Abstract

neurônios sensoriais fornecer feedback importante para sistemas de motores de geração de padrão. No sistema nervoso crustáceo estomatogástrico (STNS), retorno a partir do receptor anterior gástrica (AGR), um neurónio receptor muscular, molda a actividade de circuitos motores no gânglio estomatogástrico (STG) através de vias que envolvem polissinápticos gânglios anterior. A soma AGR está localizado na parte posterior do nervo dorsal ventricular ao STG e tem sido pensado que seu axônio passa pela STG sem fazer contatos. Usando a microscopia confocal de alta resolução com neurônios cheios de corantes, mostramos aqui que AGR do caranguejo

borealis cancro

também tem projeções locais dentro da STG e que estas projecções formam locais de contato candidatos com neurônios motores STG ou com descendente fibras de entrada de outros gânglios. Nós desenvolver e explorar um novo método de mascaramento que nos permite coloração pré-sináptica e pós-sináptica potencialmente separada de marcadores sinápticos. Os processos AGR no STG mostrar a diversidade na forma, número de ramos e estrutura de ramificação. O número de projecções AGR no STG varia de um a três simples para multiplicar processos ramificados. As projeções vêm em estreito contacto com os neurônios motores gástricos e neurônios descendente e também pode ser acoplado electricamente a outros neurônios do STNS. Assim, para além de vias longo de malha bem descritas, é possível que AGR está envolvido na regulação da integração e padrão directamente no STG.

Citation: Goeritz ML, Bowers MR, Slepian B, Marder E (2013) Projeções Neuropilar do anterior gástrica Receptor Neuron no Stomatogastric gânglio do caranguejo Jonas,

Cancro Borealis

. PLoS ONE 8 (12): e79306. doi: 10.1371 /journal.pone.0079306

editor: Melissa J. Coleman, Claremont Colleges, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de março de 2013; Aceito: 20 de setembro de 2013; Publicação: 03 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Goeritz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por National Institutes of Health conceder NS 17813-32 para Eve Marder. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

feedback sensorial dos receptores musculares molda atividade do neurônio motor em mono e disynaptic ( “short-circuito”) de estiramento ou de resistência reflexos. Além disso, a maioria das vias reflexas tem polysynaptic ( “long-circuito”) componentes que são cruciais para se adaptar reflexos para diferentes estados comportamentais. Na verdade, o feedback sensorial específica de fase de vertebrados e invertebrados neurónios motores durante a actividade motora rítmica podem causar reflexos de inverter ou tornar-se um componente das redes de geração de ritmo-se [1-7].

Os mecanismos subjacentes da integração sensorial durante a modificação reflexo não são totalmente compreendidos. No entanto, muitos aspectos funcionais da integração de feedback, como a inibição pré-sináptica e spiking antidrômica, pode ser ligado às estruturas de motor ou neurônios sensoriais [8]. Examinando a morfologia de um neurónio em detalhe abre a porta para questões interessantes. Como variáveis ​​são as estruturas de neurônios identificados em toda a animais individuais? Que parâmetros devem ser preservadas para manter a função consistente dentro de uma rede? Estas questões são particularmente difíceis de tratar em grandes redes em que a identificação tipo de célula é ambígua e exacerbada por estruturas de ramificação complicada.

Há um grande corpo de evidências de regras distintas que regem os aspectos da morfologia das células durante o desenvolvimento da rede. A distribuição de atractivas e repelentes de moléculas e os respectivos receptores na medula espinal em desenvolvimento pode determinar a posição do soma, a orientação do cone de crescimento axonal, e de passagem da linha média do axónio [9-13]. A forma ea posição do mesmo neurônio no entanto muitas vezes variam de animal para animal, como visto no gânglio crustáceo stomatogastric (STG), onde apenas algumas características do neurônio morfologia são compartilhados entre animais [14-16]. Para entender melhor esses aspectos do neurônio morfologia, aqui vamos examinar um neurônio sensorial na STG que está envolvido em um rico conjunto de vias reflexas, mas tem uma estrutura de ramificação relativamente simples.

redes Ritmicamente ativas nos sistemas nervosos Stomatogastric movimento (STNS) o controle dos músculos do estômago de crustáceos. Durante a atividade moinho gástrico, protração e retração dos dentes estômago é controlada pela coordenação da rede moinho gástrico [17]. Como em lagostas e lagostas, o anterior gástrica Receptor (AGR) em

C. borealis

tem uma soma bipolar, que está localizado no no nervo dorsal ventricular (DVN) ou, menos frequentemente, na parte posterior da STG e projectos para o nervo dorsal gástrica (DGN) [18]. projeto dendrites bilaterais para os dois moinho gástrico 1 músculos (

gm1

), onde picos são iniciadas perto dos

gm1

músculos [19]. Os projectos de axônios AGR em um caminho longo loop através da STG e faz excitatórios e inibitórios conexões no anterior emparelhado gânglios comissural (CPV), com neurônios de projeção que se alimentam de volta para os circuitos motores STG [17,20-24].

A única AGR é um receptor de força muscular em

gm1

músculos. O neurónio AGR integra informação proprioceptiva de ambos os lados do animal, mas também funciona de forma semelhante a um interneurônio influenciando gástrico e actividade de rede pilórica, independente das suas propriedades de receptores [25]. Várias zonas de iniciação pico dendríticas e axonais responder aos diferentes neuromoduladores [21,24-27]. Além disso, neuropeptídeos mudar disparo AGR entre o modo tónico spiking ou modo de ruptura, o que cada ativar um padrão motor gástrica diferente [28]. Trabalho recente tem mostrado que as acções de AGR são influenciados por outros neurónios sensoriais (Barriere et al., 2008) e que os efeitos da AGR disparo dependem quando é activo durante ritmos moinho gástrico (Smarandache et al., 2008).

Até agora, todas essas ações fisiológicas sobre a actividade de rede gástrica e pilórica têm sido atribuídos ao longo ciclo via reflexa polysynaptic através das CPV anteriores. No estudo detalhado da morfologia AGR dentro do STG existe e, até agora, neurópilo não foram descritos projeções no STG. Nós agora fornecer descrições anatômicas de projeções AGR no neurópilo STG.

Métodos

Animais e dissecções

caranguejos Adulto Jonas (

borealis cancro

) foram obtidos a partir de lagosta Comercial (Boston, MA). Todos os animais foram mantidos em tanques de água do mar artificial a 10-13 ° C num 12 horas de luz /12 horas de ciclo escuro sem alimentos. foram anestesiados caranguejos em gelo durante 30 minutos. As dissecções foram realizados como previamente descrito [29] em solução salina fisiológica resfriada constituído por: NaCl 440 mM, KCl 11 mM, MgCl 26 mM

2, CaCl 13 mM

2, 11, de Trizma base mM, 5 mM de ácido maleico, pH 7,45.

Eletrofisiologia

O STNS foi preso em um prato Sylgard revestido. O STG foi desheathed e gravações intracelulares do somata e neurópilo foram feitos com microeletrodos de vidro 12-40 mohms cheios de 0,6M KSO

4 e KCl 20 mM, amplificado com headstages 1x SH e Axoclamp 2A e 2B amplificadores (Molecular Devices) . atividade extracelular foi gravado com eletrodos de pino de aço inoxidável que foram colocados em poços vaselina sobre os nervos motores e amplificado e filtrado com um amplificador diferencial (Am-sistemas). Para a identificação dos neurônios motores, as gravações soma intracelulares foram combinados com gravações extracelular do nervo motor apropriado. Durante a gravação, o STNS foi continuamente superfused com refrigerado (9-13 ° C) solução salina

celular preenche

Somata ou axônios foram preenchidos, quer com:.

a. 2% de sal dipotássico Lucifer Yellow CH (LY; Sigma, número de catálogo L0144) em água filtrada,

b. 4% tetramethylrhodamine-dextrano 3 kDa, lisina solucionáveis ​​(TMR; Molecular Probes, número de catálogo D3308) em 0,2% Kac,

c. 4% neurobiotin traçador (Vector Laboratories) em tampão Tris 50 mM e KCl 0,5 M, ou

d. 10 mM Alexa Fluor sal 568- ou 594-hidrazida de sódio em 200 mM KCl (Molecular Probes, números de catálogo A10441 e A10442).

Para todos os marcadores, as pontas dos eletrodos de vidro de baixa resistência (3-16 mohms) foram preenchidos por capilaridade por 10 minutos. Para TRM, a parte de trás dos eléctrodos foi preenchido com 2M Kac, deixando um pequeno espaço entre a KAc e TMR na ponta. Amarelo Lucifer e Alexa Fluor-hidrazidas foram injectados por 20-50 minutos com impulsos negativos de -3 a -11 NA de duração de 0,5 s em 0,1-1 Hz até que os processos neuropil finas da célula eram visíveis com um microscópio de fluorescência (Leica MF165 FC). TMR e Neurobiotin foram injetados por pelo menos 50 minutos, utilizando 3 NA impulsos positivos atuais (neurobiotin) ou 4-13 nA impulsos positivos atuais (TMR) de duração de 0,5 s em 1 Hz. A menos que indicado de outra forma, as preparações foram fixadas com 3,5% de paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS; NaCl 440 mM, KCl 11 mM, Na a 10 mM

2HPO

4, KH 2 mM de

2 PO?

4 , pH 7,4) durante 40 a 90 minutos à temperatura ambiente no espaço de 3 horas após o enchimento com LY, neurobiotin e TMR e dentro de 30 minutos após o enchimento com Alexa Fluor-hidrazidas. As preparações foram lavados com 0,01 M de PBS-T (0,1-0,3% de Triton X-100 em PBS) e armazenada durante 0-7 dias a 4 ° C antes do processamento.

amplificação tintura

O sinal LY foi amplificado pela adição de um anticorpo anti-LY policlonal de coelho (1: 500; Molecular Probes) e o anticorpo anti-coelho secundário conjugado com Alexa Fluor apropriado ( 1: 500; Molecular Probes) durante o processamento imuno-histoquímico. Neurobiotin foi visualizada por adição de corantes Alexa Fluor estreptavidina conjugada. (1: 500; Molecular Probes) à mistura anticorpo secundário (ver secção seguinte)

Imunohistoquímica

Foi utilizado um anticorpo monoclonal de rato contra o anticorpo da substância P para rotular

borealis cancro

peptídeo relacionado ao taquicinina (CabTRP; Accurate Chemical e Científico, Westbury, NY, # NC1 /34HL, diluição 1: 300) [30,31], um anticorpo monoclonal de rato contra a proteína de Drosophila sinapsina de fusão-GST (SYNORF1, [32]; estudos de desenvolvimento HIBRIDOMA Banco (Univ Iowa), # 5F10, 1:. diluição de 500), e um anticorpo policlonal de coelho contra Amarelo Lúcifer (Molecular Probes, número de catálogo a-5750 , diluição 1: 1000). A especificidade dos anticorpos para sinapsina-like e CabTRP-like imunomarcação em

C. borealis

foi anteriormente demonstrada [30,31,33]. Os anti-soros foram diluídos em 0,01 M PBS-T a uma concentração adequada e aplicada durante a noite à temperatura ambiente, seguido por 6×10 minutos lavagens com PBS-T

Para a detecção secundário, Alexa Fluor -. Os anticorpos policlonais de cabra conjugada contra o rato ou IgG de coelho (cadeias H + L, altamente cruzada absorvido; Molecular Probes) foram usadas para visualizar imunorreactividade. Os anticorpos foram utilizados a uma concentração de 1: 500 em PBS-T durante 2-3 horas à temperatura ambiente. As preparações foram então lavadas 4×15 minutos em PBS. STGs foram então montadas em lâminas pré-limpeza (25x75x1mm, SuperFrost, VWR) em Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), com diâmetro de 9mm, espaçadores de 0,12 milímetros de profundidade de silicone de vedação (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) sob o nº 1.5 lamelas (Fisher Scientific).

Estatísticas

AGR comprimentos de processo foram analisados ​​em Excel (Microsoft). A significância foi testado com testes t em SigmaPlot. Os erros são o desvio padrão.

aquisição e processamento de imagens

pilhas telhados das imagens confocais foram coletadas com um microscópio SP5 CLEM usando Leica Application Suite fluorescência avançada (AF LAS) software. Para vários marcadores, imagens sequenciais e configurações de emissão estreitas foram usadas para evitar conversas cruzadas. imagens confocais foram adquiridos como telhas com um objectivo 63x glicerol (Leica HCX PL APO 63x /1.3 Glyc CORR CS (21 ° C) em 2048×2048 ou 1024×1024 resolução em 0,12 a 1,01 ^ m passos e, posteriormente, alinhados e costurado com uma ferramenta MATLAB baseado em GUI , escrito por Ted Brookings. pilhas de imagem foram convertidos para .IMS arquivos com Imaris 7,0-7,4 (Bitplane) filtrada e down-amostrados a um terço da resolução em dimensões X e y. o Imaris Fatia e superar módulos foram utilizados para ajustar contraste e brilho e exibir pilhas como projeções de intensidade máxima ou como projeções blend mode. Subconjuntos dos z-stacks foram exibidos nas projeções de modo de mesclagem com opacidade reduzida para melhorar a visualização de preenchimentos celulares e distribuição de proteínas, ao mesmo tempo. Filament e do volume reconstruções de preenchimentos de células foram feitas com o módulo Imaris Filament no modo manual para determinar comprimentos dos ramos e volumes de filiais.

Separação de rotulagem sinapsina-like dentro e processos em torno cheios

rotulagem imunorreativo

sinapsina-like dentro processos cheio foi isolado a partir de todo o sinal de sinapsina semelhante usando reconstruções superfície da célula preenchida como uma máscara. As reconstruções superficiais foram realizadas com o módulo de superfície Imaris usando um limiar definido manualmente para a intensidade de distinguir entre o fundo eo preenchimento da célula. A sobreposição da máscara da superfície celular reconstruído eo sinal imunorreactivo sinapsina-like foi salvo como um novo canal de sinal ( “sinapsina-inside”). Para capturar sinapsina-rotulagem como adjacente à célula cheia, este processo foi repetido com uma nova máscara de superfície da célula cheio, desta vez gerado usando um limite mais baixo de intensidade, a captura do “brilho” em torno da superfície da célula. Isto resultou em uma máscara que sobre-estimativa do volume da célula e nos permitiu isolar rotulagem sinapsina semelhante na vizinhança da célula preenchida subtraindo o “sinapsina-dentro” do sinal a partir deste novo canal de sinal, usando o “Canal Arithmetics “função em Imaris.

é importante salientar que uma alta taxa de amostragem durante a aquisição de imagem, o ideal é o dobro da resolução do objectivo usado (taxa de Nyquist), é fundamental para evitar a perda durante a subsequente filtração e permitir suficientemente reconstruções superficiais precisas.

Resultados

projectos AGR na sináptica neurópilo

Foi utilizado corante enche para traçar o axônio AGR e suas projeções no STG. A posição de linha média AGR bipolar na STNS foi previamente descrito (Combes et al., 1995) (Figura 1). A posição do soma, em diferentes preparações é um tanto variável, como a soma pode ser encontrado tanto quanto 500 um posterior à STG no nervo dorsal do ventrículo (DVN) ou ele pode ser visto ventralmente abaixo corpos celulares na região posterior da STG, muito perto da neurópilo STG.

Encontramos projeções AGR do axônio principal para a neurópilo de cada STG que examinamos (N = 29) (Figura 2). imagem confocal revelou projeções AGR com comprimento variável e padrão de ramificação na STG. O número de projecções em AGR neurópilo STG variaram de um a três e a sua morfologia foi notavelmente diverso, variando desde minimamente a complexamente (Figura 2) ramificado. Dos 29 neurônios AGR encheu-dye, 17 tinham um processo de ramificação fora do axônio principal para a neurópilo STG, 10 tiveram dois processos, e em duas preparações, três projeções para o STG foram vistos. características comuns que foram vistos ao longo de muitos preenchimentos de células AGR foram gancho em forma de ramos na parte anterior do gânglio (Figura 2A) (N = 13 dos 23 RAG), ramos que terminaram em processos em forma de garras (Figura 2B) (N = 8 dos 23 RAG), e inchaço bulbosa de processos AGR (Figura 2B) (n = 18 em cada 23 RAG).

As linhas pontilhadas delinear a área de neurópilo do gânglio em todas as partes da figura. A1. vista-rendido volume de LY dye-cheia AGR com uma única projeção, maior ramificação em quatro sub-ramos do neurópilo STG. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 8 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 84 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.067μm x 0.067μm x 0.378μm). barra de escala é 30 um. A2 mostra close-up da área de box na A1, que mostra a extremidade mais larga da projeção AGR dentro da STG. barra de escala é 5m. B1. vista-rendido volume de LY dye-cheia AGR com uma única projeção, maior ramificação em duas sub-ramos curtos no neurópilo STG. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 4 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 226 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.174μm x 0.174μm x 0.294μm). barra de escala é 30 um. B2 mostra uma projeção de superfície-rendido volume da área de box em B1 a partir de um ângulo diferente, enfatizando a grande alargamento parecido com balão (não a soma) da projeção AGR axonal. barra de escala é de 10 um. view C. Volume-rendido do LY dye-cheia AGR com uma única projeção, maior ramificação em duas sub-ramos no neurópilo STG. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 5 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 169 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.068μm x 0.068μm x 0.462μm). barra de escala é 30 um. view D. Volume-rendido do LY dye-cheia AGR com duas projeções simples no neurópilo STG. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 18 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 115 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.183μm x 0.183μm x 0.504μm). barra de escala é 30 um. vista E. Volume-rendido do LY dye-cheia AGR com duas projeções, cada ramificação ainda mais em duas ou três sub-ramos do neurópilo STG. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 10 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 264 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm), vista ventral da mesma preparação como Figura 3. Barra de escala é 30 um. vista F. Volume-rendido do LY dye-cheia AGR com três projeções, um deles maior ramificação em duas sub-ramos no neurópilo. A soma AGR está localizado no

STN

fora do canto inferior esquerdo do quadro. modo de mistura projeção de 9 fundiu pilhas de imagens confocal, cada uma composta de 229 fatias ópticos (adquiridos na resolução de 0.168μm x 0.168μm x 0.252μm). barra de escala é de 50 um.

Nós medimos as características de ramificação em 17 RAG que foram fotografadas em alta resolução (Tabela 1). Em preparações com apenas uma única ramificação do axónio AGR principal, o processo ramificada, em média 3 vezes. O seu comprimento varia entre preparações e uma média de 240 ± 136 pM (desvio padrão) (Figura 2A-C). O número de segmentos terminais foi de 1,7 ± 0,8. processos AGR com duas projecções no neurópilo tenderam a ser mais curto em média (176 ± 95,4 uM para o primeiro, p = 0,014, e 109 ± 94,41