina modulam processos de sinalização e de controlo críticos [3]. Nos cancros, estado de fosforilação aberrante de resíduos chave (sua presença ou ausência) foi observado e documentado em muitos estudos, que incluem o oncogene original, src [4], e muitos outros [5].

assinaturas baseadas em níveis de proteína estão a começar a ser desenvolvidos [6]. Os níveis de proteína deverão ser fortemente correlacionada com o fenótipo e o diagnóstico à base de proteínas podem ser facilmente implementada na maioria dos centros médicos maiores. Monitorizar o estado funcional das proteínas poderão, portanto, ser extremamente pertinente para aplicações clínicas, e oferecem uma camada adicional de especificidade para aumentar a nossa compreensão científica da progressão da doença de causalidade. Os métodos para a detecção de elevado rendimento de resíduos fosforilados utilizando espectrometria de massa são rapidamente desenvolvidos [7], [8], [9], [10] e aplicada ao estudo de vias de sinalização [11] juntamente com a análise complementar e abordagens de modelagem [ ,,,0],12], [13].

neste trabalho, examinamos os dados de fosforilação da tirosina global de cancros do pulmão e tecido pulmonar normal [14], procurando identificar locais de proteínas diferencialmente fosforilados e vias diferencialmente ativados, e avaliar a sua adequação como classificadores. Relata-se um grande conjunto de locais que são diferencialmente fosforilados em tumores, muitos dos quais podem ser utilizados como alvos para novos medicamentos directos. Apresentamos evidências de que certos caminhos são diferencialmente ativado, com base no seu estado de fosforilação mundial através de uma abordagem computacional romance para executar uma variante da proteína de análise conjunto de enriquecimento de gene.

Em seguida, demonstrar que um número relativamente pequeno de peptídeos fosforilados observado em que os dados [14] pode discriminar entre o tecido normal e tumor com sensibilidade apurada e especificidade. Nós validamos nossa assinatura fosforilação utilizando validação cruzada e testes rigorosos em um conjunto independente inéditos. Finalmente, nós comparamos as afinidades de ligação de vários inibidores da quinase com a actividade de fosforilação de seus alvos em nosso estudo. A integração com os dados farmacêutica leva a hipóteses interessantes sobre a eficácia relativa de tais drogas e sugere agentes de câncer de pulmão inexploradas, mas potencialmente potentes, com destaque para aplicações clínicas potenciais.

Há uma distinção fundamental entre assinaturas de previsão, tais como os aqui desenvolvido, e a observação de que uma proteína é expressa diferencialmente (ou fosforilado), com significância estatística. Em princípio, a proteína pode ser diferencialmente fosforilada, mas ser de pouca utilidade preditiva para a classificação geral de uma doença ou para a elaboração de uma estratégia de tratamento personalizado. Diferencial de fosforilação de uma proteína é um resumo agregado população. Isso significa que, em média, o nível de fosforilação de uma proteína é maior ou menor do que um cancro no tecido normal. No entanto, para um determinado paciente a probabilidade de erro na classificação da biópsia como um cancro poderia ser tão elevada como 0,49 (se as distribuições das medições para o cancro e tecidos normais se sobrepõem). Nenhuma conta da heterogeneidade da doença é considerado, e os níveis elevados pode resultar unicamente a partir de um subconjunto dos casos de doença. Por outro lado, uma assinatura com alto valor preditivo sugere que os fosfo-sites incluídos na assinatura são parte de um conjunto de vias que são universalmente operatório na doença. Eles são, portanto, potencialmente reflectora de um mecanismo patogénico universal para essa doença, e pode levar à descoberta de uma “lógica de fosforilação”, que capta o tecido específico, ou mesmo uma, fenótipo neoplásico geral. cancerosas sub-tipos heterogêneos exigirá necessariamente assinaturas mais complexos, exigindo um grande conjunto de mecanismos de previsão que podem fornecer-alta cobertura da actividade diferencial de vias chave no câncer específico. Finalmente, se as assinaturas preditivos consistem de um pequeno conjunto de proteínas que implicam vias específicas (como sugere o nosso trabalho), este conjunto de vias torna-se um alvo principal para uma ampla estratégia de drogas multi-alvo combinatória.

Resultados

múltiplos locais de tirosina são diferencialmente fosforilada em tecido de cancro do pulmão

em primeiro lugar, analisou sites de proteínas individuais para determinar aqueles que são diferencialmente fosforilada entre o 94 cancro do pulmão de não pequenas células 48 normal e (NSCLC) amostras de tumor. Nossos resultados revelam 129 sites de aminoácidos únicas que foram significativamente diferencialmente fosforilada entre as amostras normais e tumorais (taxa de detecção falsa, FDR

q

valor 0,05). Destes, 77 dos sítios eram mais fosforilada no tecido canceroso e 52 sítios eram mais fosforilada em tecido normal. A Tabela 1 apresenta os mais graduados de 20 sites de proteínas com o menor ranksum

valores p

, com todos os sites listados na Tabela S1.

Além dos principais genes listados na tabela muitos outros marcadores de cancro proeminentes foram detectados na nossa análise. Em particular, o EGFR é um receptor tirosina-quinase implicada no cancro do pulmão e está envolvido em vários processos biológicos, incluindo a apoptose, a adesão celular e o crescimento [15], [16], [17]. Mutações de EGFR são vistos em um conjunto de pacientes com NSCLC com boa resposta ao inibidor EGFR [18], [19]. Os estados de fosforilação de duas tirosinas na cauda citoplasmática de EGFR foram estatisticamente diferentes, exibindo níveis mais elevados de fosforilação no cancro. Os resíduos de Y1172 e Y1197, são conhecidas por regular a actividade proliferativa [20]. Curiosamente, Y1172 é hiper-fosforilada (Tumor /Normal fosforilação espectral relação de contagem 1), apenas em adenocarcinoma (AD) amostras. Y1197 é hiper-fosforilada, tanto de carcinoma de células escamosas subtipos (SCC) AD e, mas num grau significativamente maior no AD.

A análise específica do local revelou, surpreendentemente, que o aminoácido mais consistentemente diferencialmente fosforilada tecido normal e tumoral foi Y34 1B de álcool desidrogenase, ADH1B (menos fosforilada em tumores). Esta proteína participa em vários processos relacionados, tais como glicólise, a gluconeogénese, a e o metabolismo do ácido gordo. Sua expressão é regulada para cima no estádio de desenvolvimento posterior pulmão de rato, mas regulada em NSCLC humana [21]. O papel específico do Y34 é actualmente desconhecida, mas a baixa contagem de fosforilação pode refletir tanto a atividade enzimática comprometida ou a abundância da proteína diminuiu em tumores. Com o seu papel no metabolismo do álcool, este pode ser uma consequência do efeito Warburg pelo qual os tumores empregam glicólise aeróbica para satisfazer as suas necessidades metabólicas [22]. ADH1B foi recentemente identificada como um modificador de risco para o cancro aerodigestivo escamosas, com um mecanismo postulado do metabolismo do etanol como sendo alterada contributivo [23]. Outro estudo observou diminuição dos níveis de proteína de ADH1B em tumores da mama [24], postulando a incapacidade para oxidar o grupo hidroxilo dos blocos de retinol a produção de ácido retinóico, uma molécula que ajuda a manter as células epiteliais no seu estado diferenciado.

houve muitas outras proteínas diferencialmente fosforilada. Aqueles hiperfosforilada em tumores incluem várias tirosina-quinases receptoras (listados na Tabela S2), e outras proteínas de sinalização, tais como p38 delta, a proteína quinase C delta, e membros da via de sinalização de PI3K, incluindo beta p85. Por outro lado, as proteínas hipofosforilado (Tumor /Normal fosforilação espectral relação de contagem de 1) em tumores incluem os factores de transcrição de STAT1 e STAT5, a proteína tirosina fosfatase PTPN11, o G-proteína receptor acoplado GPRC5A, e as quinases MAPK1, MAPK3, e TNK2.

Classificação altamente precisas de tecido do tumor através de Validação Cruzada

a fim de avaliar a utilidade potencial da actividade da proteína de monitoramento através de dados de fosforilação de tirosina, desenvolvemos classificadores de prever o câncer /fenótipos normais de amostras individuais . Em particular, nós examinamos a nossa capacidade de distinguir tecido normal de cancros com base no pequeno conjunto de fosfotirosinas. A Tabela 2 resume os desempenhos dos cinco modelos preditivos que examinamos. Dois dos modelos foram baseados em locais seleccionadas estatisticamente que geram potência máxima discriminar entre o cancro e o tecido normal. Três modelos foram baseados em seleção motivação biológica de locais de caminhos-chave associadas com câncer de pulmão. Um modelo de regressão regularizado (com o objetivo de reduzir a probabilidade de overfitting os dados) com base em todos os sites de proteína significativamente diferencialmente fosforilada (FDR

q

valor 0,05) previu com sucesso as classes de amostra com uma precisão média classificação de 0,925 e uma área-sob-a-curva, AUC em 0,974 em uma análise rigorosa validação cruzada bootstrap que separa cuidadosamente formação de subconjuntos aleatórios de dados e os testes sobre o subconjunto restante. A selecção de sítios mais informativos utilizado para construir o modelo também foi feito em dados de treino. O número médio de sítios fosfotirosina utilizados em todos os testes de bootstrap foi 88.

Nós também investigou se os modelos biologicamente informadas com base em módulos de genes relevantes pode oferecer uma precisão igual. Especificamente, os modelos de regressão com base em genes no MSigDB “proliferação” proteína-conjunto (vulgarmente referidos como “conjuntos de genes”, na literatura de microarray) [25], e duas proteína-conjuntos diferentes que representam o caminho de EGFR, também foram exibidas para discriminar entre as amostras normais e tumorais com alta precisão. Para a via EGFR, foram consideradas duas representações: uma via de “core” com 11 proteínas (BioCarta) e uma via “expandida” com 47 proteínas (HPRD). As proteínas são listados na Tabela S3. Os nossos resultados sugerem que, embora as proteínas do núcleo do EGFR com uma precisão razoável na distinção do cancro contra o tecido normal (0,83 AUC), o “expandido” via EGFR, com proteínas adicionais, realiza significativamente melhor (0,96 AUC). As proteínas mais informativos na via expandido não incluídos na rede núcleo EGFR são CAV1, Gab1, PXN, e PTPN11. Por fim, um modelo com base nos 20 melhores locais do espectáculo tem uma precisão média de classificação de 0,88 e AUC em 0,94. Este classificador suporta a viabilidade da construção de um chip relativamente barato utilizando muito poucos locais como marcadores para permitir a detecção de células de cancro com base em ensaios de fosforilação.

Estes resultados, tomados em conjunto, indicam que o estado de fosforilação de proteínas pode ser utilizada para desenvolver modelos que prevêem um fenótipo maligno de amostras clínicas com uma precisão muito elevada, semelhante ao desempenho relatados de expressão de mRNA (ver Nota S1) [26].

Classificação

altamente precisas de tecido de câncer através de Predição em uma Independent validação dataset com 16 amostras de NSCLC

Foram aplicados dois modelos de regressão treinados das 142 amostras relativamente a um conjunto de dados independente que consiste em 16 amostras de NSCLC. Os coeficientes utilizados para integrar o nível de fosforilação de proteínas nos dois modelos são mostrados na Tabela complementar S4 e S5. Aos 90% de sensibilidade para os pacientes de cancro nos dados de treino, o modelo estatístico usando os 20 locais de fosforilação mais informativos tem uma sensibilidade de 87,5% nas amostras de validação. Repetimos a análise usando o “Genes de proliferação” categoria a partir da base de dados C2 de MSigDB. A sensibilidade de validação correspondente é de 93,8%, o que é ligeiramente melhor do que a sensibilidade obtida pelo modelo estatístico. Os sites mais informativos utilizados no classificador módulo de proliferação são derivados de EGFR e SYK (Spleen de tirosina-quinase).

Porque não tivemos novas amostras normais independentes para avaliar a especificidade dos classificadores, adotamos uma variante de um abordagem reamostragem para avaliar a precisão global sobre o conjunto independente (descrito na secção de métodos). Relatamos a média sensibilidade, especificidade, precisão e AUC na Tabela S6. Com sete amostras deixado de fora a partir de dados de treinamento, os novos classificadores mostrou ligeiramente reduzida sensibilidade sobre as amostras 16 com câncer de validação. O módulo proliferação classificador apresentou melhor sensibilidade, mas menor especificidade do que o baseado em marcadores estatisticamente mais informativos. As estimativas de precisão para estes dois classificadores variou de 84 a 88%, ea AUC estimado é de 92-93%.

fosforilação diferencial da Associated Pathways cancro

Para obter insights sobre processos biológicos cuja actividade podem ser moduladas em tumores de pulmão, testámos 639 curadoria proteína-conjuntos do banco de dados da via canonical MSigDB para determinar se os níveis de fosforilação global de estações de tirosina em proteínas de cada uma das vias são significativamente diferentes entre as amostras normais e tumorais. Nós não fomos capazes de usar tradicional Gene Set Enriquecimento Analysis [25] para detectar estas vias desreguladas devido à dispersão extrema dos dados. Em vez disso, associado com uma representação metaprotein cada percurso calculado e se o nível de fosforilação da presente metaprotein está correlacionado com alterações no fenótipo. Esta técnica é uma nova variante da técnica METAGENE implantado para análise da expressão do gene.

No total, 181 proteínas observadas neste conjunto de dados fosse um membro de pelo menos um dos conjuntos 639 proteína de. A Tabela 3 lista as top 15 proteicos-sets que exibem níveis de fosforilação diferenciais. A proteína-set que exibe a maior mudança em seu nível global de fosforilação na comparação normal e tecido NSCLC é o caminho KEGG “HSA05211 carcinoma de células renais.” Das 181 proteínas aqui considerados, 14 deles pertencem a esta proteína-set, e 9 alta correlação exibida com os níveis de fosforilação metaprotein. Estas 14 proteínas são mostradas na Tabela S7 complementar, em que um coeficiente positivo indica maior fosforilação no tumor. Duas outras vias que são especialmente relevantes para o câncer de pulmão que têm significativamente diferentes níveis de fosforilação geral são “HSA05223 não pequenas células CÂNCER” e “METPATHWAY BioCarta.” Cinco caminhos adicionais são explicitamente relacionado ao câncer: “HSA05220 Leucemia Mielóide Crônica”, “HSA05215 câncer de próstata, “” HSA05218 MELANOMA “,” HSA05213 ENDOMETRIAL câncer “e” HSA05210 cancro colorectal. “Dois caminhos são genérico para vias de sinalização”, HSA04070 FOSFATIDILINOSITOL sINALIZAÇÃO “e” HSA04010 MAPK via de sinalização “, eo geneset com a maioria dos membros era o “INTEGRINA mediada por células ADESÃO GenMAPP”, com 32 observada e 28 proteínas correlacionadas.

por causa de seu papel crucial no cancro do pulmão, examinamos a via EGFR em maior detalhe. Na figura 1, que mapear todos os eventos de fosforilação de tirosina observados a proteínas constituintes, com um modelo construído a partir de bases de dados e KEGG HPRD /NetPath. Como esperado, o EGFR e muitas proteínas a jusante na via são diferencialmente fosforilada nas amostras de NSCLC. No total, 10 locais de tirosina são mais fosforilada em tumores (rosa), mais 7 fosforilado em tecido normal (verde) e 12 proteínas foram fosforilados para um grau semelhante em ambos os tipos de amostras. Embora nenhum padrão claro é facilmente visível, talvez seja surpreendente observar que as tirosinas Y186 e Y204 sobre ERK1 e ERK2, respectivamente, são menos fosforilada em tumores de pulmão. Tem sido observado muitas vezes que o excesso de fosforilação de ERK1 /2 pode resultar na paragem do ciclo celular, revisto em [27], e, assim, os níveis mais baixos observados em tumores poderia resultar num aumento de células-ciclismo, no entanto, isto requer trabalho adicional.

Pink indica maior fosforilação em amostras de tumor, enquanto a verde indica maior fosforilação em amostras de tecidos normais. foram observados nódulos amarelos para ser fosforilada, no entanto não se alterou significativamente em dois tipos. nodos cinza não foram observados na análise. Uma seta vermelha (ou borda) relata uma quinase para o seu alvo, bordas verdes indicam uma fosfatase e seu alvo. bordas azuis indicam ativação, que pode não ser direta. Finalmente, uma forma de diamante na extremidade de uma aresta indica fosforilação, enquanto que um círculo indica uma inibição de fosforilação. As setas indicam a ativação, o que pode ser indireta.

Análise fosforilação de diferentes subtipos de tumor

A distinção histopatológica da AD e SCC pode ser um desafio [28], mas com diferentes opções de tratamento disponíveis [29], um passo importante. Foram analisadas as diferenças de nível de fosforilação entre tecidos AD e SCC nos níveis de sites individuais, caminhos e proteína de sets.

Para nossa surpresa, não há sites individuais que são estatisticamente diferencialmente fosforilada nos dois subtipos de tumor na conjunto de dados atual. Da mesma forma, empregando a análise metaprotein descrito acima, observamos nenhuma significativamente vias diferencialmente fosforilada ou proteína-sets (Recurso S8 tabela). Os modelos de genes anteriormente discutido para classificação de subtipo de tumor foram avaliadas, com os resultados resumidos na Tabela S9 suplementar. O único classificador que executa razoavelmente bem, com AUC = 0,78, é baseado em características EGFR selecionados manualmente com ênfase em locais observados frequentemente (sem consideração de subtipo de câncer). Partindo do princípio de que todas as amostras foram diagnosticados correctamente, estes resultados sugerem que as diferenças de medidas de fosforilação entre AD e CCS são pequenos e difíceis de detectar com métodos estatísticos puros de aprendizagem ou da máquina. Esperamos que uma análise mais quantitativa usando áreas dos picos relativos, em oposição a contagem espectrais, provavelmente um melhor desempenho para esta tarefa.

Comparação de Classificadores Baseado em mRNA Expression dados com fosfotirosina dados

Para comparação, incluímos no suplemento um relatório sobre as precisões de classificadores baseados na expressão de mRNA. Com base nos dados actuais, parece que o estado de fosforilação e a expressão de ARNm são aproximadamente igualmente informativos no que respeita à classificação das amostras como tumores ou normais. Para distinguir subtipos de tumor, fosfotirosinas funcionar razoavelmente bem (AUC ~0.78), mas classificadores construídos com os níveis de mRNA transcrito desempenho significativamente melhor (AUC ~0.98). Nenhum tipo de dados é bem sucedido em distinguir fase inicial (fase I e II) a partir de tumores fase tardia (estágio III e IV). No entanto, esta “falha” pode refletir a biologia semelhantes dos tumores primários nos dois casos, que não podem mudar significativamente como metástases colonizar locais distantes. Curiosamente, não observamos uma correlação significativa entre esses níveis de mRNA que são diferencialmente expressos, e fosforilação da tirosina diferencial níveis do produto de proteína relacionada, destacando a natureza complementar das informações fornecidas por medidas baseadas em atividades.

Discussão

os resultados apresentados neste trabalho abre a porta para uma série de direções futuras, tanto na pesquisa básica e translacional. Compreender o papel preciso de medição de fosforilação na regulação de vias de sinalização no cancro permanece um desafio importante, e nós focado principalmente sobre o papel do EGFR e proliferação celular percursos. Nós identificamos um conjunto de resíduos de tirosina que são diferencialmente fosforilados no tecido pulmonar canceroso e normal. Mais do que os níveis de transcritos de mRNA ou a expressão de proteínas, o estado de fosforilação de resíduos seleccione estão relacionados com a actividade funcional dos produtos de genes associados. Isto é potencialmente importante particularmente em cancros como a presença ou ausência de várias proteínas receptoras podem não reflectir a actividade de intermediários de sinalização a jusante. Este cenário pode ser importante em, pelo menos, dois casos no que se refere a vias de sinalização, uma em que um receptor está presente, mas não há nenhum ligando activador (ou uma abundância de um ligando não-funcionamento) para iniciar eventos de sinalização a jusante, ou se o receptor está presente, mas uma mutação e inativos e, portanto, incapaz de transmitir o sinal de ligação.

Como em qualquer pesquisa sistemática escala do genoma, a observação de resultados inesperados desafia a capacidade de derivar hipóteses explicativas. Tal é o caso com a observação de que ADH1B é a proteína mais diferencialmente fosforilado, com quantidades reduzidas observadas em tumores. Implicado em tumores aerodigestivos escamosas [23], onde um papel de destaque no metabolismo do etanol ingerido é atraente, pode ser o caso de que em tumores de pulmão, hipóxia associada ao tumor pode estar alterando o metabolismo de carboidratos celular.

A Central resultado das análises aqui apresentados é a demonstração de que as assinaturas baseada na fosforilação de resíduos de tirosina diferencial apresentar um desempenho robusto para classificar o cancro a partir de tecido normal. Isto é verdade, independentemente se o assinatura baseia-se em um grande número de locais proteicos, um número menor, ou resíduos específicos do pathway. Este resultado foi confirmado tanto em estudo de validação cruzada rigorosa, bem como sobre um conjunto independente. A precisão da classificação de cancro contra o tecido normal é essencialmente equivalentes aos resultados obtidos por experimentos de microarray, mesmo quando realizado em tecidos dissecados-granel.

As tirosina-cinases que estão hiperfosforiladas na tumores pulmonares são hipoteticamente ser inapropriadamente activadas, e pode, portanto, ser considerados como potenciais alvos terapêuticos para inibição. Neste estudo, observa-se até 19 tirosina-quinases que têm estatisticamente diferentes entre os níveis de fosforilação do cancro do pulmão e o tecido normal, e quase todos estes estão hiperfosforiladas em tumores de pulmão (Tabela Suplementar S2).

A activação de múltiplos tirosina-quinases de um dado cancro, foi observado anteriormente em glioblastoma multiforme [30]. Nesse caso, as combinações de inibidores da tirosina cinase (TKI) eram necessárias para reduzir substancialmente a viabilidade celular. Em vez de combinações de fármacos, uma alternativa é empregar um inibidor de multi-cinase, tais como imatinib, sorafenib e sunitinib, que são, cada um individualmente capazes de inibir várias tirosina-cinases [31]. Isso nos levou a explorar a possível existência de um inibidor da multi-quinase que tinha como alvo uma grande fração dessas quinases que observamos a ser hiperfosforilada no câncer de pulmão. Um conjunto de dados abrangente, acessível ao público de ligação de dados TKI [32] ensaiados 38 TKI contra 317 quinases. Nós integramos a ligação de dados TKI com a nossa análise de fosforilação diferencial (Tabela Complementar S2). Dos kinsases tirosina para o qual a ligação de dados foi relatado, e nós achamos que, quase todos eles foram vinculados pela dasatinib TKI com alta afinidade (de Kd 2 nM). Isto sugeriria que dasatinib poderia ser uma terapia útil para a seleção de pacientes com câncer de pulmão. Mais geralmente, o nosso estudo ilustra a utilidade dos ensaios de fosforilação da tirosina integrando globais [14] com os dados de ligação de drogas a chegar rapidamente a potenciais opções terapêuticas, e a possibilidade de prever uma resposta aos inibidores da cinase particulares.

Análise do percurso níveis totais-fosforilação espec�icos demonstra a especificidade da abordagem global, como 7 das 15 principais proteínas conjuntos identificados são explicitamente definidas como cancerígenas proteína-sets. vias de sinalização foi responsável por 4 dos restantes top 15 proteicos-sets, incluindo os exemplos importantes de fosfatidilinositol e sinalização MAPK vias. Vias a jusante dos receptores EGFR e MET, com papéis importantes na biologia do cancro do pulmão, foram igualmente implicadas.

Embora o desempenho de assinaturas fosfotirosina foi modesto para a discriminação de AD e SCC, com o classificador de alto desempenho tendo um AUC de 0,78, os níveis de mRNA transcrito classificar estes subtipos com maior precisão, e nenhum método distingue início de estágios avançados de câncer de pulmão. Esta última observação pode reflectir uma limitação do método, ou pode reflectir com precisão a biologia dos cancros do pulmão, nos não é necessário que, fundamentalmente, os novos processos para a progressão, mas apenas que houve tempo suficiente para os genes desregulados e vias para corroer mais em torno tecidos e metástases ter ocorrido.

desafios futuros para a caracterização dos tumores com base em assinaturas de fosforilação incluem a escassez relativa de dados (especialmente entre múltiplas amostras), a convolução dos níveis de proteína com níveis de fosforilação, eo semi- natureza quantitativa da contagem espectral para medir a abundância de péptidos. No entanto, existem melhorias diretas para resolver cada uma dessas limitações. É provável que a melhoria mais significativa que resultaria da utilização de marcadores de isótopos estáveis. Estas medidas permitirão comparações diretas entre as várias amostras, e aumentar a precisão quantitativa. O fato de que tal desempenho excelente para a classificação normal versus tecido tumoral já pode ser alcançada torna mais melhorias altamente desejável. Outra promessa é o potencial para o desenvolvimento de assinaturas para orientar tratamentos e prever os resultados dos pacientes. inibidores de quinases são uma nova classe interessante de tratamentos para o cancro [33], [34], no entanto, estudos recentes têm enfatizado que os alvos individuais de inibição pode não ser suficiente para obter uma resposta terapêutica [30]. Combinações de inibidores de cinase, com cada potencialmente ligação a múltiplos alvos, podem ser necessárias para inibir os sinais de crescimento e proliferação indesejáveis ​​activa nas neoplasias [35]. As proteínas fosforiladas analisadas aqui representam alvos de quinases que provavelmente deve ser inibidos para atingir a eficácia. Computacional [36] ou experimentais [37] métodos para inferir as quinases ativos potencialmente ajudar na identificação dos alvos terapêuticos relevantes em casos individuais.

Conclusões

Uma vez que a activação inadequado de vias de sinalização representa os processos biológicos fundamentais em câncer, foram analisados ​​dados de fosforilação de câncer de pulmão e tecido pulmonar normal para identificar as diferenças. Foram identificadas várias centenas de sites de diferencialmente fosforilada no câncer de pulmão, e desenvolveu romance metodologia computacional para identificar vias cuja fosforilação é desregulado. Por fim, demonstramos a capacidade de classificar os cânceres de pulmão com alta precisão baseado em assinaturas de fosforilação com múltiplas variáveis. Os sítios de fosforilação identificados fornecer um conjunto imediata de novos alvos de drogas, e uma análise do complemento de locais fornece uma lógica para a seleção entre potenciais tratamentos que utilizam inibidores da quinase multi-alvo ou combinações de inibidores selectivos.

Materiais e métodos

Fontes de dados

os procedimentos dos experimentos e a aquisição dos dados de tirosina-fosforilação foram descritos na publicação anterior [14]. O primeiro conjunto de dados contém 151 NSCLC e 48 amostras de pulmão normais. Das amostras tumorais 151, 42 adenocarcinoma (AD) e 52 amostras de amostras de carcinoma de células escamosas (SCC) com informações clínicas disponíveis foram utilizados na análise de classificação. A maior parte dos sítios de fosforilação 4551 observados foram identificados em um relativamente pequeno número de amostras. Para a nossa análise, incluídos aqueles locais que foram fosforilados em, pelo menos, 10% das amostras em estudo. Um segundo conjunto de dados composto por 16 amostras de NSCLC que não foram originalmente incluídos no [14] (e, portanto, são inéditos) foram usados ​​para fornecer uma validação independente da assinatura preditiva.

Análise Estatística para a fosforilação diferencial de Sites Proteína