Abstract

anomalias de sinal em células humanas costumam causar consequências inesperadas para a saúde individual. Nós focar estes tipos de eventos envolvidos nas vias de sinal de JAK-STAT, principalmente as desencadeadas por STAT3 aberrante activado, uma oncoproteína que participa em processos essenciais de sobrevivência celular, o crescimento e proliferação de muitos tipos de tumores, bem como doenças imunes. Ao estabelecer um sistema de triagem de drogas de alto rendimento com base sinal de STAT3 em células A549 câncer de pulmão humano, temos selecionados de uma biblioteca de produtos naturais que continham compostos purificados a partir de ervas medicinais. Um composto, chamado Brevilin A, exibiu tanto forte inibição do sinal STAT3 e STAT3 sinalizar inibição do crescimento celular dependente. Outras investigações revelaram que Brevilin A não só inibe a sinalização STAT3 mas também STAT1 sinalização para citocinas fosforilação da STAT3 e STAT1, bem como a expressão dos genes alvo induzidas. Além disso, encontramos Brevilin A pode atenuar a actividade de JAK, bloqueando o domínio de cinase JAK tirosina JH1. Os níveis de citocina induzida fosforilação de estatísticas e outros substratos foram drasticamente reduzida pelo tratamento de Brevilin A. Os papéis de Brevilin Uma segmentação em JAKs actividade indicam que Brevilin A não só pode ser usado como um inibidor de STAT3, mas também um composto de bloqueio outra JAK- hiperativação STAT. Assim, estes resultados forneceram um forte impulso para o desenvolvimento de inibidores de JAK-STAT seletivos e drogas terapêuticas para melhorar a sobrevida de pacientes com JAK hyperactivated e estatísticas

Citation:. Chen X, Du Y, Nan J, Zhang X, Qin X, Y Wang, et al. (2013) Brevilin A, um romance de Produtos Naturais, inibe a Janus Kinase Actividade e Blocos STAT3 sinalização em células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10.1371 /journal.pone.0063697

Autor: Mark Jackson, Case Western Reserve University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de novembro de 2012; Aceito: 05 de abril de 2013; Publicado em: 21 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações 1104FK CA123 de O Projeto de Apoio a Ciência e Tecnologia de Gansu Providência para QW; 2009DFA30990 do Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China, 0708WCGA149 do Gansu Provincial da Ciência e Tecnologia e 2009AA01A130 da National Natural Science Foundation da China para J.Y. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O contorno da via de sinalização JAK-STAT foi concluída há quase 20 anos [1]. Mais estudos foram, em seguida, continuou por detalhes de sinal incluindo interações proteína, pós-modificações, regulamentos de transcrição e efeitos fisiológicos. A família Janus quinase (JAK) contém quatro membros da tirosina quinase, incluindo JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2, que transdução de sinais induzida por citocinas através de transdutores e ativadores da transcrição (Stats) de sinal. Normalmente, JAK receptores associados foram activadas por dimerização do receptor, na presença de citocinas. Enquanto isso STAT no citoplasma foram recrutados para os receptores e fosforilada por JAK. STAT fosforiladas de tirosina homo- ou heterodímeros formados através de interacções fosfotirosina-SH2, e translocado para o núcleo para iniciar a transcrição de genes alvo [2]. actividade anormal de sinais de JAK-STAT tem sido considerado como ligação para muitas doenças, incluindo cancros e doenças imunológicas. aberrado actividade STAT geralmente correlaciona-se com vários tipos de crescimento do tumor, e a progressão de diversos tumores malignos do cancro, tanto em resposta a citoquinas e por proteína tirosina quinases mutantes. Dos membros da família de sete STAT (STAT1-STAT6, com dois genes independentes STAT5A codificado e STAT5b), STAT3, bem como STAT5 em certa medida, são mais frequentemente activados em uma porção tumores sólidos humanos e leucemias [3] – [5 ].

Em muitos STAT3 constitutiva activado células cancerosas, ou células tumorais humanas cultivadas ou mouse modelos gerados, bloqueando a sinalização STAT3 vai inibir o crescimento celular, induzir a apoptose e reduzir a metástase das células. Em glioma ou células de glioblastoma [6], [7], células de carcinoma da mama [8], cancros do cólon [9], derivada de células de tumores epidermóides [10], células de cancro da próstata [11] – [13] e melanomas [14], [15], tendo como alvo a interrupção da actividade de STAT3 por ARN interferentes, expressando formas STAT3 dominante negativo ou a aplicação de inibidores da sinalização específicas seria extremamente baixo regular STAT3 genes induzidos, incluindo CyclinD1, Bcl-XL, c-Myc, survivina e outros genes de regulação dos ciclos celulares e proliferação celular, e então, subsequentemente, reduzir o crescimento celular e intensificar a apoptose de células [16], [17]. A metástase é a principal causa de mau prognóstico e mortes relacionadas com o Caner comparação com génese do tumor e crescimento neoplasia. STAT3 agora tem sido considerada como uma das oncoproteínas críticas mediadoras regulação da invasão de células e microambiente do tumor. No cancro colorectal humanos, STAT3 foi ativado em quem tem mau prognóstico [18]. As proteínas envolvidas na migração e invasão de células cancerosas, como metaloproteinases de matriz (. MMP-1, MMP-2, MMP-10,

etc) e da torção, foram regulados por activação da STAT3 [19] – [21] . Uma induzida sinalização /STAT3 IL-6 JAK era essencial para a infiltração de células cancerosas circulantes. Tumor derivado de IL-6 ajuda circulando carcinoma da mama e melanoma para restabelecer

in situ

ou pelo regiões metástases à distância [22]. Recentemente, foi relatado que a STAT3 persistentemente activados mantida a actividade de NF-kB através de vias mediadas P300. atividade de NF-kB dramaticamente diminuiu STAT3 RNAi em muitas células STAT3 constitutivos ativados câncer [23], o que sugere que os inibidores da STAT3 também podem desempenhar papéis potenciais para bloquear a actividade de NF-kB e aumentando a inibição do crescimento nestas células cancerosas.

explorando inibidores de sinal JAK-STAT especialmente os inibidores STAT3 por alto throughput screening de droga (HTS) é uma forma eficiente em descobrir potenciais drogas específicas dirigidas em STAT3 ou a montante JAK quinases.

Meu N. Chau

e seus colegas desenvolveram uma linha de células de câncer de próstata, que continha um repórter STAT3 construir para triagem de alto rendimento de ativadores e inibidores da STAT3 [24]. Aqui, estabelecido um sistema de análise semelhante com base sinalização STAT3 repórter de luciferase num A549 linha celular de cancro de pulmão humano, que mostra actividade de STAT3 activado constitutivo e pode ainda ser induzida por citocinas como a IL-6, EGF e HGF [25]. Pela triagem, Brevilin A, um novo produto natural, mostraram inibição de sinalização JAK-STAT significativo sem toxicidade celular imediato-direta de mais de 1.400 compostos que foram originalmente isoladas de plantas, a maioria dos quais eram conhecidos como remédios de ervas. Um Brevilin preferiu a inibição do crescimento de células de DU145 e MDA-MB-468, estes tumores dependem da sinalização STAT3 [17], [26]. Outras investigações revelaram que a actividade de Brevilin Um domínio de tirosina-quinase Janus Kinase JH1 bloqueados, e, em seguida, reduzida fosforilação de efectores a jusante. Brevilin A pode agir como uma droga potencial alvo em doenças causadas por anormalidades JAK-STAT.

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

Os anticorpos contra STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-Akt, pSer9-GSK-3β, c-Myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-TYK2, pSer536-p65 e p65 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology; Anticorpos contra c-Src, pTyr (PY99), GAPDH e His-tag foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, Inc .; vetor pGL4.20 e substrato de luciferase constante Glo foram obtidas da Promega; M-MLV kit de síntese de ADNc de primeira cadeia foram obtidos de Invitrogen, Life Technologies Corporation; grânulos PD180970, AG490, estaurosporina, doxorrubicina, ATP e EZView vermelho M2 anti-FLAG afinidade foram adquiridos de Sigma-Aldrich; A interleucina-6 (IL-6), α interferão (IFN) e γ interferão (IFNy) foi de PeproTech. Ni + pérolas de cromatografia de afinidade

foram obtidos a partir da GE Healthcare Life Sciences. 10 × tampão de quinase PK foram obtidos a partir de New England Biolabs (NEB).

Plasmids e linhas celulares

Uma sequência contendo 16 × SIE plus com uma caixa TATA foi inserido pGL4.20 entre KpnI e HindIII. A construção SIE-Luc-puro foi transfectado em células A549 de linha. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram seleccionadas com 5 ug /ml de puromicina para a 2 semanas, em seguida, com 2,5 ug /ml durante mais 2 semanas. Os clones foram apanhados e analisados ​​separadamente. As sequências que codificam domínio JAK1-JH1 humana, domínio JAK2-JH1, domínio JAK3-JH1, domínio Tyk2-JH1 e c-Src foram clonados em PLV-SV40-puro vector de expressão de lentivírus separadamente. sequências adicionais de Bandeira-sua dupla marcas foram fundidos no C-terminal de cada domínio JAK-JH1. c-Src foram fundidos com marcador Flag único na extremidade C-terminal. Cada uma das construções acima foi transfectado em HEK293T combinado com PMD-2, g e pCMV-dr8.74 vetores auxiliares para embalagens vírus. meios sobrenadante foi recolhido após 48 horas e usados ​​para infectar HEK293T durante a noite, em seguida, substituído por meio fresco durante mais 24 h. agrupamentos de células estáveis ​​foram seleccionadas na presença de puromicina (2,5 ug /mL) durante 7 dias.

Cultura celular

As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10% ( FBS), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml).

rastreio de drogas

Os produtos naturais para a seleção da droga eram de Composto National Resource Center (O fornecedor biblioteca original para este instituto foi BioBioPha Co., Ltd.). Os compostos de produtos naturais (10 mm) foram diluídas com meio DMEM (10% de FBS) a 100 uM (Compostos diluído). A549R células para o rastreio de drogas foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 (100 ul /cavidade em DMEM com FBS a 10%). Os compostos Doze horas mais tarde, 25 ul diluída com 75 ul de DMEM fresco (10% de FBS) foram adicionados a cada separaram-se bem durante mais 24 h para o

r rastreio rodada na concentração de 25 uM 1. 12,5 ul Os compostos diluiu-se com 87,5 ul de DMEM fresco foram adicionados para o rastreio rodada 2

ND na concentração de 12,5 | iM. DMSO foi usado como veículo (0,25% em 1

st triagem redonda e 0,125% em 2

nd triagem e volta). IL-6 (250 ng /ml) e PD-180970 (250 nM) foram utilizados como estimulador conhecido inibidor e verificar a resposta do sistema para cada ronda de rastreio de uma única placa. A resposta do sistema seria considerado normal quando IL-6 induz mais de 2,5 fluorescência vezes e PD-180970 mostra 40% -50% de inibição de fluorescência em cada triagem rodada. Foi utilizado um counterscreen assumindo que o PD-180970 inibidor conhecido tem inibição sinal significativo e potenciais inibidores sempre teria um melhor desempenho do que o PD-180970. Uma vez que o controlo positivo PD-180970 (250 nM) sempre mostrou uma proporção de fluorescência aproximada a 50% e pode inibir a fosforilação STAT3 significativamente quando julgado por análise de Western-Blot, optamos por 50% como um “cut off” de valor, em seguida, qualquer composto que exibe uma relação de fluorescência das células controle ≤50% (

ou seja

fluorescência inibição ≥50%) será escolhido. Os detalhes são resumidas como segue: Etapa 1, 1

triagem rodada st, Um bem-One composto, 25 mM, ensaio de luciferase somente. Os compostos foram escolhidos sempre FR (Rácio de fluorescência) é ≤50%. Após este passo, os compostos escolhidos podem incluir alguns dos mais excessivamente tóxicas. Para descartar a inibição de fluorescência causada por citotoxicidade, Passo 2 foi aplicado. Passo 2, 2

ND rastreio redondo, 12,5 | iM de cada composto a partir do Passo 1, e duas repetições de ensaios de luciferase e de MTT foram aplicados. Se FR% é ≤50% Δ (CV% – FR%) é ≥30%, os compostos serão escolhido para análises posteriores. Os compostos excessivamente tóxicas foram excluídos por este passo. O desvio “30%” é um valor empírico de que era capaz de distinguir compostos excessivamente tóxicas e compostos específicos. Aqui, FR, Fluorescência Ratio = valor de fluorescência de bem tratados dividido pelo valor de fluorescência de controle de poço; CV, a viabilidade das células = valor de sobrevivência celular de bem tratados dividido pelo valor de sobrevivência celular de controle de poço; ensaio de luciferase foi realizada por fluorescência Valor; ensaio de MTT foi realizado para celular Survival Value. (Percentagem de inibição da fluorescência = 100% -% FR; Percentagem de inibição do crescimento celular = 100% -% CV).

Para o ensaio de luciferase, foram adicionados 50 ul de substrato de luciferase constante Glo (50 uL /​​poço) . Após 10 minutos de incubação, a fluorescência foi medida por Vector3 Multilevel placa de contra-(Perkin Elmer). Para o ensaio de viabilidade celular MTT, 20 ul de solução de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado durante 4 horas de incubação. Os cristais resultantes foram dissolvidos em 100 ul de DMSO e a intensidade de absorvância foi medida por Vector3 a 490 nm de comprimento de onda.

Western-Blot, imunoprecipitação e coloração celular

As células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo por três vezes e foram lisadas com tampão de lise RIPA durante 30 minutos a 4 ° C (150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 7,5, 5 mM de EDTA, 1 mM de EGTA , um cocktail de inibidor de protease × (Roche), 1 × cocktail inibidor de fosfatase (Roche)). Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 × rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Quantidades iguais de proteínas, determinado pelo método BCA (Pierce, Thermo), foram então separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Merck). As proteínas foram detectadas com anticorpos indicados.

células HEK293T expressando Src Bandeira com etiquetas foram pré-tratadas com DMSO, PD180970 (500 nM) e Brevilin A (15? M) durante 4 horas separadamente. As células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo por três vezes e foram lisadas com 500 ul de tampão de lise (50 mM Tris HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100 a pH 7,4) na presença de mistura de inibidores de protease e fosfatase cocktail inibidor. Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 × rpm durante 10 minutos a 4 ° C. Quantidades iguais de proteínas por métodos BCA, em seguida, foram incubados com esferas M2 anti-FLAG afinidade para 8 horas a 4 ° C. As amostras de proteína foram eluídas com Src M de glicina-HCl, pH 3,5 e neutralizado com Tris-HCl (0,5 M, pH 7,4) 0,1.

Para o ensaio de apoptose, as células foram plaqueadas em placas de 24 poços. Doze horas mais tarde, o meio foi removido e substituído com meio fresco, na presença de 10 uM Brevilin A durante 24 h. As células foram então submetidas a um processo de coloração dupla com Anexina-V-PI como no protocolo de anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime Instituto de Biotecnologia).

e Purificação de Proteínas Cinase Ensaio

C-terminal da proteína recombinante hSTAT3 marcada com His foi expressa em

E.coli

,

Rosetta

e purificada por Ni

cromatografia de afinidade +.

hSTAT3

CDS foi clonado em pET28b, e induzida por mM de isopropiltio-galactósido β-0,5 a 37 ° C durante 6 h. Os corpos de inclusão foram centrifugadas a 12000 × rpm durante 10 minutos a 4 ° C após o tratamento ultra-sons em

inteiros. Em seguida, os corpos de inclusão foram lisadas com tampão de lise (0,5 M de NaCl, fosfato de sódio 20 mM, imidazol 20 mM, ureia 8 M, pH 7,5). Ni grânulos

cromatografia de afinidade + foram então usados ​​para a ligação desdobrado marcada com His hSTAT3. Na coluna de redobragem foi escolhido e, finalmente, a proteína STAT3 redobrada foi eluída por tampão de eluição (NaCl 0,5 M, fosfato de sódio 20 mM, imidazol 250 mM, pH 7,5). Depois de um processo de permuta iónica, a proteína da hSTAT3 purificado em PBS (10% de glicerol) foi congelado para análise posterior.

aproximado de 5 × 10

8 células HEK293T que expressam Bandeira-His Tyk2-JH1 foram colhidas e lisadas com tampão de lise (0,5 M de NaCl, fosfato de sódio 20 mM, imidazol 20 mM, pH 7,5). Ni

+ cromatografia de afinidade contas foram então usadas para a ligação Bandeira-His-marcado Tyk2-JH1. A proteína foi eluida com imidazole 250 mM e diluiu-se com tampão de ligação esferas M2 anti-FLAG de afinidade e incubadas com esferas M2 de afinidade durante 2 h a temperatura ambiente. proteína Tyk2-JH1 foi finalmente eluído com PBS contendo 3 × péptido FLAG (500 ng /ml, 30 min à temperatura ambiente) para posterior ensaio de cinase.

aproximado de 150 ng de proteína da hSTAT3 e 20 ng Tyk2-quinase foram JH1 pré-incubados com 1 × tampão de quinase, na presença de uma série de concentração de 10, 20, 40, e 80 uM, durante 10 min. ATP foram adicionados para a reacção a uma concentração de 200 uM a 50 uL de volume finalmente. A reacção da cinase foi então continuada a 37 ° C durante 2 h, e foi parado por 5 × proteína tampão de carregamento da amostra (95 ° C, 5 min). 20 ul de cada amostra foi carregada para SDS-PAGE e Western-Blot análise.

RT-PCR quantitativo e em tempo real de PCR

ARNm total foi extraído de células cultivadas com o kit de purificação de ADN TianGen . A transcrição reversa foi realizada com o kit de transcrição reversa M-MLV (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Quantitativa PCR em tempo real foi terminado com kit mix Roche de Cyber ​​Verde PCR em Biorad C1000 Termociclador. Os pares de iniciadores para RT-PCR eram como se segue:

GAPDH

directo 5′-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 ‘, reverso 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3’;

SOCS3

directo 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3 ‘, reverso 5′-CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3’ [27];

IRF-1 | forward5′-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 ‘, reverso 5′-TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3’ [28].

Análise de Dados e Métodos Estatísticos

Cada análise foi repetida conforme indicado. viabilidade celular relativa foi expressa como uma percentagem (%) em relação às células de controlo não tratadas. As barras de erro representado o desvio padrão (± DP). Os dados foram analisados ​​pelo método de análise de variância para cada testes de comparação de dois grupos. Blot e intensidade de sinal de imagem foi quantificada utilizando software ImageJ2X. P-STAT3 e p-p65 alterações dobra foram normalizados para STAT3 total e p65, respectivamente, enquanto p-AKT e p-GSK-3 mudanças foram normalizados para GAPDH.

SOCS3

e

IRF-1

alterações de nível de mRNA foram normalizados para o total de

GAPDH

mRNA. Quantificação números são representados na parte inferior das manchas. Fold mudanças de Anexina-V fluorescência foram normalizados por contagem de células. IC

50 (GI

50) foi calculada pelo software SPSS19 (método de regressão-probit). Histogramas e diagramas foram desenhados com Origin 8 software.

Resultados

Estabelecimento de STAT3 sinalização com base de alto rendimento do sistema de triagem de drogas.

As células A549 foram transfectadas com luciferase vector repórter, SIE-luc-puro, que contém elementos repetidos resposta STAT3 (16 × SIE, sis-inducible element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Fig. S1). A549R linha celular estável a partir de um único clone foi escolhido em seguida. Este clone foi capaz de resposta a ambas as citocinas e inibidores envolvidas na sinalização STAT3 (Fig. 1A). A IL-6 induzida por cerca de 5 × fluorescência dobra, e PD-180970 tratamento mostrou que cerca de 50% de inibição da actividade da luciferase. as concentrações de IL-6 e PD-180970 para tratamentos não afectado significativamente o crescimento de células (Fig. 1B). PD180970, o conhecido inibidor de Src quinase, foi capaz de inibir actividade STAT3, em parte, na linha de células A549 como descrito [25] (Fig. 1C).

luciferase (a) e de MTT (B) Os ensaios de células A549R tratados com PD-180970 (250 nM) e IL-6 (250 ng /ml), respectivamente. A549R células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 (100 ul /cavidade em DMEM com FBS a 10%). Doze horas mais tarde, os meios foram removidos e substituídos . com meio fresco, na presença de IL-6 ou PD-180970 barras mostram o desvio padrão (± SD) (três repetições independentes, n = 5 em cada repetição) *** p . 0,001, ** p 0,01, * p 0,05, significativo em relação ao veículo de controlo. NS, sem significância estatística. (C) PD-180970 inibe a actividade da STAT3 em células A549R. A549R células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 100 mm em 70% de confluência. Em seguida, as células foram tratadas com PD-180970 (250 nM) durante 24 h. DMSO foi usado como controle.

Identificação de Brevilin A, tal como um inibidor de sinalização STAT3

Compostos (1.440 no total) a partir de produtos naturais (Tabela S1) foram rastreados como descrito em

Materiais e Métodos

. No rastreamento round 1

st, também considerado como uma triagem áspero, foi utilizado um composto e um estratégia bem na concentração de 25 mM. Nove compostos mostraram% de inibição de mais de 50 fluorescência (Tabela S2, valores em vermelho). No 2

ND rastreio redondo, 12,5 uM compostos foram escolhidos para posterior ensaio de luciferase, bem como para o ensaio de viabilidade celular MTT adicional. Apenas um composto, chamado Brevilin A (Fig. 2A, um sesquiterpeno pseudoguaiane de

Litsea glutinosa

, as informações fornecidas pelo fornecedor original) ainda mostrou que mais de 50% de inibição de fluorescência, enquanto que exibiu um desvio (mais de 30% ) entre a viabilidade celular (CV) e taxa de fluorescência (FR). Nós especulamos que os inibidores específicos de sinal deve exibir mais de inibição do sinal de inibição do crescimento celular dentro de 24 horas, e no 2

nd triagem rodada, se FR% é ≤50% andΔ (CV% – FR%) é ≥30%, os compostos serão escolhido para análises posteriores (Tabela S3). Dos 9 compostos de uma triagem rodada

st, única Brevilin A conheci esses critérios (Fig. S2). Parecia que poderíamos obter mesmos resultados avaliando escores Z no 1

st rodada de triagem (Tabela S4). De transferência de Western mostrou ainda que Brevilin Um bloqueados STAT3 tirosina fosforilação 705, na concentração de 12,5 e 25 referidos ^ M durante 24 h tratamento em células A549R (Fig. 2B). inibição de sinal e a viabilidade das células foram então analisadas por luciferase e ensaio de MTT em concentrações em série de Brevilin Um tratamento após 24 h (Fig. 2C). Brevilin Um exibiu melhor STAT3 sinalização de inibição de uma forma dependente da dose (IC

50 = 10,6 pM) do que a inibição da viabilidade celular em 24 h (GI

50 20 uM), indicando que é um sinal específico inibidor mais do que um composto que mata diretamente as células cultivadas com base em toxicidade celular. Então, nós escolhemos as concentrações de cerca de 10 mm para análises posteriores.

(A) Estrutura do Brevilin A. (B) Brevilin A inibe a fosforilação STAT3 em células A549R. A549R células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 100 mm em 70% de confluência. As células foram então tratadas com Brevilin A (12,5 uM e 25 uM) durante 24 h. DMSO foi usado como controle. (C) de sinalização STAT3 foi inibida por Brevilin A numa forma dependente da dose. A549R células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 (100 ul /cavidade em DMEM com FBS a 10%). Doze horas mais tarde, o meio foi removido e substituído com meio fresco, na presença de Brevilin A a diferentes concentrações durante mais 24 h (20 uM, 17,5 uM, 15 uM, 12,5 uM, 10 uM, 7,5 uM, 5 uM, 2,5 uM e 1 | iM). Os ensaios de luciferase e, em seguida, foram realizadas MTT. As barras mostram o desvio padrão (± SD) (3 repetições independentes, n = 5 em cada repetição).

Brevilin A inibe activado constitutivamente-STAT3 Impulsionada DU145 e MDA-MB-468 células

carcinoma prostático humano DU145 e cancro da mama MDA-MB-468 linhas celulares apresentou atividade STAT3 constitutiva. Em seguida, perguntar se Brevilin A poderia inibir a atividade da STAT3 nestas duas linhas celulares. A Figura 3A e B indicou que Brevilin A inibe a sinalização STAT3 na dose e modo dependente do tempo em ambos DU145 (Fig. 3A) e MDA-MB-468 (Fig. 3B). Para testar a inibição específica do sinal, foram analisados ​​os níveis de fosforilação da p65-Ser536, Ser473 e AKT-GSK-3β-Ser9. Curiosamente, Brevilin A não exibem efeitos correspondentes na fosforilação destas proteínas (Fig. 3A, 3B e 3C), indicando que Brevilin A não podem afectar ou tem menos efeitos sobre outros sinais celulares. A inibição da actividade de STAT3 conduz geralmente a infra-regulação de genes alvo,

por exemplo.

, C-Myc e CyclinD1 [17]. Aqui, depois tratou-se com Brevilin A durante 24 h e 48 h, tanto c-myc e CyclinD1 reduzida em células DU145 e MDA-MB-468 (Fig. 3D). O aumento da PARP clivada foi também observada (Fig. 3E), indicando que Brevilin Um induzida DU145 e MDA-MB-468 a apoptose depois de 24 h de tratamento [29]. É consistente com os relatos de que bloqueando a actividade da STAT3 conduziu à inibição do crescimento de células DU145 em [30] e células MDA-MB-468 [31]. Em seguida, a viabilidade das células foi medida para as células DU145 e MDA-MB-468, bem como os fibroblastos não-transformadas humanas imortalizadas por telomerase células BJ (hTERT-BJ, uma linha celular normal imortalizada). células hTERT-BJ tinha menor actividade STAT3 (Fig. 4A) e, portanto, foram utilizados como células de controlo negativo. Depois tratou-se com Brevilin A durante 24 h, 48 h e 72 h, Brevilin Um mostraram inibição do crescimento de células mais significativo sobre DU145 e MDA-MB-468 de hTERT-BJ, tanto a 5 uM e uma concentração de 10 uM (Fig. 4B, esquerda e meio). Vários outros compostos, os mecanismos de que foram conhecidos na viabilidade celular, foram escolhidos como controlos. AG490, um inibidor de JAK, poderia inibir a JAK-STAT sinalização crescimento celular dependente (

por exemplo, DU145 e MDA-MB-468.); A estaurosporina, o qual é um inibidor da quinase de tirosina conhecidos pan-[32], inibe muitos processos celulares e, normalmente, não apresenta especificidade tipo célula; A doxorrubicina, um composto amplamente utilizado, é capaz de induzir a apoptose das células e crescimento das células do bloco [33]. Ao comparar os efeitos na viabilidade celular entre DU145, células MDA-MB-468 e hTERT-BJ após 24 horas de tratamento da droga (Fig. 4B, o histograma direita), AG490 mostra efeitos semelhantes (com Brevilin A) nestas células, enquanto Doxorrubicina Estaurosporina e não tinha especificidade sobre a viabilidade celular ou crescimento entre estas células. Outras investigações por coloração com anexina-V revelaram que Brevilin Um exibiu uma forte indução de apoptose para DU145 e MDA-MB-468 (cerca de 2,2 e 4,4 vezes, respectivamente) do que o da hTERT-BJ (~1.3 vezes) após 24 horas de tratamento (Fig. 4C).

tirosina de STAT3 705 fosforilação foi inibida por Brevilin a em dose (5 uM, 10 uM e 15 uM de 2 h) e o tempo (10 uM durante 30 min, 60 min e 120 min) modos dependentes em ambos DU145 (a) e MDA-MB-468 (B) células, ao passo que a fosforilação da p65-Ser536 (a e B), AKT-Ser473 e GSK-3β-Ser9 (C) não foi afectada de modo correspondente (10 uM, 2 h). (D) c-Myc e CyclinD1 diminuiu após 24 h e 48 h de tratamento com Brevilin A (10 mM). As células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 100 mm durante 12 h, em seguida, foram tratados com Brevilin A, tal como descrito. (E) Clivadas PARP aumentada em DU145 e MDA-MB-468 células com Brevilin A (10 fiM) durante 24 horas de tratamento. DMSO foi usado como controle.

(A) de tirosina de STAT3 705 fosforilação foi detectada em hTERT-BJ, DU145 e células MDA-MB-468. (B) Esquerda e diagramas do meio, hTERT-BJ, DU145 e MDA-MB-468 células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 8 x 10

3 (100 ul /cavidade em DMEM com FBS a 10%) . Doze horas mais tarde, os meios foram removidos e substituídos com meio fresco, na presença de Brevilin A (5? M e 10? M) durante 24 h, 48 h e 72 h, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. histograma direita, 12 horas mais tarde as células foram plaqueadas, os meios foram removidos e substituídos com meio fresco, na presença de Brevilin A (10? M), AG490 (100 uM), doxorrubicina (1 uM) e estaurosporina (100 nM e 500 nM) durante 24 h. Dox, doxorrubicina. Sta, estaurosporina. As barras mostram o desvio padrão (± DP) (3 repetições independentes, n = 3, em cada repetição). *** P 0,001, ** p 0,01, * p 0,05. NS, sem significância estatística. (C) As células foram plaqueadas em placas de 24 poços. Doze horas mais tarde, o meio foi removido e substituído com meio fresco, na presença de 10 uM Brevilin A durante 24 h. DMSO foi usado como controle. As células foram então submetidas a um processo de dupla coloração com anexina-V-PI. programa de exposição mesma foi utilizada em cada comprimento de onda.

Brevilin de blocos de citocinas induzida STAT Signaling

As citocinas, como interleucinas e interferons, normalmente induzem ativação STAT3 através da via JAK-STAT canônico. Tem sido relatado que a STAT3 foi activado em DU145 e MDA-MB-468 de IL-6 através de alças autócrinas [34], [35]. Aqui, na presença de tratamento adicional de IL-6, verificou-se que Brevilin A poderia inibir a activação da STAT3 em resposta à indução de IL-6 em HEK293T, células HeLa e HepG2 (Fig. 5A). Para testar se esta inibição por Brevilin A foi envolvido em outras citoquinas mediada por activação da STAT3, foram usadas IFNy e IFNa. Resumidamente, a IL-6 induz a activação da STAT3 através da via IL6R-gp130-JAK [36], enquanto que IFN-y e IFN-lo induzida por activação de Tipo II e Tipo I- receptor de interferão-JAK via, respectivamente [37]. Após o pré-tratamento de Hela com Brevilin A, Tyr705 fosforilação da STAT3 foi significativamente inibida, como esperado (Fig. 5B). Transcrição de

SOCS3

(supressor de citocina proteína 3 sinalização) gene é regulada pela ativação STAT3 diretamente em resposta a citocinas como IL-6 [38], de modo que o nível de mRNA de

SOCS3

geralmente reflete a actividade de transcrição da STAT3. Mediu-se o nível de ARNm de

SOCS3

em resposta a IL-6 com ou sem um pré-tratamento Brevilin por RT-PCR em células HEK293T, HeLa e HepG2. Um Brevilin STAT3 mediada inibida

SOCS3

transcrição em todas estas células dramaticamente (fig. 5c). Real-time PCR resultados mostraram uma redução aproximada de 70% de

SOCS3

ARNm depois tratada com Brevilin A na presença de IL-6 em células HEK293T (Fig. 5D).

As células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 100 mm durante 12 h, em seguida, os meios foram removidos e substituídos com meio fresco sem soro durante mais 12 h. Um Brevilin (10 uM) foi adicionado durante 30 minutos de pré-tratamento, em seguida, as células foram tratadas com IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) e IFNy (1500 U /mL) durante 2 h. fosforilação STAT3 foram então analisadas por Western-Blot (A e B). (C) As células foram plaqueadas e cultivadas em placas de 100 mm durante 12 h, em seguida, o meio foi removido e substituído com meio fresco sem soro durante mais 12 h. Brevilin A foi adicionada, durante 30 min de pré-tratamento (HEK293T, 10 uM; HeLa e HepG2, 15? M), em seguida, as células foram tratadas com IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) e IFNy (1,500 L /ml) durante 4 h.

SOCS3

ARNm foram analisadas por RT-PCR. (D) em tempo real A análise de qPCR

SOCS3

ARNm em células HEK293T tratados com Brevilin A na presença de IL-6 (250 ng /ml). (E) Brevilin A inibe IFNa e de IFN-y induzida por JAK2 e Tyk2 fosforilação, respectivamente, bem como STAT1 fosforilação da tirosina em células HeLa tratadas como em (B). (F)

IRF

ARNm foram analisadas por RT-PCR em células HeLa na presença de IFNa tratamentos como descrito acima.

Brevilin Um Blocos Janus Kinase Activity

Desde Brevilin a poderia inibir JAK2 e Tyk2 fosforilação em resposta ao IFN-y e IFN (Fig. 5E), que, em seguida, testou os efeitos de Brevilin Um na sinalização STAT1. Os resultados indicam que a fosforilação de STAT1 e do seu gene alvo

IRF1

foram diminuída na presença de um Brevilin após a indução de citoquina (FIG. 5E e 5F). Estas características revela que os alvos potenciais inibidores directos de Brevilin A pode localizar a montante da sinalização STAT3 e STAT1.