Abstract

Fundo

Diabetes mellitus está ligado ao câncer de pâncreas. Nossa hipótese um papel para as células estreladas pancreáticas (PSC) na hiperglicemia deterioração induzida de câncer no pâncreas e, portanto, estudou duas linhas de células humanas (RLT-PSC, T3M4) no ambiente hiperglicêmico.

Metodologia /Principais Achados

O efeito da hiperglicemia crônica (CHG) em PSCs foi estudada usando matriz expressão de mRNA com a validação de PCR em tempo real e análise de caminho de bioinformática e estudos de proteínas de confirmação. A formação de fibras de tensão (IC: αSMA) indicou que PSCs tendem a transdiferenciam a um estado de miofibroblastos-like após a exposição ao CHG. A fosforilação da p38 e ERK1 /2 foi aumentada com uma regulação positiva consecutiva de Cdc25, SP1, CFOs e p21, e com regulação negativa da PPAR após PSCs foram expostos a hiperglicemia crônica. níveis de CXCL12 aumentou significativamente no sobrenadante após a exposição PSC CHG independentemente do tratamento TGF-β1 (3,09 vezes com uma dobra em 2,73 sem TGF-β1, p 0,05). O upregualtion do factor de transcrio SP1 em unidades após a exposição CHG pode estar implicada no aumento da CXCL12 e IGFBP2 produção. Em células cancerosas, hiperglicemia induzida por um aumento da expressão de CXCR4, um receptor de CXCL12 que também foi induzida por meio condicionado de PSC. A interacção receptor-ligando aumentou a fosforilação de ERK1 /2 e p38 resulta na activação da via da MAP-cinase, um dos mais potentes estímulos para a proliferação celular. Certamente, o meio condicionado de PSC aumento da proliferação de células de cancro do pâncreas e este efeito pode ser parcialmente inibida por um inibidor de CXCR4. Como o meio condicionado PSC (concentração normal de glicose) aumentou a fosforilação ERK1 /2 e p38, concluímos que PSCs produzir outro fator (s) que a influência (s) comportamento câncer pancreático.

Conclusões

a hiperglicemia induz aumento da produção de CXCL12 pelas PSCs, e seu receptor, o CXCR4 em células cancerosas. A interacção ligando-receptor activa a sinalização MAP cinase que causa a proliferação de células de cancro aumentada e migração

citação:. Beije K, K Baghy, Spisak S, S Szanyi, Tulassay Z, Zalatnai A, et al. (2015) Chronic a hiperglicemia induz Trans-diferenciação de células humanas pâncreas estreladas e melhora a comunicação Molecular maligno com células do cancro do pâncreas humano. PLoS ONE 10 (5): e0128059. doi: 10.1371 /journal.pone.0128059

Editor do Academic: Seema Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, United States |

Recebido: 28 Janeiro, 2015; Aceito: 23 de abril de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Beijo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Todos os resultados de microarray são enviados para Gene Expression Omnibus (GEO) repositório de dados (número de acesso: GSE59953).

Financiamento: Este estudo foi apoiado em parte pela concessão OTKA 100.904. O equilíbrio dos apoios vieram de: Escola de Ph.D. Estudos da Universidade Semmelweis, Hungria. Os autores não teria sido capaz de realizar qualquer um desses experimentos sem os materiais dotados da seguinte forma: JML, RJ transferiu a linha de células imortalizada estreladas pancreático humano (RLT-PSC) para a Universidade Semmelweis abrigo de um acordo MTA. A linha celular de adenocarcinoma T3M4 humano pancreático ductal foi um presente amável do Centro Europeu de pâncreas em Heidelberg. Os reagentes utilizados na matriz de expressão de ARNm foram tipo presentes por GF, como AMD3100 e os reagentes que foram utilizados para avaliar a CXCL12, IGFBP2, CXCR4, CXCR7 em níveis de ARNm e proteína. Os financiadores em OTKA teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. GF leu a política da revista e os autores deste manuscrito ter a seguinte interesses concorrentes: JML, RJ, GF ter um P1300509 pedido de patente pendente (PCT /HU2014 /00007) que é relativa ao pertinente material a este manuscrito é. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. subvenções OTKA não participaram no financiamento dos experimentos levaram à P1300509 aplicação (PCT /HU2014 /00007), nem contribuiu de qualquer outra forma para isso.

Introdução

Os estudos epidemiológicos e sua meta -analyses estabeleceu uma clara evidência para a associação entre diabetes mellitus (DM) e câncer pancreático (PAC) e concluiu que o DM não é apenas uma manifestação precoce, mas também é um fator etiológico da PAC. [1] Carstensen e colegas de trabalho com base em os dados de mais de 4 milhões de pessoas por ano confirmou a associação entre DM tipo 1 (DM1) e PAC e concluiu que um dos principais efeitos cancerígenos de insulina exógena é improvável em DM1. [2]. No mais prevalente DM tipo 2 (DM2) a associação com PAC é também evidente no modo de exibição de uma meta-análise de 36 estudos [3].

A coorte prospectivo relatou que elevada glicemia de jejum (FPG) níveis são fatores de risco para a APA [4]. Em adição, uma relação dose-resposta meta-análise de dados obtidos a partir de 2408 pacientes Pac confirmou que cada aumento mmol /L em FPG já acima de 4,1 mmol /L está associada a um aumento de 25% na taxa de cancro pancreático [5]. Em um modelo de risco para identificar indivíduos com risco aumentado para câncer de pâncreas, diabetes 3 anos representava um grau semelhante de risco do que, história familiar de câncer de pâncreas na população em geral [6]. O câncer de pâncreas, dos quais 90% dos casos são adenocarcinoma ductal, significa um miserável prognóstico com um 5 anos de sobrevivência de 7% [7]. Isso significa que um excepcionalmente elevada necessidade de uma melhor compreensão da sua patologia molecular.

Apesar de o número de apoiar estudos epidemiológicos os mecanismos celulares e moleculares para a evolução desta associação entre DM e PAC é menos clara. Por conseguinte a hipótese de que a hiperglicemia crónica, para além do efeito directo sobre as células cancerígenas podem também alteram desfavoravelmente a comunicação entre as células cancerosas e o microambiente, especialmente com as células estreladas pancreáticas que são os principais elementos do estroma celular no PAC. As consequências da activação de fibroblastos a um processo conduzido inicialmente por factor de crescimento transformante beta (TGF-β) evoluiu para melhorar a cicatrização de feridas, são desfavoráveis ​​na doença do cancro [8]. Os dados experimentais sugerem que a imunidade anti-tumor foi suprimido por células do estroma expressando a proteína de activação de fibroblastos (FAP) e um agente de direccionamento de células que expressam-FAP aumentada a imunidade anti-tumoral [9]. No entanto, este conceito tem sido desafiado recentemente com base em observações com αSMA + miofibroblastos excluído camundongos transgênicos no modelo de cancro pancreático sugerindo uma regulação ainda mais complexa [10].

células estreladas pancreático (PSCs) sobre a activação trans-diferenciação de miofibroblastos -como células que são a principal fonte da deposição de proteína da matriz extracelular (ECM) durante a fibrose tecidual [11-13]. adenocarcinoma ductal do pâncreas é caracterizada por um estroma desmoplástico abundantes como resultado de activação PSC [14].

Há uma intensa comunicação entre as unidades associadas a tumores e células cancerosas. PSCs activados libertar uma variedade de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas que promovem o comportamento maligno das células tumorais pancreáticas, que joga um papel essencial no desenvolvimento e crescimento do cancro [15-18] setllate células activadas também proteger o tumor pancreático de radiação e gemcitabine- induziu efeitos apoptóticos [19]. PSCs em co-cultura indirecta reforçada fenótipos semelhantes a células-tronco de células cancerosas e induziu a expressão de genes relacionados com células-tronco cancerosas, sugerindo um papel no nicho de células-tronco do câncer [20].

Foi avaliada a resposta do PSCs humanos expostos a hiperglicemia crônica (CHG, 21 dias), através de uma abordagem multi-passo para identificar as vias moleculares que podem regular a ativação PSC. células PAC também foram avaliadas directamente em cima da exposição à hiperglicemia ou meio de cultura PSC condicionado (CCM).

Materiais e Métodos

linhas celulares, culturas de células

Em todos os experimentos, usou a RTL-PSC e linhas de células humanas T3M4. RLT-CPS é uma linha de células estreladas pancreático humano que foi anteriormente imortalizadas por transfecção com o antigénio T grande de SV40 e da telomerase humana (hTERT) e analisadas para marcadores de células estreladas [13]. Além disso, a linha celular de adenocarcinoma ductal pancreático humano T3M4 foi usada que foi um presente do tipo a partir do centro Pâncreas Europeia em Heidelberg [21].

PSC células foram cultivadas em DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, Sigma, St. Louis, MO) com 1000 mg /L (5,5 mmol /L) a concentração de glucose, células T3M4 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma), ambos suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Sigma) e 1% de penicilina /estreptomicina ( Sigma). As células foram cultivadas a 37 ° C, atmosfera contendo 5% de CO2 e subcultivadas a 85-90% de confluência utilizando uma solução de tripsina-EDTA (Sigma).

Os factores de crescimento e outros compostos

factor de crescimento transformante- β1 (TGF-β1, Sigma) foi adicionado em 5 ng concentração final /ml para as células. hidrato de AMD3100 octahydrochloride (2 ug /mL, Sigma) foi usada para inibir o receptor CXCR4. Durante a avaliação da migração de células de células foram tratadas com mitomicina C (10 ug /ml, Sigma, Parte No .: M4287) para prevenir a proliferação de células. BSA (albumina de soro bovino, Sigma, Parte No .: A3294) foi usada para inespecífica bloqueio em vários métodos.

Esquema de tratamento de PSC e células T3M4

unidades foram expostas a CHG e TGF- β1 de acordo com o protocolo seguinte:

“controle” células condições foram cultivadas como descrito acima. No caso de células de tratamento de “alta” de glicose foram cultivadas em meio de cultura contendo 15,3 mmol /L de glucose, durante 3 semanas (21 dias), como experiências preliminares mostraram a melhor resposta de produção de proteínas de ECM neste espaço de tempo. Subsequentemente, as células foram privadas durante 24 horas em meio FBS-livre e, posteriormente, para 48 horas em meio FBS-livre com ou sem TGF-p1 para comparar seu efeito para Var. Dois paralelos biológicos foram usadas para cada regime.

Células cultivadas em frascos T75 foram recolhidos e utilizados para análise de ARNm e de proteína, o meio de cultura de células foi recolhido para análise de proteínas. Para imunocitoquímica, as células foram cultivadas sobre lamelas em placas de 6 cavidades. As experiências foram repetidas três vezes.

T3M4 células foram cultivadas até 80% de confluência em balões T75, então jejuadas durante a noite em FBS a-meio RPMI livre. Subsequentemente, o meio de cultura, contendo PSC-CCM e RPMI com FBS a 10%, numa proporção de 50% -50% foi adicionado às células durante 48 horas. Como controlos em DMEM T3M4 experiências de FBS-free (com 5,5 e 15,3 mM de concentração de glicose) foi adicionada em paralelo ao completo RPMI-SBF. Após 48 horas de tratamento, as células T3M4 e os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidas para estudos de proteína.

Preparação de meio de cultura de células condicionado (CCM)

preparados a partir de RTL CCM-unidades através da sua cultura em frascos T75 com 12 ml de DMEM contendo 10% de FBS durante 3 dias. DMEM com 1000 mg /L (5,5 mmol /L) ou com 2750 mg /L (15,3 mml /L) de glucose foi usado. CCM foi recolhido a partir de cada balão, estéril filtrada, e armazenada a -20 ° C até à sua utilização.

matriz de expressão de ARNm de

O ARN total foi isolado (Média ARN Número de Integridade [RIN] = 9,2 ± SD 0,4) utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). Dois duplicados biológicos foram reunidas dentro de cada grupo e dois duplicados técnicas foram hibridados de cada grupo de amostras reunidas para a expressão de matriz Human Gene PrimeView GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). RNA amplificado biotinilado (Arna) sondas foram sintetizados a partir de 200 ng RNA total usando o ‘Kit 3 IVT Express (Affymetrix). Arnas marcadas foram, em seguida, purificada e fragmentado para a hibridação subsequente. sinais fluorescentes foram digitalizados por GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Os dados foram extraídos dos arquivos CEL usando superfície “R” com pacotes de software Bioconductor. normalização robusta Multichip Média (RMA) foi realizada e os dados foram convertidos para notação Log2 para fazer a seleção de recursos por modelo linear e SAM usando “limma” e “samtools” pacotes. Todos os resultados de microarray são enviados para Gene Expression Omnibus (GEO) repositório de dados (número de acesso: GSE59953).

Os valores de expressão gênica em cada grupo de tratamento foram classificados em cima de sua expressão diferencial em comparação com as amostras isoladas de PSCs ‘Control’ . Dois conjuntos de genes, foram selecionados os 100 e 300 para proporcionar a melhor separação. (P-value: 10-4, Statistica versão de software 8, T-test).

Bioinformatics /Caminho análise

MetaCore (Thomson Reuters) do banco de dados via software integrado foi utilizado para a análise funcional do dados de expressão de ARNm de microarray [22]. Esta análise forneceu uma classificação preliminar de vias de transdução de sinal que são mais provável alterados em unidades após a exposição CHG. Nós selecionamos 14 genes diferencialmente expressos a partir dessas redes de orientação para validação RT PCR ainda mais em tempo real, com base no seu potencial associação com diabetes ou contribuição para a ativação PSC, fibrose específica ilhéu ou câncer de pâncreas.

em tempo real RT PCR validação

o ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de 1 ng de ARN utilizando o estojo de M-MLV de Transcriptase reversa (Invitrogen Life Technologies por Carlsbad, CA, EUA) sob as condições recomendadas pelo fabricante. Real-time PCR foram realizadas utilizando ABI Gene Expression Ensaios TaqMan (Tabela S1.) E TaqMan Universal PCR master mix (Part No. 4324018) num 7000 Sequence Detection System ABI, todos adquiridos da Applied Biosystems por Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA) sob condições recomendadas pelo fabricante. As amostras foram corridas em triplicado em 20 ul de volume total, contendo 50 ng de ADNc [condições de ciclos: desnaturação: 95 ° C (10 min) seguido de 40 ciclos de: 95 ° C (15 s), emparelhamento + Extensão: 60 ° C (1 min)] . Os resultados foram padronizados para 18S rRNA (Part No. 4319413E). limiar de ciclo de valores (CT) foram gravadas e expressão dos genes relativos foram calculados usando o

método -ΔΔCT 2.

ensaio imunoenzimático (ELISA) ligado a enzima

Escreva-1 e de tipo 3 conteúdo de colágeno foram avaliados através de um sistema de ELISA indireto. As placas foram revestidas durante a noite com o sobrenadante de cultura de células a 4 ° C. Após bloqueio com 3% w /v de BSA, anticorpos primários foram usadas durante a noite a 4 ° C. Após lavagem com PBS, foi aplicado anticorpo secundário adequado. (Especificações aplicadas diluições de anticorpos e são indicados na Tabela S2.) Os sinais foram atingidos por adição de 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina (Sigma, n Parte .: T0440), a reacção foi parada por 1,6 N de ácido sulfúrico. A absorvância foi registada a 450 nm (Labsystems MultiScan MS, Thermo Labsystems, Milford, MA, EUA)

Quantificação de CXCL12 e IGFBP2 no sobrenadante das células foi realizada utilizando um kit de ELISA em fase sólida sanduíche (Quantikine R . D Systems, Minneapolis, MN, EUA, Cat. no .: DSA00 e DGB200), de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi testada em triplicado.

fluorescente imunocoloração

Para a detecção de colagénio intracelular tipo-1, alfa-actina do músculo liso (α-SMA) e vimentina, imunocitoquímica foram pré-formado. Depois de cultivado em células lamelas foram fixadas com metanol gelado. interacções proteína-proteína não específicos foram bloqueados com BSA a 5% durante 30 minutos à RT, em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 verde a uma diluição de 1: 200 foram utilizados durante 1 h. As células foram contrastadas com 4′-6′-diamidino-fenilindole (DAPI, Sigma, n Parte .: D9542). Todos os passos de lavagem foram pré-formada com PBS. Fotos foram tiradas por um microscópio Nikon Eclipse E600 com a ajuda de Lucia Citogenética programa versão 1.5.6. Detalhes de anticorpos e as suas diluições apropriadas são encontrados na Tabela S3.

análise Western blot

Após a lise das células, concentração de proteína foi medida pelo método de Bradford. Vinte e cinco ug de proteína total desnaturado foram carregadas num gel de poliacrilamida a 10% e foram realizadas durante 30 min a 200 V. As proteínas foram transferidas para membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA) durante 1,5 h a 100 V. coloração de Ponceau foi aplicada para determinar a eficácia blotting. As membranas foram bloqueadas com 3% w /v de leite em pó não gordo (Bio-Rad) em TBS durante 1 h, seguida por incubação com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. Após as etapas de lavagem (0,05% v /v de Tween-20 em TBS), aplicou-se o anticorpo secundário adequado, durante 1 h, foram detectados sinais por Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce /Thermo Scientific, Parte No .: 34080), e visualizados por imagens Kodak Estação 4000mm Sistema de imagem digital. WB análises foram repetidas 3 vezes. Ponceau coloração foi utilizado para avaliar a carga igual das amostras. anticorpos Aplicadas estão indicados na Tabela S4.

proliferação e migração ensaios de células cancerosas no pâncreas T3M4

O efeito do PSC-CCM em células pancreáticas T3M4 foi avaliada utilizando um sulforhodamina-B (SRB) proliferação teste. T3M4 células foram cultivadas em placas de 96 poços (5000 células /poço) em 50% de FBS total-RPMI com 50% de CPS sobrenadante condicionado /não-FBS DMEM. As células foram fixadas com 10 w /v de ácido tricloroacético a% a 0, 24, 48, 72 e 96 horas. Após lavagem, as células foram incubadas com uma solução de 0,4% de sulforodamina-B. SRB não ligado foi eliminado com ácido acético a 1%. SRB ligado foi reconstituído com 10 mM de tampão Tris, a absorvância foi medida a 570 nm com leitor de microplacas (LabsystemsMultiScan MS).

migração das células T3M4 foi examinada utilizando um ensaio de cicatrização de feridas. Após plaqueadas em placas de Petri, as células foram cultivadas até à confluência completa. A proliferação foi inibida por com mitomicina C, do que a monocamada foi ferida com uma ponta de pipeta de 100 uL. Depois de células coçar foram cultivadas com 50% RPMI + 50% DMEM /PSC-CCM para 20h e fotografados.

A análise estatística

Shapiro-Wilks teste foi utilizado para avaliar a normalidade. Dois-atado T-test com variáveis ​​independentes foi utilizado para comparar as médias (distribuições normais). ANOVA com o teste post-hoc de Scheffe foi usado para comparações múltiplas. software Statistica (versão 7) foi usado para esses cálculos.

Resultados

transportadores de glicose (tipos-1, -2 e -3) são expressos em células T3M4 RLT-PSC humana e

Tipos-1, -2 e -3 GLUTs, mas não GLUT-4 foram detectados em RLT-PSC e lisados ​​celulares T3M4 PAC pela WB. (Fig 1).

GLUT-1, GLUT-2 e GLUT-3 são expressos em ambos células T3M4 PAC RLT-PSC e humanos. GLUT-4 foi detectado em nenhum PSCs nem sobre células T3M4. Os controlos positivos: linha de células de hepatoma HepG2 para GLUT-1 e GLUT-2, DAOY meduloblastoma para RD-40 células de rabdomiossarcoma GLUT-3 e de GLUT-4

hiperglicemia crônica e TGF-β1 induz uma. PSC activação

O aumento da α-SMA e tipo-1 expressão da proteína colágeno foi detectado por imunocoloração após PSCs foram expostos tanto a CHG e TGF-β1. Significativamente os níveis de proteína de colagénio de tipo 1 e tipo 3 maiores foram observadas após tratamento de TGF-β1, tanto com (3,61 vezes e 2,08 vezes, p 0,05) e sem (3,47 vezes e 2,35 vezes p 0,05) antes exposição CHG.

Quando PSCs foram expostos apenas para CHG, uma tendência para o aumento do tipo 1 e -3 produções de colágeno (1,41 vezes e 1,40 vezes) foi observada (Fig 2). Estes resultados sugerem que a hiperglicemia crônica pode contribuir para a ativação PSC e produção ECM excessivo.

O aumento da α-SMA e expressão da proteína do tipo 1-colagénio foi encontrado em marcação imunológica após PSCs foram expostos tanto a 21 dias de hiperglicemia ou 48h de TGF-β1

(a)

. níveis de tipo-1 aumentada e do tipo 3 de colagénio foram observadas em CPS sobrenadante de cultura celular nos estudos de ELISA, no entanto, os aumentos foram estatisticamente significativa apenas após os tratamentos de TGF-p 1, tanto com e sem exposição CHG antes, mas não após a exposição CHG sozinho

(b)

. diferenças significativas (p 0,05) são indicados *

perfis de expressão de mRNA em PSCs após os tratamentos

Com base nos resultados da matriz de expressão de mRNA que classificou as vias potencialmente alteradas mediante diferentes tratamentos e um conjunto de genes diferencialmente expressos foi seleccionado para posterior validação por em tempo real RT PCR (CXCL12, VCAN, FOS, LTBP2, COL5a1, THBS1, PPAR, RND3, MMP1, DPP4). A plausibilidade biológica na visão das fileiras via integrada MetaCore serviu de base para a seleção de genes para posterior validação. Todos os 10 genes seleccionados exibidos alterações semelhantes na validação de PCR em tempo real como no microarray.

expressão de ARNm relativa de CXCL12, FOS, LTBP2, THBS1 aumentada em unidades após a exposição ao CHG, e o efeito de TGF -β1 sozinho foi limitado. No entanto, quando aplicada, posteriormente, após a exposição CHG, o TGF-β1 aumentada ainda mais o aumento da regulação da expressão dos genes CXCL12, LTBP2, THBS1. PPAR, RND3 e expressão de mRNA MMP1 diminuiu após a exposição CHG. nível de estado estacionário de VCAN e mRNA Col5a1 aumentou apenas após o tratamento TGF-β1. Alterações de expressão gênica a nível mRNA nas células RLT-PSC humanos após diferentes tratamentos são indicados no S1 Fig.

O aumento da CXCL12, os níveis de proteína IGFBP2 em RLT-PSC sobrenadantes

níveis de CXCL12 aumentou significativamente em PSC sobrenadante após células RLT-PSC foram expostas a CHG, independentemente do tratamento subsequente de TGF-β1 (3,09 vezes e 2,73 vezes, p 0,05) (Fig 3A). Tratamento de unidades conservado previamente em glicose normal de concentração-com TGF-β1 durante 48 horas resultou num aumento de 2,69-vezes dos níveis de CXCL12.

Quando o tratamento de TGF-β1 foi aplicado subsequentemente depois disso, unidades foram expostas a CHG resultou em um aumento significativo (3,78 vezes, p 0,05) a elevação do nível de proteína IGFBP2 no sobrenadante PSC (Fig 3B)

nível CXCL12 foi significativamente aumentada em cultura de células PSC após exposição a CHG com 48h TGF-β1. tratamento com a concentração de glucose normal também resultou num aumento mais do que duas vezes

(um

). IGFBP2 nível de proteína foi aumentada no meio de cultura de células após exposição a qualquer CHG ou TGF-β1. Esta alteração só foi significativa quando PSCs foram expostos a TGF-β1, posteriormente, após a exposição CHG.

(b)

. diferenças significativas (p 0,05) são indicados *

Alteração das vias principais de sinalização em PSCs

análise de WB de unidades expostas a CHG ambos com e sem tratamento TGF-β1 subsequente demonstrou a o maior aumento significativo da fosforilação de ERK1 /2 e p38 com subsequente indução da Cdc25A e proteínas SP-1. As expressões de proteína de p21

WAF1, HIF1α, também foram aumentadas, enquanto que a quantidade de PPARy diminuiu após unidades foram expostas a CHG (Figura 4). Além disso, a via de hexosamina também foi induzido, tal como indicado pela alteração β-O-ligada N-acetilglucosamina (GlcNAc) O-padrões de modificação da proteína em unidades expostas a CHG. resultados WB com os valores de densidade relativa (alterações significativas e moderada) são indicados na Fig 4. Com excepção das alterações marginais não houve alterações conclusivos, significativas ou principais, no valor de FAK, PTEN AKT, PKC-α, c- proteínas FOS em PSCs após diferentes tratamentos. (S2 Fig)

PSCs foram expostos a CHG e /ou ao tratamento TGF-β1 subsequente. Melhores imagens representativas de moléculas de sinalização importantes das células estreladas são indicados em membranas Western blot. Ponceau coloração foi utilizado para avaliar o carregamento igual de géis. Significativa (P 0,05) * e altamente significativas diferenças (p 0,001). ** São marcadas

O aumento da proliferação e migração de células T3M4 e o efeito de uma

inibidor CXCR4

a proliferação de células T3M4 aumentou significativamente depois de 48 h de cultivo com CHG exposta PSC /CCM mostrando quase duas vezes maior (10,48), quando comparado com outros tratamentos (DMEM-5,5: 6.58¸DMEM-15,3: 6,43, p 0,05) a 72h duradoura ao longo da experiência (96 horas). Esta proliferação efeito promotor poderia ser parcialmente inibida utilizando o inibidor de CXCR4, co-tratamento AMD3100 (14,91 vs 17,54, p 0,05), mas só depois de 96 horas de tratamento (Figura 5A)

A proliferação de células T3M4 incubadas com. meio de cultura PSC condicionada diferente eo AMD3100 inibidor CXCR4 após 24, 48, 72 e 96 horas de tratamento. proliferação T3M4 células (linha sólida; controlo sem tratamento) foi significativamente aumentada após incubação com sobrenadante PSC (linha pontilhada), desde que PSC foram antes expostas a CHG. A presença do AMD3100 inibidor CXCR4 (linha tracejada) poderia antagonizar parcialmente esta indução de proliferação após 96h.

(b)

Migração de T3M4 células cancerosas em um ensaio de cicatrização. foi encontrado um efeito directo rápida do nível de glicose elevados: efeito substancial da hiperglicemia na migração de células cancerosas. Não houve efeito marcante condicionado meios de cultura CPS sobre a migração de células T3M4.

(c)

análises de Western blot de moléculas sinalizadoras chave em células T3M4. As células cancerosas foram expostos a hiperglicemia ou meio de cultura PSC condicionada diferente. Melhores imagens representativas de moléculas de sinalização importantes das células cancerosas são indicados em membranas WB. Ponceau coloração foi utilizado para avaliar o carregamento igual de géis. Significativo (p 0,05). Diferenças são indicados *

A migração de células tumorais T3M4 foi avaliada em um ensaio de cicatrização da ferida. Tanto a exposição de células cancerosas para dirigir hiperglicemia (células cancerosas incubadas em 50% de DMEM-elevado teor de glucose e 50% de RPMI numa Concentation glicose de 13,2 milímetros) e a exposição a PSC CCM-5,5 migração acrescida após 20 horas, em comparação com células de controlo. O efeito da migração promover mais pronunciada foi detectado quando as células cancerosas foram incubadas com meio PCS condicionados com teor de glicose elevada (CCM-15.3). (Fig 5B)

Alteração das vias principais de sinalização nas células T3M4

Nas células T3M4, um maciço (mais de 5 vezes) aumento da ERK1 /2 em paralelo com um aumento significativo em proteínas p21 produção foram encontrados após exposições tanto a hiperglicemia e ao CPS-CCM, apesar de que o T3M4 é uma linha celular Pac tipo ductal KRAS selvagem. elevação significativa da P-p38 foi encontrada em T3M4 células expostas a ambos os tipos de CPS-MCN. exposição hiperglicemia diminuiu a quantidade de p (Thr) Akt e p (Ser) Akt em células T3M4, em contraste, a exposição de células cancerosas a PSC-MCC aumentou a quantidade de p (Ser) Akt (Figura 5C). Ambos os receptores de CXCL12, o CXCR4 e o CXCR7 foram expressos nas células T3M4 (Figura 5C). T3M4 células expostas directamente à hiperglicemia, ou de diferentes meios condicionados de cultura CPS se aumento da quantidade de CXCR4, principalmente após o tratamento de células T3M4 com o meio de cultura de unidades que foram previamente expostos a CHG. Em contraste, não encontramos nenhuma alteração na expressão de proteínas em células CXCR7 T3M4 após diferentes tratamentos. WB resultados com os valores de densidade relativas estão indicados na figura 5C. Apenas um aumento modesto, não significativo em c-fos e em proteínas FAK foram encontrados em células T3M4 expostos a ambos os tipos de CPS-MCN nem as expressões proteína de PTEN e PKCα foram significativamente alteradas nas células T3M4 após diferentes tratamentos. (S3 Fig)

Discussão

O vínculo epidemiológico entre DM e PAC [1-3, 6] motivou esta linha de pesquisa. Nossa hipótese é que CHG pode induzir trans-diferenciação (ativação) de unidades e contribuir para o desenvolvimento e progressão da fibrose do pâncreas e câncer [15-18, 23]. A hipótese foi avaliada por meio humana, imortalizado linha de células RLT-PSC [13] em uma configuração experimental único. Uma variedade de factores de activação de PSC (por exemplo: EtOH, TGF-β1, PDGF, TNF, interleucinas [IL-1, -6, -13], ROS) foram previamente identificados, mas o papel do crónica (ou seja, 14 dias) hiperglicemia na ativação PSC não foi investigada até à data.

estudos anteriores relataram uma hiperglicemia induzida activação de unidades de ratos, mas apenas até 72 horas e sem uma abordagem de todo o genoma. [24-26] Descobrimos que PSCs humanos aumentou a formação de micro-filamento citoplasmático αSMA e tendeu a aumentar principais constituintes proteicos ECM (tipo-1 e -3 colagénios) após exposição a CHG.

a abordagem de microarray de todo o genoma foi utilizado para avaliar a glicose alterações induzidas nos padrões de expressão de mRNA. O software de banco de dados via MetaCore foi utilizado para a identificação preliminar de diabetes associado vias, após a seleção das 300 melhores genes diferencialmente expressos. Cada caminho molecular foi o resultado da integração de múltiplos conjuntos de genes com expressão de ARNm alterados no microarray (e.g .: CXCL12 foi identificado como uma integração de 12 genes com expressão de ARNm significativamente alterados em um único cascata de sinalização). Posteriormente, validou as expressões de mRNA para um conjunto seleccionado de genes utilizando PCR em tempo real. moléculas de sinalização chave foram então avaliadas ao nível da proteína em unidades de atendimento.

A fosforilação da p38 foi a mudança mais significativa na PSCs após a exposição ao CHG. Nós não poderia proporcionar uma via de montante clara para hiperglicemia induzida por aumento da fosforilação de p38 em unidades, no entanto, resultados semelhantes foram relatados em células peritoneais humanas cultivadas mesoteliais expostos a alta concentração de glicose, indicando que a activação de p38 MAPK desempenhou um papel em (a peritoneal ) desenvolvimento da fibrose [27]. A activação da via do p38 era também essencial para a concentração de glucose elevada induzida epitelial-mesenquimal transição (EMT) de células de cultura humanas epiteliais tubulares renais [28] e EMT de ácinos do pâncreas podem contribuir para a população final PSC [29]. Além disso, a via de p38 é activada durante a gluco-lipotoxicidade apoptose induzida em células secretoras de insulina INS-1 [30].

SP1 foi seleccionado para análise de WB devido a que o promotor proximal de CXCL12 é ocupada por seis putativo motivos de ligação tal como confirmado por métodos funcionais (mutagénese in vitro) SP1 [31] e, devido a esse factor de transcrição SP1 também se liga a 200 pb a montante do local de iniciação da transcrição de IGFBP2. SP1 também induz a transcrição de p21 e genes CDC25 [32, 33]. Encontrámos um aumento significativo na quantidade de proteína em unidades SP1 após a exposição ao CHG e esta era independente do efeito de TGF-β1. superexpressão SP1 no PAC humano cirurgicamente ressecado foi associada com doença agressiva e mau prognóstico [34] e SP1 foi computacionalmente previsto para ser o principal fator regulador da transcrição no PAC [35]. Concluiu-se que a sinalização através da via de hexosamina, e o CHG induzida aumento de p-p38 e P-ERK1 /2 coordenadamente todos regulados a activação do SP1 que, eventualmente, resultou no aumento da transcrição de genes Sp1-dependentes, incluindo CXCL12, IGFBP2, Cdc25A e p21 em PSCs (Fig 6) [36-39].

estes resultados sugerem um papel de fatores metabólicos na ativação do PSC que podem fornecer estímulos profibrogenic, em menor medida sinais de proliferação dessas células estromais. Hiperglicemia também induziu um padrão de secreção associada ao câncer de unidades que podem alterar o microambiente do tumor pancreático.