Sumário
Objectivo
O estudo foi desenhado para avaliar a possibilidade de utilização de circulação miRNAs (soro miRNAs) como biomarcadores de diagnóstico em câncer colorretal (CRC) e identificar a sua possibilidade como candidatos para terapia direcionada
Métodos
O estudo envolveu dois conjuntos de amostras:. 1- um conjunto de treinamento que incluiu 90 pacientes com doença relacionada colorretal (30 com CRC, 18 com doença inflamatória intestinal (DII), 18 com pólipos do cólon (PB) e 24 com diferentes sintomas de cólon, mas sem qualquer anormalidade colonoscopic que foram incluídas como grupo controle) e 2- um conjunto de validação que incluiu 100 pacientes com CCR. miRNAs de soro foram extraídas de todas as disciplinas para avaliar os perfis de expressão para os seguintes miRNAs (
miR-17
,
miR-18a
,
miR-19a
,
miR-19b
,
miR-20a
,
miR-21
,
miR-146a
,
miR-223
,
miR-24
,
miR-454
,
miR-183
,
miR-135a
,
miR- 135b e miR- 92a
) usando a matriz SyberGreen baseada em PCR costume miScript miARN. A área sob a curva ROC (AUC) foi utilizado para avaliar o desempenho diagnóstico dos miRNAs estudadas para o diagnóstico de cancro colorrectal.
Resultados
A análise dos dados de miRNA do conjunto de treinamento mostrou que ; em relação ao grupo controle, apenas
miR-19b
foi significativamente sobre-regulada em pacientes com o grupo IBD (dobre mudança = 5,24, p = 0,016), enquanto que em pacientes com pólipos do cólon,
miR-18a
foi significativamente up-regulada (dobre mudança = 3,49, p = 0,018). Por outro lado,
miR-17
,
miR-19a
,
miR-20a e
miR-223
foram significativamente up-regulada ( dobre mudança = 2,35, 3,07, 2,38 e 10,35; respectivamente e valor de p = 0,02, 0,015, 0,017 e 0,016;., respectivamente, em pacientes com CCR no entanto, o conjunto de validação mostrou que apenas
miR-223
significativamente foi-se -regulated em pacientes de CRC (dobre mudança = 4,06, p = 0,04).
Conclusão
expressões aberrante miRNA são altamente envolvidos na cascata de carcinogênese colorretal. Descobrimos que (
miR-17
,
miR-19a
,
miR-20a e miR-223
) poderia ser utilizado como biomarcador de diagnóstico para CRC. por outro lado,
miR-19b
e
miR-18a
poderiam ser usados como biomarcadores de diagnóstico para a CP e IBD, respectivamente
Citation:. Zekri A-RN, Youssef ASE-D, Lotfy MM, Gabr R, Ahmed OS, Nassar a, et al (2016) circulação Serum miRNAs como diagnóstico marcadores para cancro colorectal PLoS ONE 11 (5):.. e0154130 doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130
editor: Shrikant Anant, Universidade de Kansas School of Medicine, Estados Unidos
Recebido: 08 de novembro de 2015; Aceito: 10 de abril de 2016; Publicado em: 02 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Zekri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Os dados são disponível a partir de figshare no seguinte link: https://figshare.com/articles/Circulating_serum_miRNAs_as_diagnostic_markers_for_colorectal_cancer/3084625.
Funding: Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é uma das. as neoplasias malignas mais comuns em todo o mundo, sendo a segunda em mulheres ea terceira nos machos com 1,2 milhões de novos casos anuais em todo o mundo [1]. Apesar do aumento da sensibilização, bem como melhoradas recomendações e técnicas de rastreio, CRC continua a ser a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens e mulheres [2] e sendo responsável por 10% da mortalidade relacionada com Câncer em todo o mundo [3].
tem sido abordado anteriormente que os pacientes com doença inflamatória do intestino (DII) são geralmente associada com um aumento no risco de progressão para displasia epitelial e CRC [4, 5].
Os miARNs representam um interessante classe de pequenos (18-25 nucleótidos de comprimento) não codificante RNAs que actuam como reguladores de pós-transcricional da expressão genética através da ligação a regiões 3`untranslated (UTR) dos mRNAs alvo e promover a degradação do mRNA ou a repressão de translação [6]. O facto de miARNs desempenhar um papel na biologia do cancro foi suportada por descobrir que mais de 50% dos genes de miARN estão localizados nos locais frágeis e regiões de deleção ou amplificações que estão alteradas em diferentes tipos de cancro humano [7]. cumulativa evidência indica que alguns miARNs podem comportar-se quer como oncomirs ou genes supressores tumorais na cascata de CRC.Therefore, eles possuem o potencial para serem utilizados como marcadores tumorais de diagnóstico, prognóstico ou terapêutica [8].
Diferentes estudos relataram alterações significativas dos níveis de expressão de miRNA em tecidos CRC em relação ao epitélio do cólon normal, e identificou grupos de miRNAs que permitem estratificação prognóstica dos pacientes com CCR [9]. Neste contexto, a expressão aumentada de muitos miARNs, que medeiam o crescimento celular e a progressão do tumor, foi reportado no sangue e /ou tecidos de casos CRC utilizando um ensaio de micromatriz de miARN que
incluído miR-20
,
miR-21
,
miR-17-5p
,
miR-15b
,
miR-181b
,
miR-191 e miR-200c
[10, 11]. A presença de miARN no soro, plasma e outros fluidos corporais tais como urina, saliva, e amniótico pesquisa fluido encorajados miARNs vez que isto facilita a sua detecção e faz-los candidatos ideais como biomarcadores não invasivos para a detecção precoce e a progressão da doença de controlo [12].
o objetivo do presente estudo é avaliar o papel das expressões miRNAs aberrantes no desenvolvimento e progressão de casos de CRC. Isto foi conseguido através do estudo os níveis de 14 miARNs expressão em diferentes fases da cascata carcinogénese colorectal. O racional para a seleção de estudaram 14 miRNAs foi baseada em referências anteriores que ilustraram o seu papel na carcinogênese colorretal (S1 Tabela).
Pacientes e Métodos
Design Estudo
Dois independente conjuntos de amostras foram incluídos no estudo (o conjunto de treinamento eo conjunto de validação). O conjunto de treinamento incluiu 90 pacientes que participaram da unidade de endoscopia gastrointestinal do departamento de medicina tropical, Kasr El-Aini Faculdade de Medicina da Universidade do Cairo; durante o período de janeiro de 2011 a março de 2012. Com base nos resultados colonoscópicas e exame histopatológico dos casos estudados, os pacientes foram classificados em quatro grupos; 30 pacientes com CRC, 18 com doença inflamatória intestinal (DII), 18 com pólipos do cólon (PB) e 24 com diferentes sintomas de cólon, mas sem qualquer anormalidade colonoscopic que serviu como grupo de controle. O conjunto de validação incluiu 100 casos de CRC, que foram diagnosticados e tratados o National Cancer Institute, Universidade do Cairo, no período de janeiro de 2013 a março de 2014. Um consentimento informado foi obtido de cada paciente após a aprovação dos comités de ética do NCI ( Instituto nacional do Câncer), Universidade do Cairo. Os membros do IRB são Prof. Ahmed Mostafa Morsi, vice-decano para o Ensino Superior e Investigação; Prof.Wahid Yousry, Chefe de Oncologia Cirúrgica Dept .; Prof. Emad El-Gemaei, Chefe de Patologia Dept .; Prof. Rabab Gaafar, Chefe de Oncologia Médica Dept .; Prof. Mahmoud El Gebaly, Chefe de clincal Patologia Dept .; Prof. Mervat El Nagar, chefe de Radioterapia Dept .; Prof. Sabry Shaarawy, Chefe de Biologia do Câncer Dept .; Prof. Ikram Hamed, chefe de Radiodiagnóstico Dept .; Prof. Mai Helali, Chefe de Anathesia and Pain controle Dept .; Prof. Nelly Hassan, chefe de epidemiologia do cancro e Bioestatística Dept.and Dr. Atef Badran, Terceira do Gestor de dados clínicos. Organização No.IORG0003381. IRB NO.IRB00004025.
As amostras de soro coleção
De cada paciente e controle assunto, foram obtidos 5 ml de sangue venoso, centrifugado e o soro foi separado. Todas as amostras de soro foram armazenadas a -80 ° C até serem usadas.
extracção de ARN e qRT-PCR
O ARN total incluindo miARNs foi extraído a partir de soros utilizando o Kit miRNeasy Mini (Qiagen, Alemanha, Cat . No.217004). De acordo com as instruções do fabricante, c-ADN A síntese foi realizada utilizando o kit de miScript II RT (Qiagen, Cat. No.218161). Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada usando o estojo de PCR miScript Syber verde (Qiagen, Cat. No.218075). perfis de expressão gênica foram gerados em matrizes de 96 poços usando o costume variedade miScript miRNA PCR para as seguintes microRNAs (
miR-17
,
miR-18a
,
miR-19a
,
miR-19b
,
miR-20a
,
miR-21
,
miR-146a
,
miR-223
,
miR-24
,
miR-454
,
miR-183
,
miR- 135a
,
miR- 135b e miR – 92a
)
(Qiagen, Cat N ° CM1HS0064C) de acordo com as instruções dos fabricantes como se segue: 15 min a 95 ° C durante um ciclo, 15 segundos a 94 ° C, 30 s a 55 ° C. e 30 a 70 ° C durante 40 ciclos utilizando AB 7500 rápido sistema de PCR em Tempo real. dados do ciclo limiar foram analisados utilizando o software RT2 Profiler (versão 3.4; SABiosciences). níveis de expressão génica relativos foram normalizados para gene de manutenção (SNORD 68) e as mudanças de dobragem do gene alvo (s) de expressão relativa aos do grupo de controlo foram analisados pelo método 2-ΔΔCT.
A análise estatística
a expressão relativa de miRNAs foi analisada utilizando software SABiosciences eo p-valor foi calculado com base em um teste t de Student dos replicados 2 ^ (- Delta Ct) valores para cada gene nos grupos de controle e tratamento. Valor P inferior a 0,05 foi considerado significativo. (ROC)-receptor-operacionais característica e a área sob a curva (AUC) foram usadas para avaliar a precisão do diagnóstico de miRNAs soro. As características clínico-patológicas relevantes foram determinadas por one way ANOVA para os dados quantitativos e
2 de teste X para dados qualitativos. Todos os testes foram de 2 lados e valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise estatística foi invocada SPSS 17.0 (SPSS Ltd., UK) e gráficos foram gerados com Graph Pad Prism 5.0 (Graph Pad Software Inc, EUA).
Resultados
As características clínicas da grupos estudados
Em relação ao conjunto de treinamento, a média de idade dos pacientes com CCR (51,10 ± 10) foi significativamente maior do que outros grupos (valor-p 0,05). No entanto, nenhuma diferença significativa foi relatada entre a média de idade do grupo controle (43,7 ± 14,2) e aqueles com CP (40,00 ± 15,0) e IBD (41,6 ± 15,4) ou do sexo para todos os grupos (p-value 0,48) . Além disso, houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados em relação à dor abdominal, muco, perda de peso e anemia (p 0,05). Em relação ao conjunto de validação, não houve diferença significativa entre a média de idade de CRC grupo (46,7 ± 14,5) e o grupo de controlo (43,7 ± 14,2) ou o sexo entre os dois grupos. No entanto, houve diferenças estatisticamente significativas entre o grupo CRC eo grupo controle em relação à dor abdominal, muco, perda de peso e anemia (p 0,05). Como mostrado na (Tabela 1)
a expressão diferencial dos miRNAs estudadas nos grupos investigados em comparação com o grupo controle na formação set Online
Entre todos os miRNAs estudados, apenas
miR-19b
foi significativamente regulada para cima no o grupo IBD (dobre mudança = 5,24, p = 0,016) (Fig 1 e Tabela 2), enquanto que
miR-18a
foi a mudança = 3,49, p-valor significativamente acima regulamentada do grupo CP (dobre = 0,018) (Figura 2 e Tabela 3) e
miR-17
,
miR-19a
,
miR-20a e miR-223
foram significativamente regulada para cima no o grupo CRC (dobre mudança = 2,35, 3,07, 2,38 10,35 e p-valor = 0,021, 0,015, 0,017 0,0166, respectivamente)., como mostrado na (figura 3 e Quadro 4)
a) vulcão trama mostra a expressão diferencial de 14-miARNs no grupo IBD versus o grupo de controlo.
miR-19b
foi significativamente até regulamentada. B) análise da curva ROC de
miR-19b
entre o grupo de IBD e o grupo controle.
A) enredo Volcano mostra expressão diferencial de 14 miRNAs no grupo de pólipos do cólon contra o grupo controle.
miR-18a
foi significativamente até regulamentada. B) análise da curva ROC de
miR-18a
entre o grupo de pólipos do cólon e do grupo controle.
miR-17
,
miR-19a
.
miR-20a e miR-233
foram significativamente até regulamentada. B) análise da curva ROC de
miR-17
,
miR-19a
.
miR-20a e miR-233
entre o grupo CRC eo grupo controle. C) O clustergrama executa agrupamento hierárquico de todo o conjunto de dados para exibir um mapa de calor com dendrogramas indicando genes co-regulados através de controle, IBD, pólipos do cólon e grupos de CRC, respectivamente.
ao comparar o grupo CRC (malignas) versus os outros grupos (não maligna); única miR-223 foi significativamente até regulamentada (dobre mudança = 4,49, p = 0,002), como mostrado na (Tabela 5).
No entanto, apenas
miR-135b e
miR-454
foram significativamente regulada negativamente no grupo BF em comparação com o grupo de DII (dobre mudança = 0,24 0,44 e p-valor = 0,023 0,018, respectivamente) como se mostra na Tabela S2. Enquanto
miR-135a
e
miR-135b
foram significativamente regulada para baixo no grupo CP em comparação com o grupo de IBD (dobre mudança = 0,12, 0,09 e valor de p = 0,019 e 0,018, respectivamente ) como mostra a Tabela S3.
a expressão diferencial dos miRNAs estudadas no grupo CRC em comparação com o grupo controle na validação set Online
Entre todos os miRNAs estudados, apenas
miR-223
foi significativamente regulada para cima no grupo BF (dobre mudança = 4,06, p-valor = 0,04) como se mostra em (Tabela 6). Após a divisão dos pacientes CRC da validação definido em grupos masculinos e femininos; descobrimos que
miR-19a
,
miR-19b
, e
miR-20a
foram significativamente-se regulada nos pacientes com CCR feminino em comparação com o grupo controle (dobre mudança = 2,8, 4,1 2,2 e p-valor = 0,021, 0,023 0,04, respectivamente) como se mostra na Tabela S4. Por outro lado, apenas
miR-17
foi significativamente regulada para cima em pacientes de CRC do sexo masculino comparado com o grupo de controlo (2,1 vezes a mudança =, p-valor = 0,03) como se mostra na Tabela S5.
análise de curva ROC de miRNAs diferencialmente expressos
Para discriminar o grupo CRC do grupo controle; descobrimos que
miR-223
(AUC 0,838), miR-17 (AUC 0,813),
miR-19a
(AUC 0,825) possuíam maior desempenho diagnóstico do que
miR-20a
(AUC 0,788). Por outro lado,
miR-18a
(AUC 0,8) apresentaram boa performance diagnóstica na discriminação do grupo IBD do grupo controle. Além disso,
miR-19b
(AUC 0,875) apresentaram boa performance diagnóstica na discriminação do grupo CP do grupo controle, como mostrado na (Tabela 7).
Discussão
Nosso estudo avaliou a possibilidade de utilizar diferentes miRNAs circulantes como biomarcadores sorológicos para detecção de CRC. Nosso estudo foi devidamente projetado para incluir casos em diferentes estágios de doenças relacionadas colorretal ou seja, pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), pólipos adenomatosos (PB) e CRC.
Os nossos resultados revelaram que não havia regulamentação significativa acima de
miR-17
,
miR-19a
,
miR-20a
e
miR-223
no grupo CRC em comparação com o grupo controle. O
miR-17
,
miR-20a e miR-19a Quais são membros da policistr�ica
miR17-92
aglomerado (
miR-17
,
miR-18a
,
miR-19a
,
miR-19b
,
miR-20a
,
e miR-92a
) que localizado em 13q31.3; um local que é frequentemente amplificados em câncer colorretal [13, 14]. A nossa descoberta sobre significativo aumento da regulação do
miR-20a
veio de acordo com os resultados anteriores por Xu et al., Que descobriu que o aumento da regulação do
miR-20
foi associado a tumor invasão e metástase ganglionar de pacientes com HCC [15]. Então,
miR-20a
podem possuir um potencial oncogénico função tumor no CRC. Além disso,
miR-20a
promove epitelial para mesenquimal (EMT), um passo chave na metástase tumoral, através da segmentação do gene supressor de tumor (o tecido da metaloproteinase matriz inibidor 3 (TIMP3)); regulador negativo das metaloproteinases da matriz 2 (MMP2) e da metaloproteinase 9 da matriz (MMP9), que mediada matriz extracelular (ECM) degradação [15]. Além disso, o miR-20a como alvo os membros de activação do
E2F
família, incluindo ciclo celular e genes reguladores de apoptose, levando a G1- transição de fase S. No entanto, os níveis elevados de proteínas E2F, especialmente E2F1, pode induzir a apoptose, que actua como um travão de emergência para sobre as células em proliferação. A função oncogénica de
miR-20a
foi proposto para impedir essa função de frenagem de emergência de fatores E2F e, portanto, estimular o crescimento do tumor [16]. Além disso,
miR-20a
controla a progressão do ciclo celular através de segmentação inibidores da quinase dependente da ciclina, CDKN1A /p21; importante regulador de G2 /S transição [17]. Além disso, o miR-20a atinge supressor de tumor PTEN; o qual é um regulador negativo da via PI3K prosurvival oncogénica \\ AKT [18, 19]. Os nossos dados sobre a regulação positiva de
miR-17a
e
miR-19a
em pacientes de CRC são comparáveis aos relatos prévios na literatura [9, 16-19]. Da mesma forma que
miR-20a
,
miR-17a
foi mostrado para promover a progressão do ciclo celular através da segmentação CDKN1A /p21 e E2F [16, 17], ao passo que o potencial oncogênico de
miR -19a
é alcançada principalmente através visando o PTEN; promovendo assim a via oncogénica pró-sobrevivência [9, 18-20].
Nossos dados referentes
miR-223
mais expressão no grupo CRC são concordantes com os de Huang
et al
que avaliaram os níveis de miRNAs expressão no plasma de 100 pacientes com CCR e em 37 pacientes com adenomas do cólon, em comparação com 59 indivíduos saudáveis. Entre seu painel, 12 miRNAs foram-se regulamentada, incluindo
miR-223
[21]. Da mesma forma, Li
et al
. relataram que a sobre-expressão de
miR-223
nos tecidos do cólon neoplásicas em comparação com os não-cancerosas adjacentes [22]. A função oncogénica de
miR-223
no CRC foi conseguido através de segmentação FOXO1 [23] e RASA1 [24]. FOXO1 é um membro da FOX factores de transcrição-O subfamília. Ela regula a actividade de transcrição de vários genes, incluindo p21, e, assim, inibe a progressão do ciclo celular [25, 26] .Por outro lado, RASA1, um terminador de sinalização de Ras, está associada com a progressão tumoral [27]. Além disso, Li
et al
. mostrou que
miR-223
poderia ser considerado um marcador de prognóstico, uma vez que é sobre-expressão correlaciona-se significativamente com o estágio de alta TNM, nodal e metástases à distância, bem como com taxas de sobrevida global reduzidas [22]. Nossos dados também mostraram que a regulação significativo da
miR-18a
em pacientes com CP em comparação com o grupo controle. Nossos resultados apoiou um relatório anterior por Wu et al [28], que demonstrou que
miR-18a
desempenha um papel oncogênico na carcinogênese colorretal através da regulação para baixo do gene telangiectasia mutado Ataxia (ATM).; uma enzima chave na reparação de quebras de ADN de cadeia dupla. Além disso, fosforila várias proteínas chave que iniciam a activação do checkpoint de dano do DNA, conduzindo à paragem do ciclo celular, ou apoptose de reparação do ADN [29].
Quanto
miR-19b
, significativa a regulação foi relatada em pacientes com DII em comparação com o grupo de controlo. Jiang et al. mostraram que tanto
miR17
e
miR-19b, pertencente ao
miR-17-92
cluster, inibem a diferenciação das células Treg e promover respostas Th1 [30]. Th1 é responsável pela resposta inflamatória Pro via secretora de IL12, IL-2, IL-6, IFN e TNF [31]. Este último (TNF) desempenha um papel fundamental no processo de inflamação, através da activação de NF-kB via; uma via de sinalização prototípico pró inflamatório [32]. O possível papel mecanicista da miRNAs significativas no CRC, IBD e grupos de pólipos do cólon em comparação com o grupo controle e os seus alvos a jusante foram ilustrados no desenho animado sugeriu (Fig 4).
Estrela vermelha indica o miRNA significativa no CRC enquanto a estrela amarela indicam miRNA significativas na IBD e estrela verde indicam miRNA em pólipos do cólon. A seta indica a ativação enquanto o círculo no final da linha indica inibição.
Estrela vermelha indica o miRNA significativa no CRC enquanto a estrela amarela indica miRNA significativas em IBD e estrela verde indica miRNA em pólipos do cólon. A seta indica a activação do círculo, enquanto no final da linha indica a inibição.
Uma análise posterior dos dados usando (ROC) análise e a área sob a curva correspondente foram tentadas para os miARNs significativas em cada comparação aos pares para investigar a sua precisão do diagnóstico. ROC análise da curva de miRNAs individuais revelou que
miR-17
, amp
miR-19a
,
miR-20a miR-223
pode efetivamente diferenciar entre o grupo CRC eo grupo controle. No entanto,
miR-18a
mostrou boa acurácia diagnóstica na discriminação do grupo CP do grupo controle. Por outro lado,
miR-19b
mostrou boa acurácia diagnóstica na discriminação do grupo IBD do grupo controle.
Em conclusão
expressões aberrante miRNA são altamente envolvido na cascata da carcinogénese colorectal. Descobrimos que (
miR-17
,
miR-19a
,
miR-20a
e
miR-223
) poderia ser usado como diagnóstico biomarcadores para CRC. Por outro lado,
miR-19b
e
miR-18a
poderiam ser usados como biomarcadores de diagnóstico para a CP e IBD respectivamente.
Informações de Apoio
S1 Table. O racional para a escolha dos estudados 14 miRNAs com base em referências anteriores
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130.s001
(DOC)
Tabela S2. A expressão diferencial dos miRNAs estudadas no grupo CRC contra o grupo IBD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130.s002
(DOC)
S3 Tabela. A expressão diferencial dos miRNAs estudadas no grupo CP contra o grupo IBD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130.s003
(DOC)
S4 Table. A expressão diferencial dos miRNAs estudadas no grupo CRC feminino versus grupo de controle “Validação Set”
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130.s004
(DOC)
S5 Table. A expressão diferencial dos miRNAs estudado em doentes do sexo masculino CRC contra grupo de controle “Validação Set”
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154130.s005
(DOC)
Reconhecimentos
Nós reconhecemos Yasser Mabrouk Bakr para o seu conselho sobre a análise estatística.