Abstract
Objectivo
aldeído desidrogenase (ALDH) expressando células foram caracterizado como possuindo propriedades semelhantes a células-tronco. Foram avaliados ALDH + propriedades semelhantes a células-tronco do câncer de ovário e de seu papel na resistência de platina.
Métodos
linhas celulares de cancro do ovário isogénicas para sensibilidade de platina (A2780) e resistente à platina (A2780 /CP70) como bem como ascite de pacientes com câncer ovariano foram analisadas para ALDH + por citometria de fluxo para determinar sua associação com resistência de platina, recorrência e sobrevivência. Um modelo knockdown shRNA estável para ALDH1A1 foi utilizado para determinar o seu efeito sobre as propriedades tronco do câncer de células-like, checkpoints do ciclo celular, e mediadores de reparo do DNA.
Resultados
status de ALDH directamente correlacionada com resistência de platina em amostras de cancro do ovário primárias obtidas a partir de ascites. Pacientes com ALDH
ALTA exibido significativamente menor sobrevida livre de progressão do que os pacientes com ALDH
células baixa (9 vs. 3 meses, respectivamente, P 0,01). ALDH1A1-knockdown atenuou significativamente o potencial clonogênica, PARP-1 níveis de proteína, e inverteu a resistência de platina inerente. ALDH1A1-knockdown resultou em diminuição drástica de KLF4 e níveis de proteína p21 levando, assim, a S e acumulação fase G2 das células. Aumentos no S e células G2 demonstraram aumento da expressão do estresse replicação proteínas de reparo da Anemia de Fanconi DNA associados (FANCD2, FANCJ) e posto de controle de replicação (pS317 Chk1) foram afetados. ALDH1A1-knockdown induzida danos no DNA, evidenciada por indução robusto de γ-H2AX e BAX apoptose mediada, com aumentos significativos na expressão BRCA1, sugerindo regulação dependente de ALDH1A1 de postos de controle do ciclo celular e redes de reparo de DNA em células-tronco do tipo de cancro do ovário.
Conclusão
Estes dados sugerem que as células de cancro do ovário expressar ALDH1A1 pode manter a resistência de platina por regulamento alterado de checkpoint do ciclo celular e sinalização DNA rede de oficinas
Citation:. Meng e, Mitra A , Tripathi K, MA Finan, J Scalici, McClellan S, et al. (2014) ALDH1A1 Mantém Ovarian Cancer Stem Propriedades celular como pelo Regulamento alterado de Ciclo Celular Checkpoint e reparo de DNA Rede de Sinalização. PLoS ONE 9 (9): e107142. doi: 10.1371 /journal.pone.0107142
editor: Robertus AM. de Bruin, University College London, Reino Unido
Recebido: 13 de maio de 2014; Aceito: 07 de agosto de 2014; Publicação: 12 de setembro de 2014
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Gynecologic Cancer Sherri do de um sussurro para um rugido, Prêmio de Pesquisa do Câncer da motocicleta Fundação ovário da Mulher e os Eleanor Ruth Frenkel Fundo para Ovarian Cancer Research (RPR); NIH concessão R01GM098956 e concessão Abraham Mitchell Endowment (K.P.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é o mais letal de todas as malignidades ginecológicas, afetando mais de 22.000 vidas de mulheres anualmente nos Estados Unidos sozinho. Embora a maioria dos pacientes com cancro do ovário alcançar uma resposta clínica completa inicial de cirurgia citorredutora seguida de combinação de quimioterapia, mais irá experimentar uma recorrência e infelizmente sucumbir à doença progressiva [1]. Vital para o prognóstico de pacientes com câncer de ovário é variadas sensibilidade da doença para agentes de platina. Embora um contínuo, os pacientes são estratificados por resposta original da sua doença à quimioterapia platina quer “de platina-sensíveis” ou “resistente a platina” definido pelo comprimento do intervalo livre de doença. Este espectro é altamente preditiva de desfechos clínicos de quando um câncer reaparece, o sucesso da cirurgia e /ou quimioterapia na recorrência e sobrevida global do paciente.
Considerando a heterogeneidade de câncer, nem todas as células de um tumor maligno faria se esperar que seja resistente à quimioterapia. A teoria células-tronco cancerosas (CSCs) propõe que estas células resistentes a abranger apenas uma minoria de células dentro de um câncer, ainda é o único responsável para o retorno a longo prazo [2]. Deste modo, independentemente das taxas de resposta iniciais, se a quimioterapia não erradicar estas CSCs resistentes, em seguida, o cancro irão regenerar e uma recorrência ou progressão da doença irá ocorrer. A identificação dessas células resistentes e determinação de suas vias moleculares inatas são fundamentais na busca de terapias mais eficazes direcionados [3]. Portanto, uma estratégia para melhorar o sucesso da terapia do câncer de ovário é aumentar a sensibilidade CSCs para agentes de platina. Superar a resistência de platina seria vital no tratamento de câncer de ovário com os benefícios potenciais de taxas de resposta melhoradas, maior sobrevida e mais curas.
Recentemente, aldeído desidrogenase atividade (ALDH) foi mostrado para ser um muito atraente CSCs marcador em muitos tipos de câncer, como de pulmão [4], peito [5], próstata [6], tireóide [7], câncer de cabeça e pescoço [8], e de ovário [9] – [12]. ALDH família compreende isoenzimas citosólicas responsáveis pela oxidação de aldeídos intracelulares, contribuindo, assim, para a oxidação de retinol para o ácido retinóico na diferenciação de células estaminais no início [4]. A superfamília ALDH humano atualmente consiste de 19 genes putativamente funcionais conhecidos em 11 famílias e 4 subfamílias com localizações cromossômicas distintas. Das vastas famílias ALDH e subfamílias, ALDH1A1 tem sido um marcador válido entre diversos tecidos malignos. Ela mantém a distinção atraente de ser não só um potencial marcador de stemness mas potencialmente desempenhar um papel na biologia das células tumorais de iniciação bem como [13]. Além disso, a subpopulação ALDH1A1 tinha demonstrado estar associada com quimiorresistência em pacientes com cancro do ovário [9], [14].
Estudos recentes em modelos de cancro da mama demonstrou uma relação interessante entre BRCA1 e diferenciação de células estaminais [15], [16]. BRCA1 também tem mostrado desempenhar um papel importante na diferenciação de tecido da mama, regulando Notch e a resposta do tumor à terapêutica anti-endócrino [14]. Particularmente, uma relação inversa entre a expressão ALDH1A1 e BRCA1 é digno de nota no contexto de estudar as células-tronco cancerosas-like e chemoresistance. De BRCA1 desempenha um papel importante na protecção do genoma a partir de lesões do ADN e mutações aberrantes, ou deleção desta gene levam a instabilidade do genoma e aumento da incidência de cancro da mama, do ovário e outros cancros [17]. Em resposta a danos no DNA que localiza rapidamente aos locais de quebras de fita dupla (DSB) e medeia várias respostas de sinalização, incluindo postos de controle do ciclo celular e escolha da via de reparação do DNA para corrigir essas lesões [17] – [19]. No entanto, o estado BRCA1 e ALDH + câncer de ovário manutenção de células estaminais-like e sua resistência à quimioterapia não foi estudado.
Nós demonstramos que ALDH + fenótipo possui características CSC de invasão reforçada, a formação de colónias, e haste marcadores celulares. O isotipo ALDH1A1 específica parece ser responsável pela resistência de platina mediada por ALDH tanto clínica, bem como
em in-vitro
modelos. Nossos dados suporta um mecanismo de resistência de platina mediada por ALDH1A1 no cancro do ovário através de um regulamento alterado de checkpoint do ciclo celular e sinalização DNA rede reparo.
Materiais e Métodos
linhas celulares e culturas
A2780 e A2780 um isogénica resistente a cisplatina /linha celular CP70 foi gerado como descrito anteriormente [20].
ALDEFLUOR e Ensaio de células activadas por fluorescência
Para isolar a população de células com um elevado a actividade enzimática da ALDH, ALDEFLUOR kit de ensaio (STEMCELL Technologies Inc.) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Após tripsinização, as células foram suspensas em tampão de ensaio contendo ALDEFLUOR ALDH substrato enzima BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA), e incubou-se a 37 ° C durante cerca de 40 minutos. As células foram coradas usando as condições idênticas com o inibidor da ALDH específica, dietilaminobenzaldeído (DEAB), para servir como um controlo negativo. A citometria de fluxo triagem foi conduzida usando um classificador de células BD Bioscience Aria II SORP.
propriedades cancerígenas
Após a triagem para fenótipos ALDH (ALDH + vs. ALDH-), Matrigel invasão e ensaios de formação de colónias em agar mole foram realizados como previamente descrito [21]. Para avaliar o efeito da quimioterapia sobre a formação de colónias, as células foram tratadas com meio fresco com carboplatina 20 uM adicionado a cada 3-4 dias. colónias visíveis ( 50 células). foram contados em cinco 40X campos microscópicos escolhidos aleatoriamente em cada poço
CellTiter-Glo Luminescent celulares
células Viabilidade Ensaio
Ordenado A2780 /CP70 foram colocadas em placas a densidade de 4000 células por poço em placa preta de 96 poços com fundo transparente (Corning, NY, EUA). No dia seguinte, as células foram tratadas com várias concentrações de carboplatina até 72 horas. Após 24, 48 e 72 horas, foram adicionados 100 ul de reagente CellTiter-Glo (Promega) por poço, incubou-se durante 10 minutos à temperatura ambiente e luminescência foi registada num leitor de Hybrid Synergy H4 (BioTek).
em tempo real quantitativa de RT-PCR
em tempo real quantitativa de RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [21]. Primers e sondas para o sistema TaqMan foram selecionados no site da Applied Biosystems [BMI1 ensaio ID: Hs00180411_m1, c-myc ensaio ID: Hs00905030_m1, Kruppel-like factor 4 (KLF4) Ensaio ID: Hs00358836_m1, OCT3 /4 ensaio ID: Hs01009568_m1, S100 cálcio proteína de ligação A1 (S100A1) ensaio ID: Hs00984741_m1, ALDH1A1 ensaio ID: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) ensaio ID: Hs00355782_m1, controle interno gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ensaio ID: Hs99999905_m1]. Os níveis de mRNA expressão relativos de BMI1, c-myc, OCT3 /4, KLF4, S100A1, ALDH1A1, p21, foram calculados utilizando o método ΔΔCt e normalização para GAPDH.
Lentivirus shRNA Vector transfecção
Seis diferentes existências pGIPZ Lentivirus shRNA glicerol contra ALDH1A1 e um shRNA controlo negativo (Thermo Scientific) foram transfectadas de acordo com as instruções do fabricante. células A2780 /CP70 foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10
5 células por poço de uma placa de 6 poços, durante 18-24 horas. Para cada poço, 2 ug de ADN plasmídeo de shRNA (pGIPZ) foram transfectados em células A2780 /CP70 utilizando parada-em reagente (Thermo Scientific, EUA). Puromicina (0,8 ug /ml) foi usado para seleccionar as células transfectadas. Depois de optimização, as eficiências ALDH1A1-knockdown de shRNAs individuais foram avaliadas utilizando PCR em tempo real quantitativo e Western Blot. Vector 398453 demonstrou a transfecção mais eficaz e com mais de 95% de eficácia de knockdown ALDH1A1 e foi utilizado para todas as experiências de knockdown shRNA.
Análise Western Blot
As células em cultura foram recolhidas em NP-40 com tampão de lise coquetel de 10 ul de inibidor /ml de protease (Sigma) e submetida a imunotransf erência análise por meio de técnicas padrão, utilizando anticorpos contra ALDH1A1, FANCJ, KLF4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, XRCC1, β-actina, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), e p21, os anticorpos BRCA1 fosfo-Chk1 (Ser317), (Cell Signaling Technology)
RT
2 matriz Profiler PCR
O humano Cancer Resistance Cell Cycle RT
2 Profiler PCR Array (Qiagen, EUA) foi utilizado para o perfil de expressão de 84 genes envolvidos na resistência à droga de cancro e o ciclo celular com cinco genes housekeeping acordo com as instruções do fabricante. Controlos para a contaminação de ADN genómico e para garantir a eficácia das reacções de RT-PCR e PCR foram também ensaiadas. As matrizes de PCR foram realizadas usando um sistema de detecção em tempo real da Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad).
análise do ciclo celular por citometria de fluxo
células A2780 /CP70 foram transfectadas com o controlo ou shRNAs direccionamento para ALDH1A1 utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) e as células foram recolhidas e coradas para análise do ciclo celular de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences). As células em 10
6 foram re-suspensas com 300 uL de PBS, e 700 ul de gelo metanol frio para fixar as células durante a noite a -20 ° C. As células foram lavadas duas vezes com PBS, e depois coradas com 500 ul de iodeto de propídio (BD Bioscience) à temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro. perfis do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo.
Apoptosis Assay
A2780 /células CP70 transfectadas com o controle negativo ou shRNA-ALDH1A1 foram induzidos para a apoptose por tratamento com 1,0 mM estaurosporina durante 6 horas [22 ], [23]. APC-anexina V e 7-AAD coloração foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Cada grupo contém três controlos isotípicos: células não coradas; células coradas apenas com APC Anexina V; células coradas apenas com 7-AAD. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo.
Ensaio de Actividade de PARP
actividade de PARP foi medida utilizando HT PARP in vivo kit Farmacodinâmica Ensaio II (Trevigen). Após o tratamento com 100 uM carboplatina durante 45 minutos, as células A2780 /CP70 transfectadas com controlo negativo ou shRNA-ALDH1A1 foram lavadas duas vezes com 5 ml de água morna (37 ° C) PBS. As células foram raspadas para 300 ul de tampão de lise celular fria e incubadas em gelo durante 15 minutos. SDS foi adicionado às amostras a uma concentração final de SDS a 1% e incubou-se a 100 ° C durante 5 minutos. Quando as amostras de arrefecida até à temperatura ambiente, de 0,01 volume de 100X catião de magnésio e 2 ul de ADNase I (2 unidades /ul) foram adicionados às amostras e incubada durante 90 minutos adicionais a 37 ° C. Depois de uma breve centrifugação, os sobrenadantes foram recolhidos e polyADP-ribose (PAR) níveis nos extratos de células foram quantificados utilizando o método ELISA.
Correlação Clínico
Todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo e do conselho de revisão institucional da Universidade do Sul Sistema de Saúde Alabama aprovou este estudo, bem como o processo de aprovação. Ascite de 15 pacientes consecutivos submetidos à cirurgia para avançado estágio IIIC /IV papilar câncer de ovário seroso, bem como 2 pacientes com ascite benignos foram recolhidos e foi imediatamente processado para executar ensaio ALDEFLUOR após a lavagem com PBS e remover os eritrócitos utilizando tampão de lise ACK (Lonza , Walkersville, MD, EUA). Dados clínico-patológico foi recolhido para os respectivos pacientes e correlacionada com a percentagem de células ALDH + fenótipo exibido em seus ascite.
Análise Estatística
As comparações entre dois grupos foram realizadas usando o teste t e ANOVA onde Student apropriado. A significância estatística foi determinada pelo
p Art 0,05. curva de Kaplan-Meier foi realizada pela sobrevivência com log-rank para comparação estatística.
Resultados
status de ALDH se correlaciona com a resistência do cancro do ovário para agentes de platina
linhas celulares isogénicas de platina sensível (A2780) e de células cancerosas resistentes (/CP70 A2780) ovarianos foram avaliados quanto às suas taxas de sobrevivência na presença e ausência de diferentes doses de carboplatina. Consistente com o anteriormente resultados relatados [24], [25], A2780 /células CP70 necessário até uma dobra em 10 superior dose de carboplatina de alcançar o IC
50 concentração em comparação com a sua contrapartida sensível platina, A2780 (Figura 1A) . Recentemente, em vários modelos de cancro, estado ALDH tem sido implicado na resistência dos tumores à quimioterapia, mantendo as características das células cancerosas haste similares, tais como o crescimento agressivo, o aumento da sobrevivência e de re-diferenciação potencial [9]. A fim de testar a correlação entre o estado de ALDH e de resistência de platina em células de cancro do ovário, os ensaios foram realizados em ALDEFLOUR estas células isogénicas. Curiosamente resistente à linha celular de cancro do ovário a platina A2780 /CP70 exibiram, pelo menos, 110 vezes mais elevada percentagem de células ALDH + (com uma gama de 22-40%) em comparação com as células A2780 de platina sensível, que apresentavam apenas 0,2% de células ALDH + (Figura 1B) . Da mesma forma, a análise Western blot dos níveis da proteína nestas células ALDH1A1 revelou resultados semelhantes, sugerindo associação do estado ALDH com resistência de platina (Figura 1C)
linhas celulares isogénicas (platina A2780- sensível . Platina A2780 /CP70- resistente) foram avaliados quanto à resposta de platina utilizando um ensaio de sensibilidade a drogas, tal como descrito em H H a secção (a). Para avaliar a percentagem de ALDH + células, em A2780 e A2780 /células CP70 ensaio ALDEFLUOR foi realizada usando BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA) como substrato para a enzima ALDH, após 40 minutos de incubação a 37 ° C citometria de fluxo foi realizada (B) e dados mostram western blot que representam níveis de ALDH1A1 isozima nessas células (C).
Para avaliar se ALDH + câncer células-tronco semelhantes também estão presentes em tumores primários e sua associação com a sobrevida livre de progressão dos pacientes , temos recolhido ascite de 15 pacientes com câncer ovariano com doença avançada e 2 ascite benignos de pacientes com síndrome de Meigs e analisadas para a percentagem de células com expressão ALDH usando ensaio ALDEFLOUR. De acordo com a hipótese de células-tronco do câncer, ALDH + células estavam presentes em maior percentual em ascite maligna em comparação com os seus homólogos benignas. A percentagem de células em ALDH + ascite maligna variou de 1,3 a 25,4% (3-17 pacientes) em comparação com 2 ascite benignas (pacientes 1 2) (Figura 2A). Mais importante ainda, a percentagem de células ALDH + em ascites paciente inversamente correlacionada com a progressão de sobrevivência livre. Os pacientes que apresentaram ALDH
HIGH ( 15% ALDH) em suas ascite demonstrou significativamente menor sobrevida livre de progressão em comparação com pacientes com ALDH
LOW ( 15% ALDH) (3 vs. 9 meses, respectivamente;
P
= 0,003) (Figura 2B). Embora seja difícil tirar uma conclusão significativa, devido ao número limitado de ascite utilizados neste estudo, estes dados indicam uma correlação clínica direta entre o estado de ALDH com a resposta do tumor aos agentes de platina e sobrevivência livre de progressão dos pacientes com câncer ovariano.
a ascite de 15 pacientes consecutivos com estágio avançado primário III /IV de câncer de ovário e 2 a partir de (síndrome Miegs) benigna foi obtida e analisada para percentagem de células ALDH + através de ensaio ALDEFLUOR. O histograma na inserção mostra a percentagem de ALDH + células em ascites malignas e benignas (A). As informações clínico-patológico dos pacientes com câncer ovariano foram correlacionados com a percentagem de células ALDH + em suas ascite e avaliada a sobrevivência livre de progressão com ALDH
HIGH ( 15% ALDH) para ALDH
LOW ( 15% ALDH) pacientes (3 vs. 9 meses, respectivamente;
p Art 0,01). (B)
ALDH + ovário células cancerosas exposições decorrem as propriedades da célula-like
estes resultados levaram-nos a caracterizar ainda mais ALDH como um potencial marcador de células-tronco no câncer de ovário. A progressão tumoral pode ser associada com a presença de um subconjunto de células que expressam marcadores de células estaminais e exibem propriedades comportamentais agressivos, incluindo a formação de colónias potencial invasivo e aumentado. Para investigar suas propriedades invasivas, células classificadas (ALDH + vs. ALDH-) foram avaliados através de ensaio de invasão Matrigel. Como se mostra nas figuras 3A 3B, ALDH + células demonstraram mais de 1,7 vezes maior (
p Art 0,01). Na invasão através do Matrigel em comparação com células ALDH-
A2780 /células CP70 foram classificados em ALDH- e ALDH + fenótipos e avaliadas por suas habilidades para a invasão usando câmaras Matrigel invasão (a), de dados quantitativos como representado (B) e colônia potencial de formação na presença e ausência de carboplatina (20 M) foram avaliados através de ensaios de formação de colónia de agar mole (C). A fim de determinar mecanismo possível para as características de células estaminais do cancro em ALDH + células, foram avaliados vários marcadores de “stemness”. células A2780 /CP70 foram classificados em ALDH- e ALDH + fenótipos, o ARN total foi isolado, o ADNc foi preparado e em tempo real quantitativa de RT-PCR foi realizada (D). ** Indica significância estatística (
P
0,01).
Outra medida substituta para caracterizar cancerosas células estaminais do tipo é a capacidade para formar colónias, especialmente na presença de agentes quimioterapêuticos [26]. Consistente com seu potencial invasivo, ALDH + células demonstraram a capacidade de formação de colónias melhorada em comparação com os fenótipos ALDH- (aumento de 2 vezes,
p Art 0,01). Importante, ALDH + fenótipos exibida melhorada capacidade de formação de colónias na presença de carboplatina (aumento de 5,4 vezes,
P
0,01) (Figura 3C). A fim de obter insights sobre os mecanismos potenciais tronco-like dessas células, avaliamos potenciais vias de células-tronco de interesse nestas células. Os dados de RT-PCR mostrou que quase 3 vezes a expressão maior nível de Krüppel-Like Fator 4 (KLF4) em ALDH + células em comparação com os seus homólogos ALDH-. KLF4 pertence ao zinco dedo família de fatores de transcrição, o que tem sido relatada a ser crítico para a manutenção das células-tronco do câncer de mama e seu comportamento agressivo, como migração e invasão resistência anúncio a cisplatina [27] [28]. No entanto, outros mediadores de células-tronco como BMI1, c-myc, OCT3 /4 e S100A1 não apresenta nenhuma alteração visível em sua expressão quando comparada com fenótipos ALDH- (
p Art 0,01). (Figura 3D)
isótipo ALDH1A1 promove propriedades de câncer de ovário-tronco como células ‘
de acordo com a literatura CSC, os nossos dados revelaram expressão elevada de ALDH1A1 isozima na platina células A2780 resistentes /CP70. Para avaliar melhor o papel da ALDH1A1 na manutenção de câncer de células estaminais-como propriedades de células de cancro do ovário resistentes platina, temos subregulado ALDH1A1 isoenzima específica utilizando shRNAs (Figura S1). Contrariamente à sua expressão elevada, a regulação negativa de ALDH1A1 não mostrou quaisquer diferenças consideráveis nas propriedades invasivas destas células (Figura 4A 4B). No entanto, ALDH1A1 knockdown afectou a sua capacidade para formar colónias em ágar mole, demonstrando um decréscimo de 2,5 vezes nas colónias (
P
0,01) (Figura 4C). De modo semelhante, a regulação negativa de ALDH1A1 sozinho sensibilizados significativamente células A2780 resistentes CP70 /platina inerentemente à carboplatina. Considerando IC
50 doses necessárias (82,9 pM e 43,8 pM para as células de controlo negativo e shALDH1A1 respectivamente) para estas células, a redução de cerca de 50% da dose de carboplatina é evidente para as células ALDH1A1 knockdown (
P
0,001 ) (Figura 4D). Em conjunto, estes dados sugerem que o status ALDH1A1 é um dos fatores críticos para manter as propriedades da célula-tronco-like e de resistência de platina em câncer de ovário.
lentivirais expressando shRNAs específicas ALDH1A1 ou nontargeting shRNAs foram transfectados em A2780 células /CP70 e seu efeito sobre as propriedades da célula-tronco-like foram avaliados quanto à potencial invasivo utilizando câmaras de Matrigel invasão (a), os dados quantitativos como representado (B), potencial clonogênica usando macia formação de colónias de agar (C, e inibição de crescimento dependente carboplatina por CellTiter-Glo Luminescent Viabilidade celular Assay (D). A significância estatística foi avaliada utilizando
t de Student.
ALDH1A1 controla postos de controle do ciclo celular pela regulação da KLF4 e as proteínas p21
a expressão aumentada de KLF4 em ALDH + células (Figura 3D) levou-nos a avaliar qualquer relação funcional entre ALDH1A1 e KLF4. Embora ALDH1A1 knockdown não afectou o nível de KLF4 ARNm, uma diminuição significativa nos níveis de proteína KLF4 foi evidenciada nestas células (Figura 5A ). Considerando que o estado funcional do regulador do ciclo celular p21 está intimamente relacionada com a função de KLF4, os níveis de mRNA e de proteína de p21 também foram avaliados. Como esperado, ambos os transcritos da proteína e níveis de p21 foram ALDH1A1 drasticamente diminuída em ALDH1A1 A2780 deficiente /CP70 células (Figura 5A). Dado que o carácter ALDH1A1 influenciou a expressão de proteínas do checkpoint do ciclo celular p21 /CDK4, analisou-se ainda mais os perfis do ciclo celular destas células. Os dados da citometria de fluxo indicam claramente diminuída população de células G1 (50,25% para 42,10%) e um aumento compensatório na acumulação de células em fases S e G2 (Figura 5B). Devido ao facto de que as células em replicação activa (fases S e G2) são mais vulneráveis ao stress genotóxico em comparação com a sua não se dividem ou outras fases inquietas (G0 e G1), a re-sensibilização de células deficientes ALDH1A1 pode ser em parte atribuível para as mudanças na distribuição de ciclo celular. Além disso, também confirmaram que o status KLF4 afeta os níveis de expressão p21 em A2780 /células CP70 (Figura S2A S2B). No entanto, a avaliação da atividade de ALDH e expressão ALDH1A1 em células não apresentam quaisquer mudanças perceptíveis, sugerindo KLF4 provavelmente serve a jusante para ALDH1A1 (Figura S2C).
ALDH1A1 A2780 proficientes e deficientes /células CP70 foram avaliados quanto à expressão de haste -like marcador de células e ciclo celular KLF4 proteína p21 ponto de verificação por meio de RT-PCR e análise por Western blot (A). distribuições de ciclo celular de células foram analisadas após a fixação das células em coloração de metanol e de iodeto de propídio 70% seguido por citometria de fluxo (B). As células apoptóticas foram detectadas após a coloração das células com actividade de APC-anexina V e 7-AAD de acordo com as instruções do fabricante e analisadas por citometria de fluxo (C).
Para avaliar ainda mais os genes responsáveis pela quimiorresistência celular e regulação do ciclo com base no status de ALDH1A1, temos utilizado RT
2 matriz Profiler PCR para o ser humano Resistance Ciclo Celular (Ambion). Os perfis de expressão de genes em comparativos ALDH1A1 knockdown versus as células de controlo revelou uma diminuição significativa da expressão do reguladores do ciclo celular CDKN1A (p21) (0,27 vezes) e CDK4 (0,26 vezes), o que confirma o seu papel em conjunto com KLF4 ( tabela 1).
de nota, com sensibilidade de platina restaurado a partir de ALDH1A1 knockdown, expressão do fator pró-apoptótica BAX foi regulado para cima quase 3,95 vezes. ALDH1A1 knockdown demonstraram aumento do número de células em fase de apoptose precoce em comparação com o controlo. Após exposição de células a 1,0 uM estaurosporina durante 6 horas, um aumento dramático nas células apoptóticas precoces foi observada em células deficientes ALDH1A1 em comparação com as suas partes contrárias ALDH1A1 proficientes (35,3% vs 20,3%) (Figura 5C). Estes dados sugerem que as células ALDH1A1 knockdown são mais susceptíveis à apoptose induzida pela Bax, que tem sido bem descrito na inibição de checkpoint do ciclo celular p21 [29].
mediada por ALDH1A1 de resistência de platina correlaciona-se a redes de reparação de ADN alteradas
checkpoints do ciclo celular intactos e resposta a danos no ADN (DDR) mecanismos de sinalização são importantes para a capacidade da célula para combater com diferentes tipos de insultos genómicas e progressão ordenada do ciclo celular. regulação No entanto, uma característica comum das células cancerosas é alterada destas cascatas de sinalização para adquirir alterações genéticas adicionais necessários para a re-diferenciação e sobrevivência, assim, exibir resistência terapêutica. Da mesma forma, as células ALDH1A1 exibida regulação alterada do ciclo celular mecanismo de ponto de verificação /p21 mediada KFL4, que dirige principalmente a inibição de G1 para S e de G2 para M progressão em resposta ao dano no DNA para dar mais tempo para a célula de reparar. Considerando-se a associação de PARP-1 em reparação de danos no DNA carboplatina induzida, avaliamos o seu envolvimento em células ALDH1A1. PARP-1 níveis progressivamente aumentada até 45 minutos após o tratamento com carboplatina (Figura 6A e 6B). No entanto, a regulação negativa de ALDH1A1 resultou em diminuição significativa (1,8 vezes) nos níveis totais de PAR (actividade PARP) (Figura 6C) em comparação com células proficientes ALDH1A1 (
p
= 0,012).
ALDH1A1 proficientes (controle) e células deficientes (shALDH1A1) A2780 /CP70 foram avaliados por suas habilidades para reparar carboplatina induzida rupturas simples dos filamentos por olhar para a indução dependente do tempo de PARP-1 níveis de proteína por western blot (a), densitometria de borrões por Image J ( B) e a actividade total de PARP foi testada por medição dos níveis de PAR (C). Para avaliar as proteínas DDR expressão e reparação dependentes ALDH1A1, lisados de células inteiras foram normalizados para proteínas totais e análise de Western blot foram realizados usando anticorpos como representado (D).
Vários estudos recentes sobre o cancro da mama de haste células indicam regulamentação das redes de reparo do DNA, em particular uma relação inversa entre o estado ALDH1A1 e expressão do gene BRCA1 [15], [16] alterada. Além disso, em resposta a danos no ADN, BRCA1 é conhecida para regular os pontos de verificação do ciclo celular e a escolha das vias de reparação de ADN para reparação atempada destas lesões do ADN [16]. Coerentes com os dados de células-tronco do câncer de mama, a análise Western blot revelou uma relação inversa entre ALDH1A1 e expressão BRCA1 em A2780 /células CP70, sugerindo ALDH1A1 expressar câncer de células estaminais-como ovarianos mais propensos a perder ou expressar baixos níveis de BRCA1. Uma análise posterior revelou baixo regulação da ALDH1A1 resposta induzida danos no DNA espontânea, expressando a proteína γ-H2AX (um marcador de rupturas de filamentos duplos). Este é também coincidia com os níveis diminuídos de proteínas de reparação da excisão) (XRCC1, replicação checkpoint proteína cinase 1 (Chk1) e outras formas de stress associado à replicação anemia de Fanconi (FA) -BRCA produtos de genes FANCD2 e FANCJ [30] – [32]. Em conjunto, estes dados sugerem que as células estaminais de cancro do ovário, como pode manter a resistência à terapêutica ao expressar ALDH1A1 e esgotamento dos quais, ab-roga G1 e pontos de verificação em fase S (Figuras 5A e 6C) que levam à replicação estresse (Figura 5B). Embora ALDH1A1 células empobrecido acumulados em fases S e G2, o estado de fosforilação de proteínas de replicação ponto de verificação Chk1 (Ser317) e expressão de garfo associada proteínas da via FA replicação FANCD2 e FANCJ foram afetados. Isto também é conferida por indução de γ-H2AX, um marcador para a DSB e sobrevivência celular reduzida. Uma vez que as proteínas de Chk1 e FA são importantes para o ponto de controlo da replicação e à estabilidade de garfos de replicação paralisadas, a resposta a danos no ADN espontânea nestas células pode ser atribuído ao defeito nestes proteínas (Figura 6D). Para identificar os sinais de rede molecular que são expressos diferencialmente em células que expressam ALDH1A1, que inicialmente avaliada a expressão de via A anemia de Fanconi e resistência tumor a agentes quimioterapêuticos. Consistentemente, os nossos resultados demonstraram uma correlação direta entre o estado ALDH1A1 e expressão FANCD2. Juntos, nossos dados indicam uma ligação entre o estado ALDH1A1 à resistência stemness e platina de células de cancro do ovário por regulamento alterado de obras de reparo do DNA.
Discussão
Vários potenciais CSCs ovarianos marcadores de superfície específicos foram descritos, tais