Abstract

proantocianidinas de semente de uva (GSPs), um componente biologicamente ativo de sementes de uva, ter sido relatado possuir uma grande variedade de propriedades farmacológicas e bioquímicas. Recentemente, os efeitos inibidores de GSPs em vários cancros têm sido relatados, mas os seus efeitos sobre o cancro cervical permanecem obscuros. Aqui, nós exploramos o efeito de GSPs sobre o cancro do colo do útero usando in vitro e em modelos in vivo. In vitro, o tratamento de células HeLa e SiHa com GSPs resultou numa inibição significativa da viabilidade celular. Outras investigações indicaram que GSPs levou à indução dependente da dose da apoptose em células cancerosas. O mecanismo subjacente foi associado com um aumento da expressão da proteína pro-apoptótica Bak-1, a diminuição da expressão da proteína anti-apoptótica de Bcl-2, a perda de potencial de membrana mitocondrial, e a activação de caspase-3, sugerindo que GSPS cervical induzido apoptose de células de cancro através da via mitocondrial. Além disso, a administração de GSPs (0,1%, 0,2% e 0,4%, w /v) como um suplemento na água de beber inibiu significativamente o crescimento do tumor de células HeLa e SiHa em ratinhos nus atímicos, e o número de células apoptóticas no aqueles tumores foi também significativamente aumentada. Tomados em conjunto, os nossos estudos demonstraram que GSPs poderia inibir o crescimento do cancro do colo do útero através da indução de apoptose por meio da via mitocondrial, o que fornece evidência indicando que GSPs quimiopreventivo pode ser um potencial e /ou um agente quimioterapêutico para cancro cervical.

Citation : Chen Q, Liu XF, Zheng PS (2014) de semente de uva Proanthocyanidins (GSPs) inibir o crescimento de cancro do colo do útero, induzindo a apoptose mediada pelo mitocondrial Caminho. PLoS ONE 9 (9): e107045. doi: 10.1371 /journal.pone.0107045

editor: Burton B. Yang, da Universidade de Toronto, Canadá |

Recebido: 05 de março de 2014; Aceito: 04 de agosto de 2014; Publicação: 04 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. O trabalho foi apoiado por uma bolsa do Fundo Nacional de Ciências Naturais para Distintos Jovens Cientistas (No. 30725043), uma concessão geral (No. 81.270.715) e um jovem concessão (No. 31.201.118) da National Science Foundation Natural da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o terceiro câncer mais comum [1] e a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer entre as mulheres em todo o mundo [2]. Aproximadamente 80% dos casos de câncer do colo do útero ocorrem nos países em desenvolvimento, onde cerca de 529.000 novos casos são detectados a cada ano, com cerca de metade desses pacientes [3] morrendo. Nos países em desenvolvimento, devido à falta de triagem e reduziu o acesso a instalações adequadas terapêuticos e drogas, a incidência e as taxas de mortalidade de classificação do câncer do colo do útero segundo após o cancro da mama [4]. Muitos casos têm desenvolvido em cânceres cervicais invasivos no momento do diagnóstico, e os pacientes não são mais candidatos para a terapia cirúrgica radical. Embora a quimioterapia e radioterapia ainda são os principais tratamentos para o cancro cervical invasivo, a taxa de sobrevivência de cinco anos é limitado por causa da limitada eficácia e elevada toxicidade de muitos medicamentos anticancerígenos. Por conseguinte, a exploração e desenvolvimento de agentes terapêuticos mais eficazes e menos tóxicos são necessários.

estudos epidemiológicos demonstraram que o consumo de uma dieta vegetable- e à base de frutas reduz significativamente o risco de cancro [5], [ ,,,0],6], que oferece novas opções promissoras para o desenvolvimento de quimiopreventivo mais eficaz ou estratégias de quimioterapia para vários tipos de cancro. Recentemente, muitos fitoquímicos de diferentes naturezas químicas isoladas de frutas e legumes foram revelados ter potencial quimiopreventivo e /ou efeitos quimioterápicos contra o câncer [7], [8], tais como catequinas, bioflavonóides, fito-estrogênios e proantocianidinas [9], [10]. proantocianidinas de semente de uva (SPG), uma mistura de polifenóis, conter principalmente 70% -95% de proantocianidinas, que constituem dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligómeros /polímeros de catequinas monoméricos e /ou (-) – epicatequinas [11] – [13] . GSPs foram demonstradas ter o mínimo de toxicidade in vivo e efeitos anti-cancerígenos eficazes em vários cancros humanos [14], tais como o cancro humano da próstata [15], o cancro colo-rectal humano [16], [17], o cancro do pulmão de células não-pequenas humano [ ,,,0],18], [19], câncer pancreático [20], e câncer de cabeça e pescoço escamoso [21]. No entanto, neste momento, nenhum estudo examinou os efeitos de GSPs sobre o câncer cervical.

Neste estudo, GSPs foram encontrados para ser capaz de inibir o crescimento do câncer do colo do útero in vitro e in vivo, proporcionando evidências convincentes para a farmacológico actividade de GSPs contra o cancro do colo do útero.

Materiais e Métodos

anticorpos, reagentes e produtos químicos

Os anticorpos específicos para a proteína Bcl-2, 1-Bak e β-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre foram adquiridos a Thermo Fisher Scientific, Inc. (Nova Iorque, Nova Iorque). O kit de detecção de apoptose FITC anexina V conjugada foi obtido a partir de BD Pharmaceuticals (Franklin Lakes, NJ). A membrana mitocondrial potencial kit de detecção de JC-1 e caspase-3 kit de detecção de actividade foram adquiridos a partir de Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. (Nanjing, China), eo no kit de detecção da morte celular in situ foi adquirido de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, DENTRO). MTT (brometo de 3- (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil), PI (iodeto de propidio) e DAPI (2- (4-amidinofenil) dicloridrato -6-indolecarbamidine) foram obtidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Os GSPs foram adquiridos de Jianfeng Produtos Naturais R . D Co., Ltd. (Tianjin, China)

linhas de células e cultura de células

As linhas celulares de cancro do colo do útero humanas SiHa e HeLa foram adquiridos a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA). As linhas celulares foram cultivadas como monocamadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (Invitrogen, Carlsbad, EUA) a 37 ° C em 5% de CO

2. GSPs foram dissolvidos numa pequena quantidade de dimetilsulf óxido (DMSO, 100 uL) antes da adição aos meios de comunicação. A concentração máxima de DMSO nos meios de comunicação não excedeu 0,1% (v /v), e células tratadas com apenas DMSO serviu como um controlo do veículo.

ensaio MTT para a viabilidade celular

O efeito de GSPs sobre a viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio de MTT, tal como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços a 5 x 10

3 células por poço e incubadas durante a noite. As células foram tratadas com GSPs a várias concentrações durante 24, 48 ou 72 h. No final do tempo de estimulação, adicionou-se MTT a cada poço. O formazano resultante foi então dissolvido em 100 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO), e a absorvância foi registada a 540 nm usando um Bio-Rad 3350 leitor de microplacas.

Fluxo de detecção de apoptose por citometria de

os efeitos de GSPs sobre a apoptose de células de cancro cervical foram analisadas por citometria de fluxo utilizando o kit de anexina V-FITC conjugado de detecção de apoptose (BD, Franklin Lakes, NJ). Resumidamente, após o tratamento com GSPs durante 48 h, as células foram colhidas, lavadas com PBS e incubadas com Anexina V-FITC e PI, durante 10 min no escuro. Em seguida, as células marcadas foram detectadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ).

ciclo celular análise

As células foram tratadas com as concentrações indicadas de GSPs durante 48 h, em seguida colhidas , lavou-se com PBS frio, e seguindo-se fixação com gelo frio de 70% de etanol durante a noite a 4 ° C. Depois lavou-se duas vezes com PBS, as células foram coradas com a solução de sonda fluorescente contendo 50 ug /ml de PI e 1 mg /ml ARNase em gelo no escuro durante 30 min. O ciclo celular foi analisada por citômetro de fluxo FACSCalibur (BD biociências, San Jose, EUA), utilizando software CellQuest.

Western blot análise

Após o tratamento com células GSPs, HeLa e SiHa foram colhidas, lavadas com PBS frio e lisadas com tampão de lise arrefecido em gelo suplementado com inibidores da protease como descrito anteriormente [23]. Para a análise de Western Blot, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF por transferência húmida. Após o bloqueio com leite isento de gordura a 5%, a membrana foi incubada com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano apropriado durante 1 h, e as bandas de proteína foram visualizadas usando reagentes de quimioluminescência aumentada (Millipore, Billerica, USA) em filme de raios-x.

Ensaio para membrana mitocondrial potencial

Alterações no potencial da membrana mitocondrial de células de cancro cervical tratados com GSPs foram medidos por citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente catiónico lipófilo JC-1 kit de detecção de acordo com o protocolo do fabricante. JC-1 acumula selectivamente dentro da mitocôndria normais para formar multímeros J-agregados que emitem fluorescência vermelha. JC-1 não pode agregar em mitocôndrias com membrana mitocondrial alterada potencial e permanece no citoplasma na forma monomérica, fluorescente verde. Assim, a cor das mudanças de corantes de laranja para verde, dependendo do potencial de membrana mitocondrial, e podem ser analisados ​​por citometria de fluxo no canal FITC.

A detecção de caspase-3 actividade

a actividade da caspase-3 foi determinada utilizando o kit Apo-alvo de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram tratadas com GSPs durante 48 h e em seguida colhido. Os lisados ​​celulares foram preparados como descrito previamente [23]. As amostras dos lisados ​​celulares (150 ug de proteína por amostra) foram misturadas com tampão de reacção e de substrato e incubada durante 4 h a 37 ° C. A absorvência foi então medida a 405 nm, e as leituras das amostras foram calculadas subtraindo a absorvância das amostras em branco.

Animais e tumores modelo de xenoenxerto

ratinhos nus Balb /C fêmeas (7/6 semanas de idade) foram obtidos a partir SLAC Laboratório animal Co., Ltd (Xangai, China) e alojados na Unidade de Recursos animais da faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong que foi mantida a uma temperatura constante (22 ° C-25 ° C ) e umidade (40-50%). Todos os animais tiveram livre acesso à água potável e de alimentos, e recebeu um tratamento humano, de acordo com os princípios internacionalmente aceites para o uso de animais de laboratório e de cuidados (orientações da Comunidade Europeia, a Directiva CEE de 1986; 86/609 /CEE). O protocolo de origem animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong.

Para determinar a eficácia do GSPs contra o crescimento do câncer do colo do útero in vivo, dois modelos de xenotransplante tumoral foram usados. Modelo 1: Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos com seis ratinhos por grupo, grupo 1, controlo; Grupo 2, GSPs (0,1%, w /v); Grupo 3, GSPs (0,2%, w /v); Grupo 4, GSPs (0,4%, w /v), e os ratinhos receberam GSPs durante pelo menos 10 dias antes da implantação de células tumorais. Modelo 2: Os murganhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de seis ratinhos por grupo, grupo 1, controlo; Grupo 2, GSPs (0,4%, w /v), e os ratos passaram a receber GSPs no 12º dia após o implante das células tumorais. Em crescimento exponencial células HeLa e SiHa (2 × 10

6 em 100 ul de PBS) foram injectadas subcutaneamente no flanco direito de cada ratinho, respectivamente. GSPs foi dissolvido em água destilada, e os ratinhos receberam GSPs pela água de beber livremente. Os ratinhos de controlo receberam água destilada. O crescimento do tumor foi monitorizada regularmente utilizando compassos de calibre de Vernier ao longo da experiência, e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a seguinte fórmula: Volume = (comprimento x largura

2) /2. No final da experiência, os ratinhos foram sacrificados por decapitação sob anestesia de uretano a 25%, e a massa de tumor foi colhida e pesada. Uma parte do tecido do tumor foi-embebido em parafina e a outra parte foi congelada em nitrogênio líquido para a análise posterior.

O exame histopatológico

As secções de parafina de xenotransplantes tumorais foram desparafinados em xilol e reidratados descendente através de concentrações de etanol de acordo com métodos de rotina e coradas com hematoxilina e eosina (H e) como anteriormente descrito [24]. Todas as secções foram examinadas com um microscópio de luz.

TUNEL para a apoptose de células cancerosas

O ensaio TUNEL foi realizada utilizando um no kit de detecção de morte celular situ (Roche Corporation, EUA), após o fabricante do protocolo. Resumidamente, após a re-hidratação de desparafinagem e as secções de tumor, elas foram incubadas com proteinase K a 37 ° C durante 15 min. As secções permeabilizadas foram incubadas com a mistura reaccional de TÚNEL a 37 ° C durante 60 min no escuro. Depois de ser lavado 3 vezes com PBS, as secções foram incubadas com o conversor-POD a 37 ° C durante 30 min, seguido por desenvolvimento substrato DAB. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina, e células positivas TUNEL foram examinadas e contadas sob um microscópio.

A microscopia de fluorescência exame

morfologia nuclear apoptótica foi avaliada por coloração das células com o corante de ligação a ADN fluorescente DAPI. Após o tratamento de células de cancro cervical com GSPs durante 48 h, as células foram coradas com DAPI (0,5 mg /ml) durante 5 min no escuro, e depois, a morfologia nuclear foi observada sob um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão).

a análise estatística

Todos os resultados foram confirmados em três experiências independentes. Os dados são expressos como médias ± DP. As comparações estatísticas foram feitas por qualquer ANOVA one-way simples seguido de

post hoc

teste de Tukey ou o teste de Qui-quadrado, e

p

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

resultados

GSPs inibiu a viabilidade das células de câncer cervical in vitro

o efeito da GSPs sobre a viabilidade das células cancerosas do colo do útero foi pela primeira vez avaliada utilizando um ensaio MTT. As linhas celulares de cancro do colo do útero, incluindo células HeLa e SiHa, foram tratados com diferentes doses de GSPs (0, 20, 40, 60, 80 e 100 ug /ml) durante 24, 48 ou 72 h. Como mostrado na Fig. 1A, o tratamento de células HeLa com GSPs resultou numa redução significativa na viabilidade das células de uma forma dependente da dose (

P

0,05). Em particular, foi observado um efeito inibitório significativo às 48 horas após o tratamento SPG (redução de 5-85%,

P

0,05). Além disso, o efeito era também dependente do tempo (60 ug /mL de SPG, redução de 25-90%,

P

0,05). efeitos inibidores semelhantes foram observados em células SiHa tratados com GSPs (Fig. 1B). Todos estes resultados indicaram que GSPs pode inibir eficazmente a viabilidade das células de cancro cervical.

(A), células HeLa e (B) células SiHa foram tratados com diferentes doses de GSPs, e a viabilidade relativa das células foi avaliada pela ensaio MTT às 24 h, 48 h e 72 h. Os resultados foram expressos em termos da percentagem de células de controlo como a média ± desvio padrão obtido a partir de 3 experiências separadas. (C) de inibição de crescimento e alterações morfológicas de células HeLa e SiHa tratados com GSPs durante 48 h, em comparação com células de controlo (não-GSPs-tratado). As células foram fotografadas com microscopia de contraste invertido (ampliação, x 40).

Além disso, a viabilidade celular das células SiHa e HeLa após o tratamento GSPs também foi observado sob um microscópio de contraste de fase. Como mostrado na Fig. 1C, após 48 horas de tratamento GSPs, a densidade de ambas as linhas celulares foi significativamente diminuída de um modo dependente da dose. tratamento GSPs também notavelmente alterou a morfologia das células do cancro do colo do útero. Após o tratamento GSPs, as células HeLa e SiHa diminuiu em tamanho, retraída dos seus vizinhos, perderam a sua forma plana e poligonais, e, finalmente, destacada do prato de cultura, sugerindo que GSPS viabilidade celular do cancro do colo do útero inibida pela indução de morte celular.

GSPs induziu a paragem do ciclo celular em células cancerosas cervical

Para claro se a inibição de viabilidade celular de cancro cervical GSPs está envolvida na alteração na progressão do ciclo celular, a análise do ciclo celular foi realizada. células HeLa e SiHa foram tratados com várias doses de GSPs durante 48 h, a distribuição de células em diferentes fases do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 2A e B, o tratamento de células HeLa com GSPs resultou numa acumulação significativa de células na fase G2 /M em concentrações mais elevadas (40 ug /ml e 80 ug /ml,

P

0,01). Semelhante aos resultados de células HeLa, uma prisão significativa das células na fase G2 /M do ciclo celular foi também observada em células SiHa a 40 e 80 ug /ml de concentração de GSPs (Fig. 2C e D,

p

0,01). Juntos, estes resultados sugerem que GSPs poderia induzir a prisão do ciclo celular em G

2 /M fase, que pode estar associada com o efeito inibitório do GSPs em células de câncer cervical.

Células

HeLa e SiHa foram tratados com várias doses de GSPs durante 48 horas, e colhidas. A distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. (A, C) Os histogramas representativos do ciclo celular de células HeLa e SiHa. (B) O tratamento de células HeLa com GSPs resultou na acumulação de células em G

2 /H de fase. (D) O tratamento de células SiHa com GSPs conduziu à acumulação de células em G

2 /H de fase. Os resultados foram expressos como média ± SD, *

p Art 0,05

vs

controle.; **

p Art .. 0,01

vs

controle

GSPs induziu a apoptose das células cancerosas cervicais

Para determinar se GSPs induzida a apoptose de células de cancro cervical, foi observada a mudança morfológica de núcleo da célula utilizando a coloração DAPI (Fig. 3A). Um número de células HeLa e SiHa tratados com várias doses de GSPs durante 48 horas foram encontrados para exibir alterações apoptóticas clássicos, tais como a condensação da cromatina, cariopicnose e formação de corpos apoptóticos. No entanto, as células HeLa e SiHa de controlo não tratado raramente exibido estas características, o que sugere que o tratamento SPG podem induzir a apoptose de células de cancro cervical.

Células

HeLa e SiHa foram tratados com diferentes doses de GSPs durante 48 h e, em seguida, colhidas para a análise da apoptose. (A) As mudanças morfológicas de núcleos foram examinadas por microscopia de fluorescência utilizando coloração DAPI. A seta indica a condensação nuclear e um corpo apoptótica (ampliação, 40 ×). A análise de citometria de fluxo de anexina V-FITC /PI HeLa duplo-corados (B) e células SiHa (C). O quadrante direito baixo (LR) dos histogramas indica as células em apoptose precoce e no quadrante superior direito (UR) indica que as células apoptóticas tardias. O tratamento de HeLa (B) e as células SiHa (C) com GSPs resulta em aumentos significativos nas percentagens de células em apoptose (incluindo fase inicial e fase tardia). Os valores são expressos como a média ± DP de três experiências em duplicado, *

p Art 0,05

vs

controle.; **

p Art .. 0,01

vs

controle

Para mais análise quantitativa da apoptose induzida por GSPs, as células tratadas com várias doses de GSPs foram analisadas por citometria de fluxo utilizando anexina V-FITC /PI dupla coloração. células em apoptose pode ser digitado em apoptose em estágio inicial (anexina V

+ e PI

-) e apoptose em estágio final (anexina V

+ e PI

+), que são apresentados, respectivamente, nos quadrantes superior direito (UR) dos histogramas FACS inferior direito (LR) e (Fig. 3B e D, painel esquerdo). Os resultados, incluindo apoptose (fase inicial e de fase tardia) em ambas as linhas celulares são ainda resumidos na Figura 3 C e E. A percentagem de células apoptóticas em células HeLa totais foi de 1,5% em células de controlo (fase inicial: 0,69% e em estágio final: 0,81%), 3,1% em células tratadas com 20 ug /ml de GSPs (early-stage: 0,95% e em estágio final: 2,15%), 17,51% em células tratadas com 40 ug /ml (early-stage: 4,21% e em estágio final: 13,30%) e 25,6% nas células tratadas com 80 ug /ml (early-stage: 8,33% e em estágio final: 17,27%). Da mesma forma, aqueles em células SiHa foram 1,37% em células de controlo (em fase inicial: 0,63% e em estágio final: 0,74%), 3,08% em células tratadas com 20 ug /ml GSPs (early-stage: 1,43% e em estágio final : 1,65%), 3,56% em células tratadas com 40 ug /ml (em fase inicial: 1,62% e de fase final: 1,94%) e 9,56% em células tratadas com 80 ug /ml (em fase inicial: 3,25% e tardia -Estágio: 6,31%). Todos estes resultados indicaram que GSPs induzida significativamente a apoptose (incluindo cedo e em estágio final apoptose,

p Art 0,01) de células cancerosas cervicais

GSPs induziu a apoptose das células cancerosas do colo do útero através. a regulação do Bcl-2 eo aumento da regulação do Bak-1 |

Tanto as proteínas Bcl-2 e Bak-1 desempenham um papel crucial na regulação da apoptose [25], [26]. Assim, a expressão de Bcl-2 e Bak-1 foi analisado por transferência de Western para determinar se estas duas proteínas estão envolvidas na indução de apoptose de células de cancro do colo do útero por SPG. Os blots representativos para células HeLa e SiHa são mostrados na Fig. 4A e C, respectivamente, e a expressão relativa destas proteínas foi ainda calculado através da normalização para a p-actina e expressão está sumariado na Figura 4 B e D, respectivamente. Os resultados mostraram que a expressão de Bcl-2 em células HeLa tratadas com GSPs durante 48 horas diminuiu significativamente de uma maneira dependente da dose (Figura 4B,

P

. 0,05). Por outro lado, a expressão de Bak-1 foi significativamente aumentada (Figura 4B,

P

. 0,05). Resultados semelhantes também foram encontrados com células SiHa (Fig 4D,

p

. 0,05). Portanto, GSPs induzida a apoptose das células de cancro do colo do útero através da regulação negativa de Bcl-2 e a sobre-regulação de Bak-1.

As células foram tratadas com diferentes doses de GSPs durante 48 h e, em seguida, colhidas . Os lisados ​​celulares foram preparados e submetidos a análise de Western blot. (A) O tratamento de células HeLa com GSPs resultou numa redução dependente da dose da expressão de Bcl-2 e um aumento na expressão de Bak-1. (B) A expressão relativa de Bcl-2 e Bak-1 proteínas em células HeLa foram calculados com base na expressão β-actina, que foi utilizado como controlo de carga. (C) GSPs diminuíram significativamente a expressão de Bcl-2 e aumentou a expressão de Bak-1 em células SiHa. (D) A relação dos níveis de expressão de Bcl-2 e Bak-1 em células SiHa estão resumidos. blots representativos são apresentados a partir de três experiências independentes e os valores são expressos como a média ± DP. *

p Art 0,05

vs

controle.; **

p Art .. 0,01

vs

controle

GSPs induzida pela perda de potencial de membrana mitocondrial em células de cancro do colo do útero e ativado proteína Caspase-3

é bem conhecido que a translocação intracelular da proteína Bcl-2 e Bak-1 pode induzir a perda de potencial de membrana mitocondrial, que está ligado à abertura e a activação do processo de apoptose em células [27], [28 ]. Para explorar o efeito da GSPs no potencial da membrana mitocondrial, a integridade da membrana mitocondrial de células foi determinada por coloração com JC-1, um corante lipofílico catiónico. Como mostrado na Fig. células 5A e C, HeLa e SiHa tratados com GSPs durante 48 horas foram analisados ​​por FACS. A percentagem média de células HeLa de fluorescência positiva verde foi de 3,10% a 0,00 ug /mL, 5,27% a 20 ug /mL, 6,90% a 40 ug /ml e 10,83% em 80 ug /ml (Fig. 5B), enquanto que das células SiHa foi de 0,45% a 0,00 ug /mL, 1,55% a 20 ug /mL, 8,35% a 40 ug /ml e 35,47% em 80 ug /ml (Fig. 5D). Estes resultados mostraram um aumento significativo em células de fluorescência verde-positiva, com doses crescentes de GSPs (

P

0,01), sugerindo que GSPs pode induzir as células de cancro do colo do útero para perder o potencial de membrana mitocondrial. Portanto, GSPs induzida a apoptose das células de cancro do colo do útero através da perturbação do potencial de membrana mitocondrial.

HeLa (A) e SiHa (C) As células foram tratadas com as doses indicadas de GSPs durante 48 h e, em seguida, colhidas, coradas com JC-1 de corante, e finalmente analisadas por citometria de fluxo. GSPs resultou numa perda significativa de potencial de membrana mitocondrial em células HeLa (B) e células SiHa (D). a actividade da caspase-3 em células HeLa e SiHa foi medido utilizando um ensaio colorimétrico de proteína, e o tratamento de células HeLa (E) e as células SiHa (F) com GSPs resultou num aumento dependente da dose na actividade da caspase-3. GFP: fluorescência verde positivo. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes, *

P

0,05

vs controlo.; **

p Art 0,01

vs

controle

Devido à perda de potencial de membrana mitocondrial, citocromo c é liberado para o citoplasma, que ativa.. procaspase 9 na apoptossomo e conduz à clivagem de caspase-3 [29]. Subsequentemente, activo caspase-3 pode clivar um largo espectro de proteínas alvo e, finalmente, resultar em morte celular apoptótica. Para examinar se a apoptose induzida por GSPs está envolvido na cascata de activação, a actividade da caspase-3 foram determinados por um ensaio colorimétrico. Os resultados mostraram que o tratamento de ambas as células HeLa e SiHa com GSPs durante 48 h resultou no aumento significativo na actividade da caspase-3 de um modo dependente da dose (Fig. 5E e F), sugerindo que a apoptose de células de cancro do colo do útero induzidas pela GSPs ocorreu por meio da ativação da via caspase-3.

GSPs inibiu a iniciação e progressão do cancro do colo do útero in vivo

Porque GSPs poderia induzir a apoptose das células cancerosas do colo do útero in vitro, foi necessária para testar se GSPs poderia inibir o crescimento tumoral e a iniciação de células de cancro cervical in vivo. Para testar os efeitos de GSPs na iniciação e progressão de células de cancro cervical humano, os ratinhos nus foram alimentados GSPs durante 10 dias antes da inoculação com células do cancro do colo do útero. O crescimento dos tumores foi monitorizado em termos de volume do tumor de três em três dias. No final da experiência, os tumores foram excisados ​​depois os ratinhos foram sacrificados, e foram determinados os pesos húmidos dos tumores.

Primeiro, verificou-se que a formação do tumor por células HeLa no grupo de controlo ocorreu no 12 dias após a inoculação; No entanto, a formação do tumor no grupo de tratamento GSPs (GSPs, 0,2% e 0,4%) ocorreu a cerca de 15 dias após a inoculação. Resultados semelhantes foram observados em células SiHa, sugerindo que GSPs inibiram a iniciação do cancro do colo do útero. Em segundo lugar, a taxa de crescimento das células HeLa e SiHa xenoenxertos de tumores em ratinhos tratados com GSPs foi significativamente mais lento do que o dos controlos (Fig. 6A e B), o que sugeria que GSPs inibiu o crescimento de xenoenxertos de cancro do colo do útero em ratinhos nus. Em última análise, o peso molhado médio de xenoenxertos de tumores formados por células HeLa a seguir ao tratamento GSPs foi significativamente menor do que a do controlo (

P

0,01, Figura 6C e E.). Do mesmo modo, a administração de GSPs também resultou numa redução significativa no peso húmido de xenoenxertos de tumor SiHa (

P

. 0,01, Figura 6D e F). Além disso, o exame histopatológico dos xenoenxertos de tumor foram realizadas sob microscópio de luz. Como mostrado na Fig. 6G e H, óbvias alterações morfológicas foram observadas nos grupos tratados GSPs. Comparado com o grupo controle, os tecidos tumorais de GSPs grupos tratados, especialmente de 0,4% do grupo GSPs, apresentou cariopicnose generalizada, formação de corpos apoptóticos e rompimento celular, sugerindo que GSPs levou à morte por apoptose e necrótica das células cancerosas cervicais. Colectivamente, estes resultados sugerem que GSPs poderia inibir a iniciação e crescimento de xenoenxertos de cancro cervical, exibindo um efeito quimiopreventivo contra o câncer cervical.

Ratos foram

sc

inoculados no flanco direito, com 2 × 10 células

6 tumorais. (A e B) Os volumes médios de tumor em cada grupo foram medidos numa base regular. No final da experiência, a massa tumoral foi colhida (C e D), e o peso húmido do tumor foi registada (E e F). (G e H) O exame histopatológico de xenoenxertos de tumores foi realizada em microscópio de luz, (ampliação, 40 ×). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão, e a significância estatística das diferenças foi analisada por ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey. *

p Art 0,05

vs

controle.; **

p Art .. 0,01

vs

controle

efeito quimioterápico de GSPs em xenoenxertos de cancro cervical

Para avaliar o efeito terapêutico de GSPs sobre os tumores estabelecidos, os ratinhos foram tratados com GSPs (0,4%, w /v) em 12

° dia após o implante, após os tumores tinham já formado. O crescimento dos tumores foi monitorizado regularmente, e descobrimos que o tratamento com GSPs levar a uma redução significativa na taxa de crescimento do tumor. Como mostrado na Fig. 7A e B, os volumes dos tumores de ratos tratados com GSPs foram marcadamente reduzidas em comparação com ratinhos de controlo, sugerindo que GSPs poderia inibir o crescimento de células HeLa e SiHa xenoenxertos de tumor. Além disso, no final da experiência, a medição do tumor peso úmido revelou que o peso húmido de tumores no grupo GSPs-tratados foi significativamente reduzida em comparação com o grupo controle (Fig. 7C e D,

p

0,01), e o exame histopatológico também descobriram que a mudança morfológica de xenoenxertos de tumores no grupo tratado com GSPs também foi notável em comparação com o grupo de controlo (Figura 7E e F).. Por conseguinte, estes resultados demonstram ainda mais o efeito inibidor de GSPs contra a progressão do cancro do colo do útero.

GSPs

No grupo tratado com SPG, os ratinhos foram administrados (0,4%) no 12

° dia após a implantação de células tumorais. (A e B) Os volumes tumorais foram registados a cada 3 dias, e a administração de GSPs inibiu o crescimento das células HeLa (A) e SiHa (B) xenoenxertos de tumor. (C e D) A massa de tumor foi recolhido no final da experiência, e o peso húmido do tumor foi medido. A administração de GSPs levou a uma redução significativa do peso do tumor molhado. (E e F) A alteração morfológica óbvia de morte celular por apoptose foi observada em tecido de tumor da grupo tratado com GSPs, mas não no grupo de controlo, (ampliação, x 40). Os valores são expressos como a média ± SD, **

p Art .. 0,01

vs

controle

GSPs induzidas a apoptose das células de xenoenxertos de cancro cervical in vivo

resistência à apoptose é um dos aspectos característicos importantes dos tumores malignos. Para determinar se GSPs inibir a progressão do cancro do colo do útero através da indução da morte celular por apoptose de células de tumor, apoptose foi avaliada utilizando o ensaio TUNEL em tecidos de tumores formados por células SiHa e HeLa com ou sem tratamento GSPs no modelo 1. Os resultados do ensaio são mostrados na Fig . 8A e quantitativamente são resumidas na Fig. 8B. A percentagem de células positivas TUNEL-em tecidos de tumor a partir de células HeLa tratadas com 0,4% GSPs foi de aproximadamente três vezes maior do que a do controlo, e que de células SiHa tratados com 0,4% GSPs foi quatro vezes maior do que o do controlo. Além disso, a actividade de caspase-3 foi também detectado para avaliar o efeito apoptótico de GSPs em tecidos de cancro formados por células SiHa e HeLa. Como mostrado na Fig.