Abstract

Análise integrada de mudanças nível genómico e transcriptomic é uma promessa para uma melhor compreensão do câncer colorretal (CRC) biologia. Existe uma necessidade pertinente para explicar o efeito funcional das alterações do nível do genoma, integrando a informação, ao nível de transcrição. Usando alta gama citogenética resolução, tivemos genes driver anterior identificadas por «Identificação Genomic de Metas significativas em Câncer (GISTIC)” análise de amostras de tumores do normal emparelhados de doentes com cancro colorectal. Neste estudo, analisamos esses genes motorista em três níveis usando dados de matriz de exão – gene, exões e de rede. análise de nível Gene revelou um pequeno subconjunto de experimentar expressão diferencial. Estes resultados foram reforçadas através da realização de análises de expressão diferenciais separados (SAM e limma). ATP8B1 foi encontrado como sendo o novo gene relacionado com o CRC que mostra mudanças nos níveis de citogenética, genes e exão. foi encontrado o índice de splicing de 29 exões correspondentes a 13 genes para ser significativamente alterada em amostras de tumor. genes motorista foram utilizados para construir redes de regulação para grupos tumorais e normais. Havia rearranjos de genes do factor de transcrição, sugerindo a presença de comutação de regulamentação. O padrão de regulação do gene AHR foi encontrada para ter a alteração mais significativa. Nossos resultados integrar dados com foco em genes motorista, resultando em novas moléculas altamente enriquecido que precisam de mais estudos para estabelecer o seu papel na CRC

Citation:. Aziz MA, Periyasamy S, Al Yousef Z, AlAbdulkarim I, Al Otaibi M , Alfahed A, et al. (2014) integrado Exon nível de análise expressão de genes do piloto explicar seu papel no câncer colorretal. PLoS ONE 9 (10): e110134. doi: 10.1371 /journal.pone.0110134

editor: Osman El-Maarri, da Universidade de Bonn, Institut de Hematologia Experimental e medicina de transfusão, Alemanha |

Recebido: 20 de fevereiro de 2014; Aceito: 16 de setembro de 2014; Publicação: 21 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Aziz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo rei Abdullah International Medical Research Center através de bolsa de investigação RC10 /083 atribuído a MAA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Há uma riqueza de informações a nível omics que associa citogenética e expressão gênica muda levando ao câncer colorretal (CRC). A integração da expressão do gene e os dados do número de cópias (CN) para identificar alterações DNA NC que induzem a mudanças nos níveis de genes associados de expressão é uma tarefa comum em estudos de câncer [1] – [3]. O dogma central da biologia molecular tem sido assim se dirigiu a dois níveis importantes. Houve muitos relatórios que fornecem evidências de mudanças no nível do genoma na forma de número de cópias aberração [4], polimorfismos de nucleotídeo único, perda de heterozigosidade que tentam entender os eventos moleculares associados ao câncer colorretal. Estas alterações somáticas ou hereditárias têm diferentes mecanismo de contribuir para a iniciação ea progressão da CRC. Perda e ganho de regiões cromossômicas cruciais que conduzem à supressão ou amplificação de genes relacionados com o cancro tem sido muito bem estabelecida. O significado funcional destes eventos moleculares foi medida usando diferentes ferramentas e algoritmos. Genes alvo de alterações no número de cópias somáticas (SCNAs), em particular, desempenham um papel central na terapia oncogênese e câncer [5]. Várias ferramentas foram disponibilizados para avaliar o potencial de genes que são afetados por SCNAs na causa do câncer colorretal. ‘Identificação Genomic de Metas significativas na Cancer “ferramenta (GISTIC) tem sido utilizado com sucesso na identificação de’ SCNAs Driver ‘com base na frequência e amplitude dos eventos observados [6], [7]. O segundo aspecto de mudanças que ocorrem em células tumorais é a nível da transcrição. A análise da expressão diferencial foi efectuada para descobrir genes importantes que desempenham um papel na causa de cancro colorrectal. Pode haver vários mecanismos pelos quais os genes afectados SCNA exercem o seu efeito ao nível funcional. As amplificações e deleções na região genómica estão reflectidos nos níveis de transcrição e pode ser detectado através da realização de estudos de expressão baseados microarray. Com o emprego de matrizes de exão, ganhamos dimensão extra dos eventos que acontecem no nível exão, que podem levar a splicing alternativo resulta em isoformas diferentes genes. splicing alternativo é um passo crucial na geração de diversidade de proteínas e sua misregulation é observada em muitos tipos de câncer humano [8].

A busca para explorar a relação entre o número de alterações de cópia e ao nível dos genes afetados expressão /exões recebeu um sucesso limitado devido a um número de razões [9]. melhorias tecnológicas na concepção de matriz para citogenética, bem como transcriptomics melhoraram a exatidão e precisão dos dados gerados. Combinando isto com melhores técnicas analíticas e algoritmos, possibilidades de encontrar genes alvo responsáveis ​​por causar câncer colorretal aumentou ainda mais.

últimas décadas têm visto uma busca para encontrar novos genes que podem servir como alvos terapêuticos ou biomarcadores. No entanto, os genes ou proteínas não funcionar sozinho mas interagem uns com os outros para formar redes ou vias, de modo a levar a cabo as funções biológicas [10]. abordagens baseadas na rede de biomarcadores que encontram mais estreitamente representam

in vivo

biologia molecular onde uma perturbação em um gene pode afetar muitos genes a jusante. O câncer tem sido, assim, correctamente abordado como uma doença biologia de sistemas [11], em oposição a doenças causadas por mudanças em alguns genes ou mutações. Reconstruir rede de transcrição em tecidos saudáveis ​​e doentes é, portanto, fundamental para a compreensão fenótipos câncer e elaboração de terapêuticas eficazes [12].

Com a disponibilidade de ferramentas e técnicas para capturar as alterações moleculares que acontecem em diferentes fases do dogma central com o aumento da precisão e exatidão, ainda estamos a desenvolver um quadro abrangente e integrada que poderia nos ajudar a encontrar melhores alvos para o cancro colorectal. No presente estudo, pretendemos integrar as informações a partir da análise citogenética com os dados de expressão de nível exão utilizando amostras de tumores normais emparelhados de doentes com cancro colorectal. Um conjunto de genes motorista sugeridas pela análise GISTIC (denominado como “genes Driver ‘a partir de agora em diante) foram consultados pelo gene, exão e nível de rede. Tanto a DNA e RNA para citogenética e estudos transcriptomic, respectivamente, foram extraídos a partir do mesmo tecido em um único fluxo de trabalho para minimizar a variação. Este estudo fornece evidências para explicar diferentes possíveis mecanismos pelos quais SCNA genes afetada motorista pode exercer o seu efeito funcional. Um subconjunto de genes motorista foram encontrados para mostrar as mudanças de nível do gene na expressão. A maioria destes genes também indicaram as alterações do nível de exão, resultando na formação de diferentes isoformas. Rede de genes GISTIC mostrou uma clara mudança na fatores de transcrição (TF) regulação. gene ATP8B1 foi encontrado para ter novel associação com cancro colo-rectal em citogenética, genética e nível exão.

Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética e Institutional Review Board (IRB) de rei Abdullah Centro Internacional de Investigação médica após processo de revisão devido dos aspectos éticos da proposta. Os formulários de consentimento processuais e éticas necessárias foram assinados por cada paciente antes da coleta da amostra.

recolha de amostras e RNA extração

coleta de amostras foi realizada conforme descrito anteriormente [13]. O tipo e estágio de todas as amostras dos pacientes são fornecidos na Tabela S1. O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional após o devido processo legal. Os pacientes foram consentido e os registros mantidos de uma maneira aprovada. O ARN foi extraído a partir da mesma peça de tecido que foi usado para extrair o ADN para estudos citogenéticos num único fluxo de trabalho. Maceherey Nagel trio kit prep (Alemanha) foi usado para extrair o ADN e ARN no mesmo protocolo. Qualidade e quantidade foi verificada usando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, EUA).

Exon microarray

GeneChip Exon Human 1.0 ST Arrays juntamente com WT Terminal Rotulagem e Kit Controls e hibridação, Wash, e Stain kit foram obtidos a partir de Affymetrix EUA. Kit Ambion WT A expressão foi obtido por Ambion, EUA. Tumor 31 e 29 amostras de 32 pacientes normais foram processadas. Os dados foram extraídos utilizando o software consola Expressão de Affymetrix, EUA. O controle de qualidade foi realizado utilizando Análise de Componentes Principais (PCA) e suite biomarcador Integromics (TIBCO Spotfire). Todos os dados são depositados em banco de dados GEO com um número de acesso GSE50421.

Análise de Dados

Antes de qualquer análise do gene /nível exão, análise de componentes principais (PCA) foi feito para identificar valores atípicos. Dados de 4 amostras normais e 7 amostras de tumor foi posteriormente removida.

Análise de dados especificamente com genes motorista

análise

nível de Gene.

Para verificar os níveis de lista gene 144 driver de expressão gerado pela análise GISTIC (13), foram empregados dois softwares diferentes – console de Expressão e AltAnalyze [14]. Dois softwares diferentes foram utilizados para confirmar nossos resultados utilizando métodos independentes. estimativas de sinal foram derivados a partir dos ficheiros de CEL 60 amostras normais (29 e 31) do tumor usando robusta matriz multi-média (RMA) para normalizar os dados. Os principais conjuntos de sondas de nível exão foram usadas para resumir os níveis de expressão do gene.

A mesma lista de 144 genes de driver com valores de expressão calculados usando ‘Altanalyze’ foi utilizada para inferência (GENIE3) análise de caminho /rede baseada.

análise de expressão nível Exon.

programa Altanalyze foi utilizado para avaliar splicing alternativo em genes motorista. Os dados em bruto foi filtrada para remover conjuntos de sondas que foram considerados não-expressos. A pontuação splicing para exons filtrados foi calculado usando o método de índice de splicing e anotação exon /intron /splicing foram atribuídos a estes resultados. A p-valor de índice de splicing de corte de 0,05 foi usado para filtrar os resultados alternativos exão. AltExonViewer – um componente de Altanalyze e DomainGraph – um plugin Cytoscape foram usadas para visualizar os valores de índice de emenda e exons splicing alternativo. O valor de índice de splicing (SI) foi calculado como descrito em [15]. Resumidamente, SI é log

2 razão de intensidades normalizadas de tumor e amostras normais. Em nossa análise “amostra 1 ‘no numerador era normal e” amostra de 2’ no denominador foi tumor.

análise de rede Causal.

Para abordagens baseadas em análise de redes, conhecimento e inferência foram utilizados . Para abordagens de inferência baseada, GENIE3 [16], [17] foi usado para gerar rede de transcrição para tumor e amostras normais. Para gerar a rede, os genes do controlador foram classificados como genes de TF e genes alvo. Embora 1000 interacções foram inferidos para cada um dos grupo, uma interacção marcar 0,1 foi escolhido como um valor de cut-off. Usando esta informação as redes reguladoras foram inferidas de forma independente para amostras tumorais e normais utilizando Cytoscape.

A análise dos dados com toda conjunto de sondas

Integromics Biomarcador Descoberta Suite.

A fim de encontrar diferencialmente genes expressos em nosso conjunto de dados, sem qualquer preconceito anterior, dados de arquivos CEL foram analisados ​​utilizando o software Integromics (TIBCO Spotfire, EUA) gasoduto para Affymetrix exão 1.0 matrizes ST. normalização Quantile foi feito após a remoção de outliers usando PCA. Tanto a análise de significância de Microarrays (SAM) e de modelos lineares para dados de microarranjos (limma) análises foi realizada com um corte de 0,01 para p-valor ajustado e dobre mudança de 1 ou -1. Duas metodologias ainda cortesia diferentes foram usados ​​para fazer os nossos resultados mais confiante. enriquecimento Gene ontologia foi realizado em uma lista de 760 genes diferencialmente expressos obtidos a partir da análise limma.

Análise via Ingenuity.

Lista de 760 genes de análise SAM /limma feito usando Integromics foi usado para executar ‘core’ e ‘biomarcador’ analisa. análise de núcleo foi feito como descrito anteriormente [13]. Para a análise de biomarcadores foram usadas seguintes filtros: Considerar apenas moléculas onde (espécies = humano) e (linhas de tecidos /células = KM-12 ou HCT-116 OU RKO ou câncer de cólon linhas celulares não especificados contrário ou COLO205 OU HT29 OU HCC-2998 OR HCT-15 ou SW-480 ou outro celular cancro do cólon Lines ou tecidos e células primárias sem outra especificação ou SW-620) e (doenças = câncer) e ((aplicações de biomarcadores = Todos os aplicativos biomarcadores) e (doenças biomarcadores = cancro do cólon ou carcinoma do cólon ou neoplasia de cólon ou adenoma colorretal ou câncer colorretal ou carcinoma colorretal))

resultados

a estratégia de análise levando a seguintes resultados é ilustrada na Figura 1a .. b

a) As análises de toda é dividida em quatro fases, desde o ‘Data Generation’ para ‘Analyses rede “. B) Análise estratégia usando programas diferentes é exibido neste diagrama. Há três componentes da análise – Gene, Exão e Rede tratadas por diferentes programas. análises de nível de Gene são realizados utilizando ‘Affymetrix, Expressão /transcriptoma consola análise’ e ‘Tibco Spotfire’. análise de nível Exon é realizada por ‘AltAnalyze “e” ferramentas eléctricas Affymetrix’. As análises de rede empregada ‘GENIE3’, ‘IPA’ e ‘Cytoscape’. ‘Número Nexus Copy’ é um programa usado em estudos anteriores para, eventualmente, gerar uma lista de 144 genes motorista.

Um pequeno subconjunto de genes identificados por GISTIC mostram uma mudança significativa no nível de expressão.

Foram estudados os padrões de genes motorista expressão a nível gene usando AltAnalyze e Expressão Console softwares. Estas análises produzido resultados cortesia e produziu uma lista de 20 genes que foram encontrados a ter uma mudança significativa da dobra superior a 2 e um valor de p 0,01 [Tabela 1]. 9 genes sofreu uma regulação para baixo. BCAS1 com maior pontuação GISTIC de 5.323 estava entre os genes mais significativamente reprimidos. 11 genes mostraram uma regulação positiva com IL6 e INHBA que mostra a mudança vezes mais elevada [Figura 2a (AltAnalyze), 2b (Expressão Consola)]. Dobre alterar valores de todos os 144 genes driver são apresentados na Tabela S2.

Dois algoritmos diferentes foram usados ​​para medir os valores de expressão de dados de matriz Exon para apoiar os resultados. AltAnalyze (1a) e Expression Console (1b) apresentam resultados de cortesia com alterações máximas observadas nos genes BCAS1, INHBA, IL6 e MUC4.

Três genes significativamente baixo regulamentados (BCAS1, ABP1 e AGR3 ) foram encontrados em regiões amplificadas do genoma enquanto que HTRA1 upregulated foi encontrada principalmente nas regiões de perda. Estes genes experimentaram uma mudança em seu fator de transcrição no tumor e amostras normais [Tabela 2].

A análise da expressão diferencial usando dados amostrais emparelhados tumorais normal de matrizes de exão de 32 pacientes foi realizada. Após a remoção de outliers usando PCA [Figura 3], 25 amostras normais e 24 tumores foram encontrados adequado para análises posteriores. Nós empregamos não paramétrico (SAM) e métodos paramétricos (limma) e encontrou resultados de cortesia. 6242 genes foram expressas diferencialmente com p-valor ajustado de 0,01. 760 genes foram encontrados para ser regulados diferencialmente (dobre mudança 1ou -1) dos quais 15 genes eram comuns com os genes controladores da análise GISTIC [figura 4a-c e Figura S1]. BCAS1, AURKA, ATP8B1, IL6 e INHBA eram os genes diferencialmente regulados encontrados para estar entre os melhores marcadores na lista de genes motorista.

60 amostras de 32 pacientes foram submetidos a PCA e outliers foram removidos. 4 amostras normais e 7 de tumor foram retirados da análise final.

(a) diagrama de Venn de genes comuns entre GISTIC, SAM e limma analisa. Todos os genes foram anotados e comparados usando IPA “comparar” função. 43 genes de análises Integromics não foram mapeados por IPA.15 genes são comuns entre todas as três análises. (B) binned mudança dobra gráfico de barras da análise limma. Total de 6242 genes foram ajustadas tendo valor de p 0,01, dos quais 759 apresentaram alteração dobra significativa ( -1 ou 1). (C) enredo Volcano mostrando genes altamente significativa (rosa = reprimidos, laranja = upregulated) em termos de p-valor e dobre mudança.

As mudanças significativas na expressão da isoforma é exibido por genes identificados por análise GISTIC .

análise de nível Exon de 144 genes motorista foi realizado. 29 exons pertencentes a 13 genes foram mostrados para ter mudanças significativas na expressão da isoforma como refletido em suas pontuações do Índice de emenda [Tabela 3]. Enquanto exons E25-1 de MUC4 e E3-2 de PTP4A3 apresentaram altos valores SI negativos, exons E2-2 de IL6 e E21-2 de ADAM12 apresentaram altos valores SI positivos. SI valores negativos indicam exões são enriquecidos em amostras de tumores e são ignorados ou reprimidos em amostras normais e vice-versa para valores positivos do SI. Para gene MUC4, exons E25-1, E2-2, E2-1, I4-6 e I3-6 registou valores negativos SI e exão E8-1 registrou um valor de SI positivo. Exons E2-2 e E4-3 de IL6 registou valores SI positivos. [Figura 5 ai-ii bi-II e figura S2]. Exons em mylk e ANK3 mostrou alteração significativa no padrão de splicing mas não mostram uma mudança significativa na dobra valor da expressão do gene. Observou Detecção Microarray de splicing alternativo (MIDAS) Faixa de p-valor de 0,01-0,04 nos resultados filtrados.

expressão Exon (i) e emenda índice (ii) os valores foram mapeados para ambas as amostras tumorais e normais para vinte e nove exões que afectam treze genes. O exão do gene 25-1 MUC4 (a) mostra mais elevado valor de índice de splicing negativo (A II) valor mais elevado ao passo que o exão 2-2 de IL-6 (b) mostram de 2,44 (b, ii). valores de expressão e de índice de emenda Exon para descansar 27 exons são fornecidos como figura complementar 1.

análise causal de rede exibe mudar em fatores de transcrição em amostras de tumor.

análise

Causal Rede exibe mudar em fatores de transcrição em amostras de tumor. A influência mais significativa de genes TF em amostras tumorais e normais reflectiu-se na alteração do número de arestas dirigidas [Tabela 4]. CHAF1A, AHR, PRPF4B, ZNF200, Smad2, RUVBL1, SMAD4, TSHZ1, CTCFL e CEBPE estavam entre os principais influenciadores. A hierarquia de regulação entre estes grupos mudou no que diz respeito ao TFS. Enquanto RUVBL1 transformado em um regulador mestre em tumores, TSHZ1 perdeu a sua capacidade de dominar regular outros genes em tumores [Figura 6a]. rearranjo significativo em modularidade também é observada entre estes dois grupos. Mais genes alvo funcionar como módulos em tumores como observado em módulos regulados pela AHR, CHAF1A e PRPF4B. Além disso, não há interferência significativa entre as reguladora genes no grupo normal [Figura 6b]. Enquanto os tumores perderam as propriedades de escala livre em sua interação regulamentar, grupo normal apresentam distribuições grau aproximado fora de escala livre, significando o potencial do TF para regular série de genes alvo. Os tumores não apresentam este tipo de regulamento que indicam alimentação unidirecional modo de regulação para a frente.

Uma topologia de rede hierarquizada é usado para visualizar os graus de interação entre genes fator de transcrição e genes-alvo. (A) A rede inferida para o grupo tumor mostrando RUVBL1 como regulador mestre. (B) A rede inferida por grupo normal mostrando regulador mestre TSHZ1as.

Análise funcional de genes diferencialmente expressos confirma seu papel no câncer colorretal e revelam caminhos e biomarcadores importantes.

divisão celular Gene Ontology enriquecimento de 760 genes diferencialmente expressos obtidos a partir SAM /limma análises mostraram, mitose e adesão celular a ser os processos biológicos mais importantes afetados [figura S3]. Ingenuity análise de caminho de 760 genes mostraram câncer e doença gastrointestinal entre as principais funções seguido pelo crescimento movimento e proliferação celular [Figura 7a]. NF-kB de sinalização, ciclo celular G

2 /M DNA danos checkpoint regulação, a metástase do câncer colorretal estão entre as principais vias de pontuação seguido por agranulócito adesão [Figura 7b]. TGFB1 estava entre os principais reguladores a montante. A análise de redes sugere MYC, MMP e genes IL6 nós como importantes [Fig 7c-e]. análise de biomarcador revela 28 moléculas relevantes para o cancro colorectal [Tabela 5]. INHBA, CLDN7 e MUC4 eram elegíveis como biomarcadores e são comuns com GISTIC, SAM e limma analisa resultados.

análise do núcleo usando IPA foi realizada utilizando conjunto de 760 genes que foram diferencialmente expressos em amostras de tumor. importantes funções biológicas (a) Vias (B) e redes (ce) foram revelados por esta análise.

Discussão

Neste estudo, tentar compreender o nível de transcrição alterações nos genes de driver afetadas por SCNAs no cancro colorectal. Nós questionaram esses genes a partir de três perspectivas, utilizando ferramentas de análise de nível de gene /exão /rede. Nossa análise integrada em níveis genômico /transcriptomic resultou em encontrar genes de alta prioridade que pode ser experimentalmente estudados para estabelecer seu papel no cancro colorectal. significado funcional de genes diferencialmente expressos confirmou o resultado de nossas análises.

Devido à indisponibilidade de matrizes de citogenética de alta resolução tamanho grande de regiões cromossômicas foram implicados em causar câncer colorretal através do número de mudanças de cópia. As matrizes de genotipagem de SNP comerciais concentrar em variantes que estão presentes em 5% ou mais da população e apresentam um número limitado de sondas de CNV. Portanto, variantes estruturais microscópicas sub são mal capturado por matrizes de genotipagem de SNP disponíveis que foram projetados para avaliar SNPs. A introdução recente da matriz Affymetrix CytoScan HD (matriz CNV-alvo), que se baseia na matriz validado Genome-Wide SNP Humana 6,0 e contém mais do que 2,6 milhões de marcadores para o número de cópias variantes e aproximadamente 750.000 SNPs, permitiu a detecção de copiar aberrações número com alta resolução em todo o genoma [18]. Os dados a partir desta plataforma foi usada para obter a lista de genes controlador, as quais poderiam, assim, ser considerados como sendo mais precisa e fiável. Anteriormente, os resultados de diferentes grupos muitas vezes conduzir a um elevado nível de discordância com uma sobreposição de 5% em alguns casos. análise GISTIC foi capaz de resolver esta questão e diferenciar entre passageiros e motorista mutações com um alto nível de precisão e exatidão [6]. A correlação entre a expressão e os dados de CN é extremamente complexo [19] e é muito afectada pelo tipo de plataforma utilizada para gerar os dados, bem como as estratégias de análise. A nossa estratégia de análise que visa reduzir os fatores de confusão. Foram extraídos do ADN /ARN a partir da mesma peça de tecido num único protocolo [20]. Usamos correspondida controle do tumor normal emparelhado que é sem dúvida a melhor maneira de fazer um estudo comparativo [21]. Várias abordagens têm sido empregadas para a priorização gene do câncer através de análise integrativa [22], [23]. Nós empregamos uma abordagem de duas etapas modificadas por filtrar os genes do cancro usando GISTIC e depois realizada a análise da expressão do exão.

Gene Nível.

O efeito de alterações cromossômicas nem sempre é direta. amplificação global ao nível genômico resultaria em maior nível de expressão de genes selecionados [9]. Nossa análise nível gene mostrou que apenas 20 de 144 genes motorista a sofrer mudanças significativas em nível de transcrição. 5 destes genes foram listados entre os principais genes de driver de pontuação. Nossos resultados correlacionam amplificações focais com aumento dos níveis de expressão e de ter sido noticiado anteriormente usando um array CGH (aCGH) para FGFR2, GNAS e genes AURKA [24]. Com um tamanho médio de amplicon de 4,56 Mb, que poderia ser enganosa para relatar todos os genes afetados /não-codificante regiões a serem associados com CRC. FAM46C, genes EGFR2 e IL6 da nossa análise também foram listados no censo gene do cancro atualizada [5], [25]. gene BCAS1 que obteve a maior pontuação na análise GISTIC foi relatado mais cedo que passar por splicing alternativo e downregulation [26] o que é consistente com nossos resultados. Regulação positiva de SLC7A11 mRNA humano em células de fibroblastos estromais de metástases hepáticas é associado com câncer colorretal metastático em humanos [27]. PTP4A3 relatado para ser significativamente regulada positivamente no estudo recentemente tem sido implicada em tumorigénese cólon [28]. ATP8B1 é o gene que ainda não foi relatado para ter qualquer associação com câncer colorretal e seria uma importante molécula para estudos posteriores.

A nossa análise da expressão diferencial de conjuntos de dados normais de matriz exão tumor e usando duas ferramentas independentes (SAM e limma) mostraram uma sobreposição de 15 genes com os genes de motorista. Análise de 44.000 sondas resultantes em genes expressos diferencialmente proporcionar uma abordagem imparcial e dá mais confiança na lista de genes que se sobrepõem. Ambos limma e SAM abordagens gerado mesmos resultados ao nível funcional como evidenciado pela Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

ABP1, AGR3 e BCAS1 mostrou downregulation apesar de amplificação no nível de genoma. Isto é suportado por estudos anteriores para a linha de células BCAS1in MCF7 [29]. Observou-se que a influência do factor de transcrição SMAD4 foi perdido em células tumorais e podem ser responsáveis ​​por esta observação. Mudanças semelhantes em fatores de transcrição foi observado para dois outros genes que indicam o comportamento de comutação como discutido abaixo.

Exon Nível.

análise de nível Exon para medir a expressão do gene muda é desafiador, mas gratificante. Mesmo os algoritmos melhorados têm limitações no fornecimento de quantificação absoluta dos níveis de transcrição. métodos anteriores descobriram dados de nível exão a ser mais informativo sobre a natureza eo nível de transcritos [30]. Agora, com o conhecimento de que mais de 90% de todos os genes sofrer splicing alternativo para produzir mais de um transcrito de um gene, o potencial de dados de nível exão está a ser realizado mais do que nunca [31] – [33]. Gene abordagem centrada para a realização de análise integrada utilizando aCGH e matriz exão de dados rendeu mais resultados confirmatórios e carecem da utilização de todo o potencial de matrizes de todo genoma [34]. gene FGFR2 foi mostrado para ser amplificado e sobre-regulada que é enganadora devido à forma truncada de FGFR2. gene FGFR2 peso não foi medido e, portanto, não poderia ser comparado com o nosso estudo [34].

estudos de nível Exon em câncer colorretal têm sido poucos e realizar várias limitações em termos de análise de dados. Muitos destes estudos de tumor e normal a partir de diferentes fontes de [35] em comparação. Os nossos resultados mostram um subconjunto de genes expressos diferencialmente a sofrer mudanças no padrão de splicing. 29 exons pertencentes a 13 genes mostrou significativo índice de emenda (SI) e valores de p Midas. Ambos os valores são indicadores fortes para medir splicing alternativo. MUC4 é muito bem conhecida a sofrer splicing alternativo e cancro causa [36], mas o processamento alternativo de IL6 é novo em associação com o CRC. ADAM12 que marcou um elevado valor de SI tem sido implicado no início cancro do pulmão [37]. 5 genes (ACTN1, CALD1, SLC3A2, CTTN e FN1) relatados anteriormente como diferencialmente emendados [38] foram encontrados no nosso estudo, bem como que usou uma estratégia de análise diferente.

ANK3 é conhecido por usar a transcrição alternativa iniciar sites em câncer colorretal [8] e também poderia ser o mecanismo para outro mylk gene para o qual nós não vimos uma mudança significativa no nível de expressão de genes.

nível de Rede.

análise Pathways tem foi usado para medir a relevância dos genes afetados por CNAs através da criação de redes entre eles [1]. No entanto, essas redes são limitados na sua interpretação útil devido à ausência de direccionalidade. Nossa análise de rede causal fornece mais informações úteis sobre os genes envolvidos nestas redes. Observou-se uma diferença significativa no número de genes-alvo entre o tumor e normal. No caso dos genes encontrados na região amplificada foram reprimidos mas observou-se uma perda de regulação do factor de transcrição, ao passo que regulada positivamente no gene encontrado na região eliminada houve uma mudança no factor de transcrição. A partir da lista de genes driver que escolheu os factores de transcrição e estudada a sua mudança de comportamento em amostras de tumor. AHR foi estabelecido como um gene supressor de tumores no cólon e outros cancros [39]. Este estudo explica ainda o reforço do papel da AHR pelo aumento do número de saída genes (de destino) em tumor. Nosso estudo fornece evidências de que TSHZ1 perde o seu papel como regulador mestre em células normais enquanto RUVBL1 assume esse papel. Estes fornecem oportunidades interessantes para estudos sobre os mecanismos de rede /vias afetadas no CRC. Tem sido previsto através de estudos integrados que muitas alterações genômicas diferentes potencialmente dis-regulam as mesmas vias em doenças complexas [40]. Mais estudos das alterações de nível de regulamentação neste estudo será capaz de estabelecer este conceito no CRC.

O papel funcional dos genes diferencialmente expressos ea identificação de MYC, MMP e IL6 como nós importantes nas redes afetadas fornecem leads que precisam ser validados para estabelecer a sua associação com o CRC. Biomarcadores, especialmente MUC4 será uma molécula importante para estudar mecanicamente e estabelecer a sua utilização em estudos clínicos. Este estudo fornece riqueza de dados analisados ​​e uma lista enriquecida de genes que podem servir como pistas possíveis para compreender a biologia do câncer colorretal.

Informações de Apoio

Figura S1.

Importância da análise de Microarray. Análise SAM foi realizada utilizando Integromics suites descoberta de biomarcadores em todas as amostras. Os resultados foram cortesia à análise limma como refletido no número de genes diferencialmente expressos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110134.s001

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Figura S2. Índice

Splice e parcelas de expressão de exão para os restantes 11 genes. valores de índice Splice e expressão exão de todos os 13 genes que foram encontrados significativa entre os genes do driver foram plotados. Comparação de ‘Normal’ e amostras do tumor ‘é descrito para observar a mudança no índice de emenda, bem como o padrão de expressão a nível exão

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110134.s002

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Figura S3.

Biológica processa gráfico de enriquecimento para os genes diferencialmente expressos. Este lote de barras mostra os genes diferencialmente expressos (como obtido a partir Integromics) são enriquecidos em três funções a saber, a divisão celular, mitose e de células de adesão

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0110134.s003

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Tabela S1.

tipos e fases de todas as amostras de pacientes utilizados no estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110134.s004

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Tabela S2.