Abstract

Fundo

No cancro do pulmão, uPA, o seu receptor (uPAR ), e os inibidores de PAI-1 e PAI-2 do activador de plasminogénio família interagir com MMP-2 e MMP-9 da família MMP para promover a progressão do cancro. No entanto, ele permanece indeterminada qual destes marcadores desempenha o papel mais importante e pode ser o indicador mais útil para estratificar os pacientes de risco.

Métodos

Nós determinamos o valor prognóstico individual destes 6 marcadores, analisando uma coorte de derivação, com 98 não-pequenas pacientes com câncer de pulmão de células por coloração imuno-histoquímica. A correlação entre os níveis de expressão de IHC destes marcadores e doenças prognóstico foi investigada, e um painel imuno-histoquímico para a previsão de prognóstico foi posteriormente gerado através da análise modelo prognóstico. O valor do painel imuno-histoquímico foi então verificada por meio de uma coorte de validação com pacientes com câncer de pulmão 91

Resultados

Na coorte de derivação, o PAI-2 é o fator prognóstico mais poderoso (HR = 2,30.;

P

= 0,001), seguido de MMP-9 (HR = 2,09;

P

= 0,019) de acordo com a análise multivariada. Ao combinar o PAI-2 e MMP-9, o grupo de prognóstico mais desfavorável (MMP-9 níveis de expressão elevados de IHC baixo PAI-2 e) mostrou um 6,40-vezes maior risco de um mau prognóstico em comparação com o grupo de prognóstico mais favorável (alta PAI -2 e baixos níveis de expressão de MMP-9 IHC). painel de PAI-2 e MMP-9 IHC poderia identificar mais precisamente os pacientes de alto risco, tanto derivação e validação de coorte.

Conclusões

Nós revelou PAI-2 como o mais poderoso marcador de prognóstico entre PA e MMP família protease, mesmo depois de considerar suas relações estreitas entre si. Ao utilizar uma combinação de PAI-2 e MMP-9, informações de prognóstico mais preciso do que simplesmente usando estágio patológico por si só pode ser obtida para pacientes com câncer de pulmão

Citation:. Su CY, Liu YP, Yang CJ, Lin YF , J Chiou, Chi LH, et ai. (2015) Plasminog�io Activator Inhibitor-2 desempenha um papel prognóstico de liderança entre famílias de protease em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0133411. doi: 10.1371 /journal.pone.0133411

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, HUNGRIA

Recebido: 12 de fevereiro de 2015; Aceito: 26 de junho de 2015; Publicação: 31 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a causa mais dominante da morte relacionada ao câncer, apesar dos avanços nas estratégias de tratamento [1]. gestão com base em Fase foram geralmente utilizado como guia para decidir quais os doentes devem receber a cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou, ou terapia-alvo [2]. No entanto, diferente prognóstico não foi pouco visto em pacientes na mesma fase. Embora os fatores de alto risco, tais como tumores e vascular ou envolvimento pleural pouco diferenciados foram recomendados para serem utilizados como indicadores adicionais para um tratamento mais agressivo, esses fatores de risco por si só ainda não são suficientes para estratificar com precisão os pacientes pelo risco [3,4]. Portanto, mais novos marcadores preditivos de prognóstico são urgentemente necessárias para orientar tomada de decisão terapêutica. Recentemente, estudos que comparam e combinar marcadores de vias reguladoras de câncer, tais como os caminhos que controlam a proliferação do tumor [5] e a transição epitelial-mesenquimal [6], com o objetivo de gerar maior eficácia prognóstico para identificar pacientes de alto risco têm recebido cada vez mais atenção .

no cancro do pulmão, a alta incidência de agressividade local e comportamento metastático é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer e pode levar ao fracasso do tratamento [7]. matriz (ECM) degradação extracelular é um dos passos mais importantes envolvidas na invasão local e metástases distantes [8]. O ativador de plasminogênio (PA) família e da metaloproteinase da matriz da família (MMP) são duas famílias de protease conhecidos que desempenham papéis essenciais na degradação ECM durante a progressão do câncer [9,10] e os seus membros têm sido relatados para ser marcadores prognósticos úteis em câncer de pulmão. níveis elevados de expressão do activador do plasminogénio de tipo uroquinase (uPA), o seu receptor (uPAR), e inibidor do activador do plasminogénio tipo 1 (PAI-1) na família da metaloproteinase da matriz e PA 2 (MMP-2) e da metaloproteinase 9 da matriz (MMP- 9) na família MMP foram correlacionadas com um prognóstico pobre e os parâmetros clínico desfavoráveis ​​[11-18]. Em contraste, os pacientes com elevada do plasminogénio tipo de inibidor do activador 2 (PAI-2) Os níveis de expressão tendem a ter um prognóstico favorável [19-21]. Embora, em alguns tipos de cancro, tais como os cancros colorrectais e endometriais, alta de PAI-2 foi associada com mau prognóstico [22,23], elevada expressão de PAI-2 foi também demonstrado estar correlacionado com melhor prognóstico no cancro da mama e cancro do ovário [24, 25].

Além de actuar sozinha, moléculas nas famílias PA e MMP também interagir uns com os outros para modular ainda mais o processo de degradação de ECM de uma maneira complicada (Fig S1). A plasmina, que é activada a partir de plasminogénio pela ligação do uPA a uPAR, pode degradar a ECM, directa ou indirectamente através da activação proteolítica de MMP-2 e MMP-9 [26]. Quando qualquer um de PAI-1 PAI-2 ou está presente, a capacidade do uPA para activar a plasmina é inibida, e por sua vez, a degradação do ECM também é inibida. No entanto, os complexos uPA-PAI-1, também têm sido relatados para aumentar a MMP-2 e MMP-9 nível de expressão através da via de sinalização a jusante [27], enquanto que a-2 uPA-PAI complexo foi mostrado para facilitar a eliminação do uPA sem activar sinalização a jusante [28]. Além disso, a MMP-9 pode aumentar a actividade de uPA através do controlo da protease nexina-1 clivagem [29]. Estes marcadores formam uma complexa rede que regula o equilíbrio de degradação ECM no microambiente tumoral.

Portanto, a identificação dos marcadores mais importantes dentro da rede de sinalização para decisão prognóstica e terapêutica vai aumentar o valor clínico. Ao invés de focar em um único marcador, o nosso principal interesse deste estudo foi avaliar e comparar o valor prognóstico dos marcadores em famílias PA e MMP e avaliar os seus efeitos combinados. Após coloração imuno-histoquímica de câncer de pulmão de células não pequenas clínica (NSCLC) amostras para determinar os níveis dos componentes desta rede de expressão, uma abordagem em três fases foi utilizado para integrar os valores de prognóstico do uPA, uPAR, PAI-1, PAI- 2, MMP-2 e MMP-9. Em primeiro lugar, verificou-se a correlação entre esses 6 marcadores e, em seguida, realizou uma avaliação multi-marcador, em que identificamos PAI-2 como o marcador com o maior valor prognóstico e MMP-9 como o segundo indicador prognóstico mais poderoso. Finalmente, um painel IHC prática composta de PAI-2 e MMP-9 foi gerado para melhorar a utilidade de prognóstico.

declaração de Ética Materiais e Métodos Comprar e pacientes

O estudo foi realizado com a aprovação das Institutional Review Boards e com a permissão dos comitês de ética da instituição envolvida (KMUH-IRB-20110286), Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Chung-Ho Memorial Hospital. Sem o consentimento informado foi necessária porque os dados foram analisados ​​de forma anónima. tratamentos Nenhum dos pacientes foram modificados para efeitos do presente estudo.

Um total de 98 pacientes com NSCLC, incluindo 61 casos de adenocarcinoma, 31 casos de carcinoma de células escamosas, e 6 casos de carcinoma de grandes células, a partir de Kaohsiung Medical Hospital da Universidade de Taiwan 1991-2007 foram inscritos como derivação de coorte (Tabela S1). Todos os pacientes receberam tratamento protocolos padronizados de acordo com as diretrizes do hospital. Pacientes com estágio operacional I-III NSCLC foram submetidos a lobectomia ou pneumectomia com linfadenectomia mediastinal. Pacientes com estágio resectable II e III NSCLC foram tratados com adjuvante pós-operatório quimioterapia à base de platina. Pacientes com irressecável localmente avançado ou doença metastática receberam quimioterapia, com ou sem radioterapia. Núcleos representativos de 1 mm de diâmetro de cada tumor com características morfológicas que eram típicos do diagnóstico foram obtidos a partir de tecido embebido parafina fixado em formalina para gerar uma micromatriz de tecido (TMA). A sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS) foram definidos como os intervalos de tempo de tratamento inicial até a morte ou até recorrência, metástase, ou morte, respectivamente. Todos os casos foram encenadas de acordo com a American Joint Committee on manual de estadiamento do câncer, e os tipos de câncer histológicos foram classificados de acordo com os critérios da classificação da Organização Mundial de Saúde. Outra câncer de pulmão não-pequenas células TMA com 91 casos foi comprado de SuperBioChips (CC5 e CCA4, SuperBioChips Laboratories, Seoul, Coreia do Sul) como a coorte de validação (S1 Tabela).

imuno-histoquímica (IHQ) coloração e interpretação

coloração IHC para uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2, MMP-2 e MMP-9, foi realizada em secções de tecido de 5 micrômetros de espessura de série cortadas da tissue microarray (TMA). Antes da coloração, na TMA de derivação e coorte de validação, testámos e titulou-se o anticorpo primário em um teste TMA-6 que contém o tecido de pulmão normal e de tecido 6 NSCLC. Uma condição de coloração que pode discriminar a intensidade de coloração entre os casos foi considerada como uma condição de coloração apropriada. Depois de determinar a condição para todos os marcadores de coloração, coloração IHC foi realizada utilizando um imunohistoquímica automático (Ventana Descoberta XT Autostainer, Ventana, EUA) para uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2, e MMP-9. As lâminas foram coradas com um anti PAI-1-anticorpo policlonal de coelho (SC-8979, 01:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), um anti-PAI-2, anticorpo policlonal de coelho (16035-1-AP, 1 : 50; Proteintech, Chicago, EUA), um anticorpo anti-uPA de coelho policlonal (SC-14019, 01:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), um anticorpo policlonal de coelho anti-uPAR (GTX100466, 1: 750; GeneTex, Taipei, Taiwan), e um anticorpo de coelho policlonal anti-MMP-9 (# 2270, 01:50; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Manual de coloração IHC foi realizada para a MMP-2. Resumidamente, as lâminas foram submetidas a induzida pelo calor de recuperação de antigénio de 10 minutos com tampão de DAKO recuperação de antigénios (pH 6) e incubou-se a 4 ° C durante a noite com um anti-MMP-2 de anticorpo policlonal de coelho (10373-2-AP, 1: 50; Proteintech, Chicago, EUA) e, em seguida visualizadas utilizando um kit de substrato de peroxidase 3, 3′-diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories, EUA). O controlo negativo foi realizado através da substituição do anticorpo primário, um anticorpo policlonal IgG de coelho de controlo de isotipo (ab27478, 1: 100; Abcam, Cambridge, Reino Unido). (Fig S2)

coloração IHC foi analisada independentemente por patologistas 2 (Chia -Yi Su e Michael Hsiao), que eram cegos para o resultado do paciente. Nós adaptamos os métodos de pontuação IHC de estudos anteriores para estabelecer um uniforme critérios de pontuação IHC para todos os 6 marcadores. Como o sistema de pontuação usado pela pesquisa anterior focada na família PA [20] e a MMP-2 e MMP-9 [17], tanto a intensidade da coloração citoplasmática e a percentagem (0-100%) de células de tumor coradas foram registados no presente estudo . A intensidade da coloração foi marcado usando uma escala de quatro níveis: 0, negativa; 1+, fraco; 2+, moderada; 3+, forte. nível de expressão elevado IHC foi definida como uma intensidade de coloração de 2+ ou 3+ em mais de 25% das células tumorais, e os outros casos foram considerados como tendo baixos níveis de expressão de IHC (S3) Fig.

Estatística análise

A análise estatística foi realizada usando SPSS 17.0 (SPSS, EUA). Correlações para o nível de expressão de IHC de todos os 6 marcadores foram avaliados por meio de análise de correlação de Spearman. As taxas de sobrevivência foram estimadas usando a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e regressão de Cox univariada e multivariada. Para a análise com comparações múltiplas, Benjamini e Hochberg taxa de descoberta de falsas (FDR) -Corrigido

P

valor foi usado e um FDR corrigida

P valor

≤ 0,05 foi considerado significativo [30] . Para a análise do modelo de prognóstico, um modelo mais complexo foi gerado através da adição de cada marcador sequencialmente para o primeiro modelo de prognóstico para determinar se o marcador acrescentado melhorou significativamente a previsão do prognóstico. A diferença entre os modelos também foi comparada através da área sob a curva (AUC) de ROC (receptor característica operativa) curva, a sensibilidade, e a especificidade. Para todas as análises, um

P

valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A verificação da correlação entre IHC níveis de uPA, uPAR expressão, PAI- 1, PAI-2, MMP-2 e MMP-9 em NSCLC

primeiro, a fim de verificar se existem correlações significativas entre o estado IHC expressão de uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2 , MMP-2 e MMP-9, a análise de correlação de Spearman foi realizada em nossa coorte de derivação. Os resultados identificaram correlações significativas (

P

0,01) entre os níveis de expressão de PAI-1 e de uPA e uPAR IHC (ρ = 0,616 e 0,431, respectivamente), entre os níveis de expressão de uPA e uPAR IHC (ρ = 0,571) , entre 9 e MMP-uPA e uPAR IHC níveis de expressão (ρ = 0,354 e 0,322, respectivamente), e entre 2 e MMP-uPA IHC níveis de expressão (ρ = 0,261). Observou-se uma correlação significativa inversa entre IHC níveis de PAI-2 e uPA expressão (ρ = -0,246;

P

= 0,015), e nível de expressão PAI-2 IHC também tendeu a ser negativamente correlacionada com os níveis de expressão de IHC de outros marcadores (Tabela 1). As imagens IHC mostrados na Fig 1A representam cortes seriados de um adenocarcinoma de pulmão com baixa intensidade PAI-2 coloração e alta intensidade de coloração de todos os 5 dos outros marcadores.

(A) Um adenocarcinoma de pulmão com representante baixo nível de expressão de IHC de PAI-2 e elevados níveis de expressão de IHC de PAI-1, uPA, uPAR, MMP-2 e MMP-9, tal como detectado por IHC. As fotografias foram tiradas com uma ampliação de 400 ×. As barras de escala representam 100 um. parcelas (B) de Kaplan-Meier da sobrevivência global em relação aos níveis de expressão de MMP-9 IHC PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2, e em NSCLC. Baixo nível de expressão IHC de PAI-2 foi significativamente associada à sobrevida global mais curto (

P Art 0,001), assim como altos IHC níveis de PAI-1, uPA, MMP-2 e MMP-9 expressão (

P

= 0,015,

P

= 0,031,

P

= 0,041,

P

= 0,037, respectivamente). (C) de Kaplan-Meier de sobrevida livre de doença em relação ao PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2, e níveis de expressão de MMP-9 IHC em NSCLC. Baixo nível de expressão IHC de PAI-2 foi significativamente associada com sobrevida livre de doença mais curto (

P Art 0,001); elevados níveis de expressão de IHC de PAI-1, uPA e MMP-9 também foi significativamente associada com menor sobrevida livre de doença (

P

= 0,019,

P

= 0,017,

P

= 0,021, respectivamente).

Determinação do maior significado prognóstico da PAI-2 e MMP-9 entre os marcadores da família PA e MMP

Para determinar o poder prognóstico indivíduo destes 6 marcadores, primeiro avaliaram a associação entre os níveis de expressão de IHC e os resultados dos pacientes pela análise de sobrevivência de Kaplan-Meier na coorte de derivação. nível de expressão PAI-2 IHC baixo foi significativamente correlacionada com um prognóstico pobre (

P Art 0,001 para ambos sobrevida global (SG) e sobrevida livre de doença (DFS)) (Fig 1B e 1C). Alto nível de expressão de IHC de PAI-1, uPA e MMP-9 também se correlacionou com um prognóstico pobre. MMP-2 nível de expressão alta IHC foi associado com um sistema operacional desfavorável, mas não foi associada a DFS. O nível de expressão uPAR IHC não se correlacionou com qualquer sistema operacional ou DFS. Além disso, por meio da análise clínico-patológico, uma correlação significativa entre o baixo nível de expressão IHC PAI-2 e superior estágio patológico (

P

= 0,027) foi encontrado (S1 Mesa e S4 Fig). Pelo contrário, altos níveis de expressão de outros marcadores de IHC tendiam a ter uma correlação com maior fase patológica. As correlações entre cada marcador e outras características clínico-patológicas estão resumidos na Tabela S1.

Devido à correlação significativa entre cada marcador na análise de correlação, análise multivariada foi realizada para determinar os respectivos papéis de prognóstico (Tabela 2). Para DFS, baixa PAI-2 nível de expressão IHC (hazard ratio [HR] = 2,30; 95% intervalo de confiança [CI] = 1,40-3,79;

P

= 0,001), alto nível de expressão de MMP-9 IHC ( HR = 2,09; IC95% = 1,13-3,88;

P

= 0,019) e um estágio superior patológica (HR = 3,44; IC95% = 2,03-5,84;

P Art 0,001) permaneceram independentemente correlacionada com um prognóstico desfavorável. Com relação ao sistema operacional, apenas o nível de expressão de PAI-2 IHC (HR = 2,52; IC95% = 1,50-4,22;

P Art 0,001) e estágio patológico (HR = 4,14; IC95% = 2.39- 7,16;

P Art 0,001) manteve uma influência significativa. Após a correção da taxa de descoberta de falsas para testes múltiplos, PAI-2 (

P

= 0,01) e MMP-9 (

P

= 0,05) ainda tinha significado prognóstico no DFS. Estes resultados indicaram que PAI-2 tem o valor prognóstico de liderança e MMP-9 é o segundo marcador de prognóstico mais significativo entre vários marcadores em famílias PA e MMP.

Criação de um painel IHC compreendendo PAI-2 e MMP-9 para a previsão de prognóstico mais preciso em pacientes com NSCLC

com base nos resultados que PAI-2 tiveram o maior valor prognóstico e que MMP-9 foi o segundo mais poderoso marcador de prognóstico na análise multivariada, um prognóstico análise do modelo, a análise de sobrevivência, e a curva ROC para testar a área sob a curva (AUC), a sensibilidade e a especificidade foram realizados para examinar a adequação da combinação de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel de IHC. Na análise modelo prognóstico (S3 Tabela), acrescentando PAI-2 e MMP-9 para a variável de estágio patológico resultou em maior poder de predição da DFS, mas adicionando mais marcadores não melhorar ainda mais o poder de previsão. Através da combinação de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel de IHC, os pacientes podiam ser separados em três grupos. Os pacientes com baixos níveis de MMP-9 de expressão de PAI-2 alta e tinha o prognóstico mais favorável, e os pacientes com a MMP-9 elevados níveis de expressão de PAI-2 baixo e tinha o prognóstico mais desfavorável (

P

0,001 para ambos OS e DFS) (Fig 2A). Na curva ROC, aumento da área sob a curva (AUC) foi visto na sobrevivência livre de doença após combinação de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel (Fig 2A e S4 Tabela). O mapa de calor apresentado os níveis de expressão de IHC de PAI-2 e MMP-9 em pacientes individuais agrupados por status de sobrevivência de ponto final (Fig 2A). Os pacientes que estavam mortos no ponto-end tendem a ter MMP-9 níveis de expressão de IHC altos baixo PAI-2 e. Além disso, o efeito cumulativo de prognóstico de PAI-2 e MMP-9, foi também investigada. Em comparação com o grupo de prognóstico mais favorável (baixa MMP-9 níveis de expressão de IHC de alta PAI-2 e), o grupo de prognóstico mais desfavorável (MMP-9 níveis de expressão elevados de IHC baixo PAI-2 e) mostrou um 6,40-vezes (IC 95% = 2,64-15,52;

P Art 0,001) aumento do risco de um mau prognóstico após o ajuste para estágio patológico (Tabela 3). Fig 2B mostram exemplos representativos do uso do painel IHQ o PAI-2 e MMP-9 em amostras de NSCLC. O paciente 1, que teve a fase I adenocarcinoma com baixos MMP-9 níveis de expressão de IHC alta PAI-2 e, estava vivo na final acompanhamento. Em contraste, o paciente 2 teve estágio IV adenocarcinoma com MMP-9 níveis de expressão de IHC altos baixo PAI-2 e e morreu 2 meses após o tratamento começou. Paciente 3 e paciente 4 foram diagnosticadas com estágio III adenocarcinoma. O paciente 3 teve baixas MMP-9 níveis de expressão de IHC alta PAI-2 e e estava vivo e não tiveram recorrência do tumor no seguimento final de cima. Em contraste, o paciente 4, que tinha MMP-9 níveis de expressão elevados IHC baixo PAI-2 e, recorrência do tumor experiente dentro de 9 meses e morreu 14 meses após o tratamento começou.

Gráficos de Kaplan-Meier (A) e ROC curva de sobrevida global ea sobrevida livre de doença para a combinação de PAI-2 e MMP-9 como um painel de IHC. Pacientes com baixa MMP-9 níveis de expressão de IHC alta PAI-2 e tinha o prognóstico mais favorável, enquanto os pacientes com MMP-9 níveis de expressão elevados IHC baixo PAI-2 e tinha o prognóstico mais desfavorável (

P Art 0,001 para ambos OS e DFS). Aumento da área sob a curva (AUC) de ROC foi observada depois de combinar de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel de sobrevivência livre de doença. No mapa de calor agrupadas por status de sobrevivência de ponto final, os pacientes que estavam mortos no ponto-end tendem a ter baixa PAI-2 e alta MMP-9 nível de expressão IHC. (B) Imagens representativas da utilização do PAI-2 e MMP-9 em amostras de painel IHC NSCLC clínicos. O paciente 1 teve a fase I adenocarcinoma com baixos MMP-9 níveis de expressão de IHC alta PAI-2 e e estava vivo no seguimento final de cima. Em contraste, o paciente 2 teve estágio IV adenocarcinoma com MMP-9 níveis de expressão de IHC altos baixo PAI-2 e e morreu 2 meses após o tratamento começou. Os pacientes 3 e 4 foram diagnosticadas com estágio III adenocarcinoma. Paciente 3, que tinham baixos MMP-9 níveis de expressão de IHC alta PAI-2 e, estava vivo e não tiveram recorrência do tumor na final acompanhamento; paciente 4, que tinha MMP-9 níveis de expressão elevados IHC baixo PAI-2 e, recorrência do tumor experiente dentro de 9 meses e morreu 14 meses após o tratamento começou. As fotografias foram tiradas com uma ampliação de 400 ×. As barras de escala representam 100 um. (C) Gráficos de Kaplan-Meier e curva ROC de sobrevida global em coorte de validação mostrou que pacientes com baixo nível de expressão PAI-2 IHC (

P

= 0,002) ou alto nível de expressão de MMP-9 IHC (

P

= 0,035) tiveram sobrevida global pobres. Quando estratificados pela PAI-2 e o painel de IHC MMP-9, os pacientes de alto risco que tinha pacientes de baixo do grupo de risco elevados níveis de expressão de MMP-9 IHC baixo PAI-2 e e tiveram alta de PAI-2 e de baixo nível de expressão de MMP-9 IHC (

P Art 0,001). Aumento da área sob a curva (AUC) de ROC foi observada depois de combinar de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel. O mapa de calor mostraram que os pacientes que estavam mortos no ponto-end tendem a ter baixa PAI-2 e de alto nível de expressão de MMP-9 IHC.

A confirmação do valor prognóstico da IHC painel compreendendo PAI-2 e MMP-9 em uma validação coorte

Para validar o poder prognóstico do painel de IHC compreendendo PAI-2 e MMP-9 descoberto em nossa coorte de derivação, realizamos ainda mais a análise de sobrevivência e ROC análise da curva em uma coorte de validação com 91 pacientes com NSCLC. Na análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, pacientes com baixo nível de expressão IHC PAI-2 teve um mau prognóstico, e os pacientes com alta MMP-9 nível de expressão IHC teve um mau prognóstico (Fig 2C). Ao combinar o PAI-2 e MMP-9, tal como um painel de IHC, os pacientes com baixos níveis de expressão de MMP-9 IHC alta PAI-2 e teve o melhor prognóstico, e pacientes com a MMP-9 níveis de expressão elevados de IHC baixo PAI-2 e tinha o pior resultado (

P

= 0,001). Aumento da área sob a curva (AUC) do Roc, também foi observado depois de combinar de PAI-2 e MMP-9, tal como um painel (Figura 2C e S4 Tabela). Como mostrado no mapa de calor (Figura 2C), os pacientes que estavam mortos no ponto final tendiam a ter a MMP-9 níveis de expressão elevados IHC baixo PAI-2 e. Portanto, o PAI-2 e MMP-9 IHC painel foram identificados a partir de marcadores de famílias PA e MMP poderia ser usado para estratificar pacientes com câncer de pulmão em risco e selecionar pacientes para tratamento mais agressivo.

Discussão

para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para integrar as famílias PA e MMP usando análise IHC no câncer de pulmão. Nós fornecemos uma nova compreensão de que a PAI-2 é o mais poderoso indicador de prognóstico entre os marcadores em famílias PA e MMP e, mais importante, PAI-2 manteve seu papel de liderança prognóstico mesmo depois de tomar a sua estreita relação com outros marcadores da família PA e MMP em consideração . Pesquisa sobre ambas as famílias PA e MMP revelou que eles são um modelo adequado para examinar valor prognóstico de avaliação multi-marcador (Tabela S5) [26-29]. No que diz respeito ao nível de via de sinalização interligado, um estudo recente fornece informações sobre as respectivas contribuições de cada membro da família PA em células epiteliais das vias aéreas [31]. Membrane-bound uPAR (muPAR) tem sido considerada a molécula-chave, porque é o único membro da família PA mostrado para acelerar a migração de células

in vitro

. Em comparação, os nossos dados IHC demonstrou nenhuma correlação entre o nível de expressão uPAR IHC e prognóstico do paciente. Esta discrepância pode ser resultado de vários factores. Em primeiro lugar, a limitação do estudo anterior foi que a sobre-expressão de cada marcador não podem imitar precisamente a rede de sinalização coordenada

In vivo

[31]. Embora nossos dados podem não ser capazes de demonstrar a relação de causa e efeito entre esses marcadores, eles refletem diretamente o papel prognóstico de cada marcador em pacientes clínicos nos quais estes marcadores são co-expressos e interagir uns com os outros. Além disso, a expressão de enzimas relacionadas com a degradação de ECM, tais como as famílias PA e de MMP, pode também ser regulada por células do estroma associado ao tumor [32]. Usando uma micromatriz de tecido (TMA), que demonstraram o valor preditivo destes marcadores, considerando tanto as células tumorais e o seu microambiente. Detecção de marcadores da família PA nível de extracção de tecidos por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) foi também um método utilizado frequentemente para analise seus papéis no cancro do pulmão (Tabela S6) [33-37]. Embora ELISA pode quantificar com mais precisão os níveis de expressão destes marcadores, as amostras de tumor podem não ser completamente formado por um tecido de tumor devido a não ser capaz de ver a morfologia do tecido. Em contraste, a análise IHC utilizado em nosso estudo poderia mais evitar esta limitação, observar diretamente a expressão in situ. Isto pode explicar que o significado prognóstico dos marcadores da família PA não foi observado em estudo anterior, utilizando ELISA [33], mas foi visto em nosso estudo usando análise IHC. Portanto, nossos resultados fornecem uma ilustração complementar dos papéis dos membros da família PA e MMP no câncer de pulmão.

Nossos dados revelam que PAI-2 desempenha um papel de liderança no PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR , MMP-2 e MMP-9. No entanto, poucos estudos têm-se centrado sobre a função fisiopatológica da PAI-2 no câncer. PAI-2 foi relatada sobre-expressão de reduzir a metástase em modelos de xenoenxerto e diminuir o nível de uPA e migração

In vitro

[38,39]. Foi recentemente demonstrado que a baixa afinidade de ligação de PAI-2 para os receptores endocíticos facilita a recarga do uPA sem evocar eventos de sinalização a jusante, fornecendo uma possível explicação para a função inibidora de PAI-2 na progressão do cancro [28,40]. A função fisiológica de PAI-2 pode ainda fornecer pistas sobre o seu papel na progressão do cancro. Como uma proteína expressa em condições de estresse tais como inflamação e infecção [41], elevado nível plasmático PAI-2 foi encontrada em pacientes com sepse ou leucemia, e o nível de expressão foi aumentado durante a doença ativa ou recaída e foi indetectável em remissão [42, 43]. No presente estudo, analisamos também a nível plasmático PAI-2 em pacientes com câncer de pulmão NSCLC através de ELISA (S5 Fig). A descoberta mostrou elevado nível plasmático PAI-2 em pacientes com câncer de pulmão em relação ao controle normal. Curiosamente, uma pesquisa recente revelou que a PAI-2, que é capaz de inibir a uPA mediada por migração de células tumorais e invasão é segregado pelas células tumorais em si em micropartículas, não por células hospedeiras [44]. Tomados em conjunto, um mecanismo pode ser proposto que o nível plasmático elevado de PAI-2 em doentes com cancro do pulmão reflecte PAI-2 positivos micropartículas em circulação secretada por células cancerosas. E mais investigação é claramente necessária para determinar se o nível de PAI-2 plasmática poderia ser usado como um substituto para o estado da doença em doentes com cancro de pulmão.

Embora o papel funcional de PAI-2 continua a ser totalmente compreendida, tomando partido da sua função inibitória, PAI-2 foi investigada como um vector de direccionamento uPA em radioimunoterapia alfa direcionados para vários tipos de câncer [45]. Em nosso estudo, a avaliação do nível de expressão dos membros da família PA e MMP por análise IHC demonstrou fornecido um método potencial para selecionar pacientes com alto nível de expressão uPA e baixo nível de expressão de PAI-2, que podem obter um maior benefício do PAI-2- terapia-alvo. Além disso, a falha de inibidores de MMP de largo espectro, em ensaios clínicos de tratamento do cancro tem conduzido ao desenvolvimento de inibidores selectivos de MMP [46], e inibidores que têm como alvo MMP-9 foram indicados como possíveis tratamentos para o cancro [47]. Por conseguinte, a utilidade clínica de PAI-2 e MMP-9, tal como marcadores de prognóstico identificados no nosso estudo sugere ainda mais o seu potencial para aplicação terapêutica em NSCLC.

Em conclusão, considerando marcadores de PA e MMP famílias de protease que é crítico na regulação da progressão do tumor, o nosso estudo revela o maior significado prognóstico de PAI-2 entre uPA, uPAR, PAI-1 e PAI-2 na família PA e MMP-2 e MMP-9 na família MMP. Ao priorizar o poder prognóstico de cada marcador, geramos um painel composto por IHC PAI-2 e MMP-9, o que proporciona maior valor prognóstico do que o estágio patológico ou um único marcador sozinho. Integração dos valores prognósticos dos marcadores de famílias protease determinados no presente estudo irá permitir a sua aplicação na prática clínica para predizer o resultado do paciente e determinar a direção do tratamento no cancro do pulmão.

Informações de Apoio

Materiais S1 e Métodos. níveis de PAI-2 e MMP-9 de plasma ELISAs.

foram detectados por comercial de PAI-2 (LS-F5568, tempo de vida Biosciences, EUA) e MMP-9 (ab100610, Abcam, Cambridge, Reino Unido) kit de ELISA. As amostras de plasma de 36 pacientes com NSCLC e 6 controlos normais foram obtidos a partir de Kaohsiung Hospital de Taiwan University Medical

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133411.s001

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S1 Fig. A família da família MMP e PA interagir uns com os outros e formam uma rede complexa que regula a degradação de ECM.

(A e B) Ambos PAI-1 e PAI-2 inibem a capacidade proteolítica do uPA e por sua vez, inibir a formação de plasmina , o que pode degradar a ECM sozinho ou através da activação de MMP-2 e MMP-9. Além disso, a MMP-9 pode aumentar a actividade de uPA através da degradação da protease nexina-1. (A) O complexo do uPA-PAI-1 pode aumentar ainda mais a expressão de MMP-2 e MMP-9 a sinalização a jusante. (B) No entanto, o uPA-PAI-2 complexo facilita o apuramento de uPA sem aumentar MMP-2 e MMP-9 expressão através de sinalização a jusante

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133411.s002

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S2 Fig.