Sumário

perda de PTEN e activação constitutiva da via de sinalização de PI3K foram associados com cancro da próstata independente de androgénios avançado. cancro da próstata PTEN com deficiência de células C42Luc sobreviver em meios livres de soro e mostram resistência relativa à apoptose, mesmo na presença do inibidor de PI3K ZSTK474. No entanto, quando ZSTK474 é combinado com o inibidor de ciclo-heximida tradução, as células sofrem apoptose C42Luc dentro de 6 horas. Identificamos desfosforilação de BAD (promotor morte associada ao Bcl-2) como principal molécula de apoptose-regulação a jusante de PI3K, e perda de MCL-1 (leucemia de células mielóides -1) como um dos principais alvos da cicloheximida. A combinação de MCL-1 e expressão de knockdown BAD2SA fosforilação mutante deficiente é suficiente para desencadear a apoptose rápida em células de cancro da próstata. Estes resultados estabelecem o mecanismo para a indução sinérgica de apoptose pela combinação de um inibidor de PI3K e de um inibidor de síntese de proteínas em células de cancro da próstata PTEN deficiente

citação:. D Yancey, Nelson KC, baiz D, Hassan S, Um Flores, Pullikuth A, et al. (2013) Desfosforilação BAD e diminuição da expressão de MCL-1 Induzir rápida apoptose em células de cancro da próstata. PLoS ONE 8 (9): e74561. doi: 10.1371 /journal.pone.0074561

editor: Aamir Ahmed, University College London, Reino Unido

Recebido: 19 de novembro de 2012; Aceito: 05 de agosto de 2013; Publicação: 05 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yancey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção R01CA118329 do Instituto Nacional do Câncer para George Kulik. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

Vários estudos têm identificado a 3-quinase (PI3K) fosfatidilinositol como um dos principais factores na carcinogénese da próstata e progressão a resistência terapêutica [1] – [3]. PI3K serve como um mediador da transdução de sinal intracelular através da geração de fosfatidilinositol (3-5) trifosfato (PIP3) através da fosforilação de fosfatidilinositol (4,5) -biphosphate (PIP2). Uma vez gerados, PIP3 recruta proteínas contendo a homologia plecstrina (PH) domínio (incluindo quinase AKT) para a membrana celular, onde sofrem uma alteração conformacional. Em Akt, esta mudança de conformação resulta na fosforilação de uma escorva na treonina 308 por quinase dependente de uma fosfoinositida (PDK1), seguido por uma fosforilação activante na serina 473 por mammalian target of rapamycin complexo 2 (mTORC2) [4]. Activado Akt transloca-se para o citoplasma e núcleo para fosforilar um número de alvos a jusante implicados na sobrevivência celular, o crescimento, proliferação e progressão do ciclo celular [5]. A fosfatase lipídica e supressor tumoral PTEN (fosfatase e tensina homólogo excluída no cromossomo 10) serve como um regulador negativo da Akt e da via PI3K por desfosforilando PIP3 e convertê-lo de volta para PIP2. No cancro da próstata, o mecanismo primário para a PI3K desregulação é a perda da função de PTEN através de deleções, perda de heterozigosidade, ou mutações de inactivação [6], [7], que conduz à activação constitutiva de Akt.

andrógeno ablação induz a apoptose em células epiteliais da próstata [8]. No entanto, as células de cancro da próstata PTEN-negativo não sofrem apoptose na ausência de androgénios [9]. níveis Da mesma forma, camundongos com nocaute PTEN com restrição de próstata têm reduzidas de apoptose e involução da próstata diminuiu após a castração [10]. Estes resultados sugerem que a activação constitutiva da via PI3K em tumores de próstata avançada PTEN-nulo contribui para a independência de androgénio através da inibição da apoptose.

As proteínas da família Bcl-2 desempenham um papel central na regulação da apoptose por permeabilização da membrana exterior mitocondrial (MOMP) e a libertação de proteínas indutoras de apoptose, tais como o citocromo c, SMAC, e o factor de indução de apoptose (AIF) sequestrado no interior da mitocôndria [11]. A família da proteína bcl-2 está dividido em três grupos com base na funcionalidade e na presença de conservadas de homologia BCL-2 (domínios BH1-4): proteínas multidomínios anti-apoptóticos, proteínas pró-apoptóticas e de vários domínios, BH3-somente proteínas. Interações entre esses grupos das proteínas BCL-2 ditar se uma célula vive ou morre. Vários domínios de proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-2, BCL-XL, e MCL-1 prevenir MOMP, interagindo com os vários domínios e sequestrando proteínas Bcl pró-apoptóticos Bak e BAX [12]. BAK e BAX têm domínios BH1-3 que permitem a oligomerização na membrana mitocondrial externa MOMP e subsequente formação de poros através [13]. Os BH3-somente proteínas, tais como BAD, Noxa e PUMA [14] – [16], de forma competitiva ligar e neutralizar as proteínas anti-apoptóticos, permitindo BAX /BAK oligomerização e promover a morte celular, enquanto Bid e Bim também pode interagir com e activar BAX e BAK, facilitando inserção na membrana e MOMP [11].

BH3 apenas proteínas da função família Bcl-2 como sentinelas que regulam a apoptose e sobrevivência em resposta a estímulos extracelulares por meio de ligação com a ranhura de hidrofóbica seus parceiros anti-apoptóticas. Cada proteína somente BH3 tem um perfil único de parceiros de ligação. Assim, Bad foi mostrado para se ligar e neutralizar a BCL-2, BCL-XL, e Bcl-W [14], [17], deslocando BAK e BAX e promover a formação de poros. No entanto, outras proteínas anti-apoptóticos tais como MCL-1 e A1 não são neutralizados por BAD, mas em vez disso estão vinculados e neutralizado por Noxa e PUMA, respectivamente [15], [17], [18].

anteriormente, foi demonstrado que o aumento da expressão BAD promove a proliferação de células de cancro da próstata [19]. Ao mesmo tempo, estado de fosforilação BAD desempenha um papel importante na regulação da apoptose por servir como um ponto de convergência de várias vias de sinalização anti-apoptóticos, incluindo PI3K constitutivamente activa [20]. fosforilação ruim em serinas 112 e 136 (com base na sequência de ratinho) [21], [22] facilita a interacção com acompanhantes 14-3-3, ao passo que a fosforilação em S155 dentro do domínio BH3 rompe a ligação a Bcl-x, ou BCL-2 [23 ]. Como resultado, a fosforilação inactiva a função pró-apoptótico de Bad, impedindo a interacção com BCL-2 e Bcl-XL. Estes resultados anteriores sugeriram que a inibição de PI3K e posterior desfosforilação BAD iria desencadear a apoptose em células de câncer de próstata PTEN-negativo. No entanto, descobrimos que, apesar de rápida desfosforilação BAD, a inibição de PI3K com ZSTK474 induz a apoptose em células de câncer de próstata C42Luc em pontos de tempo relativamente tardio (entre 12-24 horas).

Nós descobrimos que MCL-1 expressão confere resistência a tratamentos com inibidores de PI3K e desfosforilação ruim. Por outro lado, a combinação de uma perda de MCL-(induzida pela ciclo-heximida ou shRNA knockdown) e desfosforilação BAD desencadeia a apoptose rápida. Estes resultados identificam BAD e MCL-1 como os principais sentinelas de sinalização pró-apoptótico nas células de cancro da próstata PTEN deficiente estudados.

Resultados

A combinação do inibidor de PI3K ZSTK474 e a proteína cicloheximida inibidor da síntese rápida induz a apoptose em células de cancro da próstata C42Luc

a via PI3K é constitutivamente activadas em células de cancro da próstata C42Luc devido a uma deleção de um alelo do lípido fosfatase PTEN e uma mutação de frameshift no outro alelo [ ,,,0],24]. Como resultado, estas células de cancro da próstata não são dependentes de androgénio ou de outros factores de sobrevivência externos. Quando a via PI3K é inibida por ZSTK474, as células C42Luc sofrem apoptose, como é evidente a partir de células com microscopia de lapso de tempo (Figura 1A, bares xadrez) de monitoramento.

) células C42Luc A foram tratados com 5 mM ZSTK474, 100 ug /ml de cicloheximida, ou a combinação, e apoptose gravada durante 24 horas por meio de microscopia de lapso de tempo. A percentagem cumulativa de células que entram apoptose (arredondamento e vesiculação da membrana), é mostrada em pontos de tempo específicos, ao longo de 24 h. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,05. B) A caspase-3 no ensaio de activação de células C42Luc tratadas com 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml de ciclo-heximida, ou a combinação. Após 6 h de tratamento, as células foram lisadas e a actividade da caspase-3 em lisados ​​celulares foi medida com um substrato fluorogénico (DEVD-AFC). Os dados são apresentados como vezes de indução de intensidade de fluorescência normalizada para o controlo (DMSO). *,

p Art 0,0001. C) A coloração por imunofluorescência de caspase 3 clivada (vermelho) e de TUNEL (verde) em células C42Luc tratados com DMSO, 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml de ciclo-heximida, ou a combinação. DAPI foi utilizado para visualizar os núcleos. Cada linha de painéis representa o mesmo campo de visão. D) mancha de Western de células C42Luc tratadas com 5 uM ZSTK474, 100 ug /ml de ciclo-heximida, ou a combinação. lisados ​​de células inteiras foram recolhidas nos tempos indicados e sondado para pBAD (Ser112) e BAD total.

Comparação das dinâmicas apoptose em células C42Luc tratadas com o inibidor PI3K ZSTK474 isoladamente e em combinação com a tradução cicloheximida inibidor demonstrou que a combinação induz apoptose mais rapidamente, com um número substancial de células que morrem após 6 horas. Após o tratamento com ciclo-heximida ou ZSTK474 sozinha, só se tornou evidente a apoptose em 12 horas, com um número substancial de células que morrem 24 horas após o tratamento (Figura 1A). A indução de apoptose pela combinação de tratamento foi confirmada por medição da actividade de caspase com os ensaios de TUNEL (Figura 1B, C) DEVD-AMC, a detecção da forma activa da caspase 3 clivada de, e substrato fluorogénico.

publicações anteriores a partir de vários laboratórios, incluindo o nosso, mostraram que a fosforilação do BH3-única proteína BAD desempenha um papel central na regulação da apoptose a jusante da via de sinalização de PI3K em várias linhas celulares, incluindo as linhas celulares de cancro da próstata LNCaP e C42 [20], [25] , [26]. No entanto, a desfosforilação BAD não diferiram entre as células tratadas só com ZSTK474 ou com a combinação de ZSTK474 e ciclo-heximida (Figura 1D). Estes resultados sugerem que a desfosforilação BAD é irrelevante ou insuficiente para a rápida indução de apoptose em células cancerosas da próstata C42Luc.

Perda de MCL-1 sensibiliza células cancerosas da próstata para a apoptose induzida pelo inibidor PI3K ZSTK474

para elucidar o mecanismo da rápida apoptose induzida pela ciclo-heximida em combinação com ZSTK474, que transformaram a nossa atenção para outras proteínas da família da BCL-2. Desde BAD desfosforilado pode ligar-se a BCL-XL, Bcl-2, e Bcl-W, mas não pode interagir com MCL-1, a hipótese de que o MCL-1 poderiam ser responsáveis ​​por apoptose em células retardada com TAB desfosforilado. Outra linha de evidências que apoiam um papel de MCL-1 na regulação de apoptose é a sua semi-vida relativamente curto, o que permite a regulação dinâmica dos níveis de MCL-1 por estímulos extracelulares [27] e faz MCL-1 particularmente sensível à inibição da tradução através cicloheximida

células cancerosas da próstata comumente expressam três proteínas Bcl anti-apoptóticos:. BCL-XL, Bcl-2, e MCL-1 [28], [29]. A análise dos níveis de expressão de proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2 em células C42Luc tratados com agentes pró-apoptóticos mostrou que MCL-1 expressão é substancialmente reduzida nas células tratadas com ciclo-heximida, durante 6 horas, e em células tratadas com a combinação de ZSTK474 e ciclo-heximida (Figura 2A). Em contraste, não há uma redução significativa na expressão de BCL-2 e Bcl-XL foram detectados em células tratadas com uma combinação de inibidores. Ainda assim, esta evidência correlativa deixa em aberto a possibilidade de que outras proteínas de vida curta pode contribuir para o aumento da apoptose em células tratadas com ZSTK474 e cicloheximida.

A) análise de Western blot de células C42Luc tratados com 5 mM ZSTK474, 100 ug /ml de ciclo-heximida, ou a combinação durante 6 horas. Os lisados ​​celulares totais foram sondadas para o LCM-1, Bcl-2, e a BCL-XL para comparar os efeitos do inibidor da síntese de proteína e sondadas para pBAD (S112) e pAKT (S473 e T308) para verificar os efeitos do inibidor da PI3K. B) Análise de apoptose por microscopia de lapso de tempo. C42Luc células foram transfectadas transientemente com o vector lentiviral que codifica GFP e shRNA específica MCL-1-mexidos ou shRNA controle, e tratou-se com 5 uM ZSTK474 48 h após a transfecção. A percentagem de células apoptóticas em pontos de tempo indicados após tratamentos foi determinada tal como na Figura 1A. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,005; #,

P

0,001 encarte mostra Western blot de MCL-1 endógena e níveis β-actina (controlo de carga) em células C42Luc 48 horas após a infecção com um vector lentiviral expressando MCL-1 shRNA específico ou mexidos. C) ensaio de activação de caspase-3 de células C42Luc transfectadas com shRNA alvo MCL-1 ou mexidos shRNA controle. activação de caspase foi medida 6 horas após as células foram tratadas com DMSO ou 5 ZSTK474 uM. Os tratamentos foram adicionados 48 horas após a transfecção. *,

p Art 0,01; **,

p Art 0,05. D) Análise de apoptose por microscopia de lapso de tempo em células C42Luc transfectadas com shRNA (barras listradas específicas-MCL-1) ou mexidos shRNA (barras xadrez) e doxiciclina-inducible Bandeira-MCL-1. A percentagem cumulativa de células apoptóticas em pontos de tempo indicados foi determinada tal como na Figura 1A 24 horas após o tratamento com doxiciclina. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,01 #,

p Art 0,05. O encarte mostra Western blot da Bandeira-marcado MCL-1 imunoprecipitado com resina anti-FLAG e sondado para MCL-1 expressão.

Para testar diretamente o papel do MCL-1 como o principal mediador da cycloheximide- apoptose induzida em células C42Luc, reduzimos MCL-1 expressão da proteína usando shRNA knockdown. Análise de apoptose pelo ensaio de caspase e microscopia de lapso de tempo em células infectadas com um vector lentiviral que expressa quer shRNA específica-MCL1 ou mexidos shRNA controle mostrou que ZSTK474 induziu apoptose de forma mais eficiente em células com knockdown de MCL-1 (Figura 2B, C) . Por outro lado, a expressão ectópica de um sinalizador de MCL-1 construto doxiciclina induzível diminuiu a apoptose em células transfectadas com MCL-1 shRNA para níveis comparáveis, como aqueles em células transfectadas com shRNA mexidos (Figura 2D). O aumento da apoptose também foi observado em células tratadas ZSTK474 em que LCM-1 expressão foi derrubado utilizando um segundo MCL-1-específica construto shRNA alvo que 3′-UTR (Figura S1). Tomados em conjunto, os resultados destas experiências sugerem que a perda de MCL-1 contribui para a sensibilização induzida pela ciclo-heximida a apoptose induzida por ZSTK474.

BIM está envolvido na regulação de apoptose em células C42Luc

e BIM noxa , BH3-somente proteínas da família Bcl-2, foram identificados como parceiros de MCL-1 vinculativo. Noxa liga-se predominantemente a MCL1, ao passo que o BIM também podem ligar-se outras proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2, bem como ligam-se a e activar BAX [15], [30]. Noxa, mas não BIM, é apontada como estando envolvida no complexo de proteína que tem como alvo o MCL-1 para a degradação de [31]. De facto, em células tratadas com ciclo-heximida C42Luc, noxa foi degradado enquanto a expressão de BIM permaneceu constante (Fig. 3A). Assim, nós nos concentramos na análise do BIM. Consistente com relatórios anteriores, o BIM foi detectado em imunoprecipitados com contas da bandeira de células que expressam C42Luc FLAG-MCL-1 (Fig. 3B). Para testar se o BIM está envolvida na indução da apoptose pela combinação de ciclo-heximida e ZSTK474, foram utilizados dois shRNAs específicos de BIM para derrubar a expressão da proteína endógena BIM. redução significativa da actividade da caspase, bem como a diminuição da apoptose em ambas as células C42Luc-shBIM1 e C42Luc-shBIM2 em comparação com células de controlo C42Luc, foi detectado após tratamento com ciclo-heximida e ZSTK474 (Fig. 3C e D), confirmando o papel do BIM na apoptose C42Luc de células. Além disso, a diminuição da apoptose foi observado em ambas as células C42Luc-shBIM2 C42Luc-shBIM1 e comparadas com células C42Luc transfectadas com um constructo que expressa shRNA MCL-1-específica, indicando que o BIM está envolvida na iniciação de apoptose “a jusante” de MCL-1 perda.

a) noxa expressão é diminuída em células C42Luc tratados com a combinação de ZSTK474 e ciclo-heximida. A análise de Western blot de MCL-1, noxa, BIM e β-actina (controlo de carga) em células tratadas durante 4 e 6 horas com ciclo-heximida. B) Co-imunoprecipitação de MCL-1 e BIM a partir de células que expressavam doxiciclina-inducible FLAG-MCL-1. C) a apoptose em células que expressam duas C42Luc shRNA específicos de BIM e em células parentais foi avaliada por microscopia de lapso de tempo. As células foram tratadas com veículo ((-) DMSO) ou a combinação de ciclo-heximida e ZSTK474 (+). Quantidade de apoptose (%) foi determinada tal como na Figura 1A. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. Dados para a 6 horas pós-tratamento são apresentados. Diferenças em% de apoptose entre as células de controlo (que expressam mexidos shRNA) e células C42Luc BIM1 ou C42Luc BIM2 foram estatisticamente significativas (p 0,05 e P 0,0001, respectivamente). Inserir mostra diminuição da expressão BIM em células que expressam estavelmente shRNA específicos de BIM. D) A apoptose em células C42Luc que expressa um dos dois específica BIM-shRNA ou controlo de vector foi avaliada medindo a actividade da caspase. As células foram tratadas durante 6 horas com veículo ((-) DMSO) ou a combinação de ciclo-heximida e ZSTK474 (+). As diferenças na actividade de caspase entre as células de controlo e células C42Luc BIM1 ou C42Luc BIM2 foram estatisticamente significativas (p = 0,002 e p = 0,05, respectivamente). células E) C42Luc ou células C42LucBIM2 que expressam estavelmente shRNA alvo BIM-foram transfectadas com vector lentiviral que expressam GFP e quer mexidos (SCR) ou MCL-1 shRNA2 espec�ico. Percentagem da apoptose em células GFP positivas foi determinada por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram o erro padrão da média, e de quatro campos visuais. Qualitativamente foram obtidos resultados semelhantes em células C42LucBIM1. beta actina foi utilizado como um controlo de carga em (A) e (C).

desfosforilação MÁ é responsável pela rápida apoptose induzida pelo inibidor de PI3K ZSTK474 mais ciclo-heximida

Anteriormente, demonstramos que o tratamento com um inibidor da PI3K desencadeia desfosforilação BAD em S112 e S136; também utilizado shRNA knockdown para demonstrar que BAD é necessária para a indução de apoptose por inibidores de PI3K em células de cancro da próstata [20]. Ainda, vários alvos de PI3K além BAD foram implicados na inibição da apoptose [32]. Para determinar se a desfosforilação MÁ é suficiente para induzir a apoptose rápida na presença de cicloheximida, as células foram transfectadas com C42Luc uma má fosforilação mutante deficiente em doxiciclina indutível, onde Ser112 e Ser136 foram substituídos por alaninas (BAD2SA). Após tratamento ciclo-heximida, as células transfectadas com BAD2SA demonstraram aumentou significativamente a apoptose em comparação com células transfectadas com o tipo selvagem BAD (WT-DCB) (Figura 4A e B). Consistente com um papel central de Bad na regulação da apoptose, o tratamento de células da próstata com uma má-mimético ABT-737 (com base no domínio BH3 da BAD) induziu apoptose aumentada quando combinado com ciclo-heximida, similar ao da combinação de ciclo-heximida com o inibidor de PI3K ZSTK474 (Figura 4C).

a) activação da caspase 3 nas células C42Luc e C42LucBAD2SA que expressa um mutante BAD fosforilação deficiente. As células foram tratadas com 100 ug /ml de cicloheximida durante 6 horas antes do ensaio. *,

p Art 0,01. B) Análise de apoptose por microscopia de lapso de tempo. C42Luc células foram transitoriamente transfectadas com um doxiciclina induzível HA-BAD2SA ou de tipo selvagem HA-mau, e tratado com doxiciclina (Dox) 48 horas após a transfecção. Depois de 18 h de tratamento Dox, as células foram tratadas com 100 ug /ml de ciclo-heximida, e a percentagem cumulativa de células apoptóticas foi determinada por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,01 #,

p Art 0,03. O encarte mostra a análise Western blot de Bad fosforilada (pBAD112) e expressão BAD total, em células C42Luc recolhidos 18 horas após o tratamento Dox. bandas mais baixos correspondem à proteína endógena, enquanto as bandas superiores correspondem a expressa indutivamente construções HA-ruim. C) células C42Luc foram tratados com 100 mg /ml de cicloheximida em combinação com 10 mM ABT-737, um mimético BH3 com base no domínio BH de ruim ou ZSTK474. A apoptose foi analisada por microscopia de lapso de tempo. morte celular acumulada em pontos de tempo indicado é mostrado. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,01 **,

p Art 0,05 #,

p Art 0,001 ##,

p Art 0,002 .

desfosforilação BAD simultânea e MCL-1 derrota é suficiente para induzir a apoptose rápida das células C42

para confirmar que desfosforilação BAD e MCL-1 derrota são suficientes para induzir a apoptose rápida, células C42Luc foram co-transfectadas com BAD2SA e MCL-1shRNA, e apoptose foi avaliada por microscopia de lapso de tempo. As células co-transfectadas com BAD2SA e MCL-1 shRNA mostrou significativamente mais apoptose em comparação com células transfectadas com a combinação de WT-BAD e MCL-1 shRNA ou BAD2SA e mexidos shRNA (Figura 5). Estes resultados identificam BAD e MCL-1 como jogadores-chave na regulação da apoptose em células de câncer de próstata C42Luc.

células C42Luc foram co-transfectadas com MCL-1-específica shRNA ou mexidos shRNA em combinação com o BAD2SA ou WT-BAD construção. 48 horas após a transfecção, a apoptose foi analisada por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. *,

p Art 0,05 **,

p Art 0,005 ***,

p

. 0,001

Para tratar a generalidade da indução de apoptose pela combinação de ciclo-heximida e ZSTK474 em células de cancro da próstata, avaliou-se a apoptose em WFU3, PC3, DU145 e as células por microscopia de lapso de tempo e a caspase-3 ensaios fluorométricos. PTEN

– /- células epiteliais do rato próstata WFU3 mostrou indução de apoptose comparáveis ​​às células C42Luc (Figura S2). Em contraste, a indução de apoptose em células PC3 e DU145 por combinação de ciclo-heximida e ZSTK474 foi substancialmente menor em comparação com células C42Luc (comparar as Figuras 1A e 6C), apesar da desfosforilação de Bad e perda de MCL-1 em células tratadas (Figura 6A, B, C). No entanto, quando estas linhas de células foram co-transfectadas com vectores de expressão codificando os MCL um shRNA BAD2SA e com locais de fosforilação mutadas, foi observada a indução substancial de apoptose em todas as linhas celulares (Figura 6D, Figura 5). Este resultado leva à hipótese de que diferentes sensibilidade à apoptose em linhas celulares podem depender de perfis da família Bcl-2 nestas células de expressão.

A) O tratamento com combinação de cicloheximida e ZSTK474 desencadeia MCL-1 derrota no PC3, C42Luc e células DU145, bem como a desfosforilação MAU em PC3-PTEN deficiente e células C42Luc. Os lisados ​​celulares preparados 6 horas após os tratamentos foram sondadas para pS112BAD, Bad total e MCL-1, utilizando β-actina como um controlo de carga. Apoptose em C42Luc, PC3, DU145 e células foi avaliada por (B) medir a actividade de caspase 3 com substrato fluorogénico ou (C) por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente. D) Queda de MCL-1 e a expressão ectópica de Bad fosforilação deficiente foram suficientes para induzir apoptose em células de cancro da próstata. células PC3 ou DU145 foram co-transfectadas com específicos de MCL-1 shRNA controlo scrambled ou shRNA em combinação com qualquer uma construção de expressão BAD2SA ou WT-BAD. 48 horas após a transfecção, a apoptose foi analisada por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão a partir da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente.

Na verdade, tem sido relatado anteriormente que as células PC3 expressam níveis mais elevados de BCL-XL, enquanto que as células DU145 mostram diminuição da expressão de BAX ( A Fig. 7A) [33], [34]. Uma vez que foi demonstrado que o knockdown de BCL-XL células para a apoptose [35] sensibiliza, que voltada para testar o papel da expressão do Bax em resposta apoptótica de células DU145. células DU145 foram transfectadas com vectores GFP-BAX ou expressão GFP, e apoptose em células positivas para GFP foi seguido por microscopia de lapso de tempo. células DU145 transfectadas com GFP-BAX mostraram um aumento da apoptose quando tratadas com a combinação de ZSTK474 e ciclo-heximida. Assim, a expressão BAX restaura a sensibilidade de células de cancro da próstata DU145 a apoptose induzida por tratamentos de combinação (Figura 7).

A) análise de transferência de Western de expressão do Bax em PC3, C42Luc, e células DU145. Os lisados ​​celulares preparados 6 horas após os tratamentos foram sondadas com anticorpos contra a BAX e β-actina. B) Análise de transferência de Western de células transfectadas com a proteína verde fluorescente (GFP) ou GFP-BAX quimera. C) A expressão da GFP-BAX acelera a apoptose em células DU145. As células foram transfectadas com GFP ou GFP-BAX e apoptose foi analisada por microscopia de lapso de tempo. Pelo menos 100 células foram contados para cada tratamento. As barras de erro mostram desvios-padrão a partir da média de quatro campos escolhidos aleatoriamente.

Discussão

entendimento mecanicista da indução de apoptose é necessário para melhorar a eficácia da PI3K inibidores

a desregulação da via PI3K tem sido bem documentada em uma variedade de tipos de cancro, com aproximadamente 40% de PI3K sinalização alteradas nos locais primários de tumor da próstata [36], [37], e 100% de sinalização alterada em locais metastáticos [38]. No cancro da próstata, os mecanismos primários para PI3K desregulação são a perda da função de PTEN através de deleções, perda de heterozigotia ou inactivação de mutações, que conduz à activação constitutiva do sinal de PI3K /Akt. A perda funcional da PTEN está associada com a progressão câncer avançado, alto grau de Gleason, e mau prognóstico em geral, sublinhando a necessidade de opções de quimioterapia para tumores com PI3K ativo /Akt sinalização [39] – [41].

Vários inibidores de moléculas pequenas da via PI3K, incluindo os inibidores pan-PI3K ZSTK474 (Zenyaku Kogyo Co) e BKM120 (Novartis), e o BEZ235 duplo inibidor de PI3K /mTOR (Novartis) já entraram em ensaios clínicos de fase precoce para o tratamento de doenças malignas sólidas , incluindo o cancro da próstata [42] – [44]. No entanto, os ensaios anteriores não relataram melhorias significativas nos resultados clínicos [45], [46].

Uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência das células de cancro para a inibição de PI3K é necessário para seleccionar regimes terapêuticos ideais para tumores com activa sinalização PI3K. Especificamente, as informações sobre proteínas que controlam a apoptose em células de câncer de próstata PTEN com deficiência iria orientar a selecção de agentes para aumentar a sensibilidade das células de câncer de próstata à apoptose.

BAD e MCL-1 são moléculas críticas apoptose-regulação na próstata células cancerosas

O nosso trabalho anterior descreveu uma rede de sinalização de vias convergentes sinalização que controlam a fosforilação BAD e, portanto, a apoptose em células de câncer de próstata [20]. Nós também mostrou que knockdown BAD torna as células cancerosas da próstata LNCaP PTEN com deficiência insensíveis à apoptose induzida por inibidores de PI3K. Estes dados anteriores, juntamente com resultados aqui apresentados mostrando aumento da apoptose em células que expressam BAD2SA mutante fosforilação deficiente, sugerem que BAD é um regulador crítico da apoptose alvo de sinalização PI3K. Assim, a fosforilação BAD parece ser útil como biomarcador para prever a eficácia anti-tumoral dos inibidores de PI3K. Análise de fosforilação MÁ é particularmente relevante considerando que outras vias de sinalização activadas por receptores tirosina-quinase e receptores acoplados à proteína G podem fosforilar mau, mesmo quando a via PI3K é inactivo. Assim, apesar de Akt desfosforilação (rotineiramente utilizado como um marcador de actividade de PI3K), as células podem não sofrer apoptose se ruim é fosforilada por outras vias de sinalização.

Os nossos dados demonstram que a desfosforilação ruim em si é insuficiente para induzir rápido apoptose em células de cancro da próstata. Análise dos mecanismos de apoptose rápida induzidas pela combinação de inibidores de PI3K e inibidores de tradução identificado MCL-1 como uma molécula reguladora fundamental apoptose. A sua expressão, quando diminuiu, coopera com TAB na indução de apoptose. Ambos BAD e MCL-1 são ubiquamente expressa em tumores da próstata [28] e podem ser reguladas de forma dinâmica por fosforilação [20] (em caso de mau) e ambos fosforilação e ubiquitinação (no caso de MCL-1) [47].

a superexpressão do MCL-1 tem sido associado com câncer avançado de próstata, incluindo os tumores primários de alto grau de Gleason e tumores metastáticos, e neoplasias hematopoiéticas [28], [48]. MCL-1 foi identificado como um regulador crítico para a sobrevivência de células, e está sujeita a vários níveis de regulação. Transcricionalmente, os níveis de ARNm de MCL-1 são rapidamente induzida por um número de vias de transdução de sinal, incluindo as vias de MAP /ERK, PI3K /Akt, e JAK /STAT, com a activação aberrante de uma variedade de doenças malignas [49]. MCL-1 mRNA também é fortemente regulada por mir29 b [50]. MCL-1 proteína tem uma alta taxa de rotatividade através de degradação de proteínas dependente de ubiquitina pela proteassoma 26 S. Em células saudáveis, o domínio BH3 da ligase E3 MULE se liga ao sulco hidrofóbico de MCL-1 especificamente e desloca a sua interacção com Bak e BH3-sentinelas apenas [51]. MCL-1 é fosforilada por glicogénio sintase quinase-3β (GSK3β) em células estressadas, onde a via PI3K /Akt está inactivo, e preparado para ubiquitinação pela ligase E3 β-TRCP [27], [47]. A alta taxa de rotatividade de MCL-1 permite a regulação dinâmica da MCL-1 expressão nos níveis de transcrição, tradução e degradação. Estes vários níveis de regulação realçar o papel de MCL-1 como um regulador crítico apoptose e alvo terapêutico atraente, assim como um biomarcador potencial.

Anteriormente, MCL-1 foi implicada na sinalização anti-apoptótica por IL