Abstract

O câncer de pâncreas é um dos cânceres mais letais. O aumento da incidência e mortalidade indica que existe ainda muito falta de detecção e tratamento da doença. Isto é em parte devido à falta de sintomas específicos durante os estágios iniciais da doença. Vários receptores de factores de crescimento têm sido associadas com o cancro pancreático. Aqui, nós investigamos se uma abordagem interferência de RNA alvo para IGF-IR pode ser eficaz e eficiente contra o crescimento do câncer de pâncreas e metástase. Para isso, foram avaliados os efeitos da inibição de IGF-1R utilizando ARN interferente pequeno (ARNsi) sobre o crescimento de tumores e metástases em HPAC e PANC-1 linhas de células do cancro do pâncreas. Descobrimos que silenciando IGF-1R inibe o crescimento do câncer de pâncreas e metástase, bloqueando as vias principais de sinalização, tais AKT /PI3K, MAPK, JAK /STAT e EMT. Silenciamento de IGF-1R resultou num efeito anti-proliferativo em linhas celulares do cancro do pâncreas PANC-1 e HPAC. invasão Matrigel, transpoço migração e ensaios de cura de feridas também revelou um papel para o IGF-1R nas propriedades metastáticas de câncer de pâncreas. Estes resultados foram confirmados por meio de análise Western blot de intermediários chave envolvidos na proliferação, mesenquimais transição epitelial, migração e invasão. Além disso, ensaios de agar mole mostraram que o silenciamento de IGF-1R também bloqueia a capacidade de formação de colónias de células de cancro do pâncreas e

in vitro.

Western blot, assim como, a análise de citometria de fluxo revelou a indução de apoptose em IGF-1R células silenciadas. Curiosamente, o silenciamento de IGF-1R também suprimiu a expressão de β receptor de insulina. Todos estes efeitos, juntos, controlam de forma significativa o crescimento de células de câncer pancreático e metástase. Para concluir, os nossos resultados demonstram a importância do IGF-1R em câncer pancreático

Citation:. Subramani R, Lopez-Valdez R, Arumugam A, Nandy S, Boopalan T, Lakshmanaswamy R (2014) Segmentação Insulin-Like Fator de crescimento 1 crescimento Cancer receptores inibe pâncreas e metástase. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10.1371 /journal.pone.0097016

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de janeiro de 2014; Aceito: 15 de abril de 2014; Publicado em: 08 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Subramani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pela Texas tech University Health Sciences Center Paul L. Foster School of Medicine fundos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de câncer morte relacionada embora seja apenas o décimo terceiro tumor maligno mais comum no mundo [1]. A taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com câncer de pâncreas é o menor relatou para qualquer tipo de câncer, o que é inferior a 1 [2]%. Isto é principalmente porque o câncer de pâncreas é difícil de detectar nas fases iniciais devido à falta de sinais de alerta ou sintomas [1]. Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC), que é a forma mais comum de cancro esta extremamente agressivos, é altamente invasivo e metastático e é altamente resistente a todas as formas de terapias existentes [3]. Os pacientes que são diagnosticados com PDAC em estágios avançados têm pouca esperança de ressecção cirúrgica eficaz [1] e outros tratamentos como radioterapia, quimioterapia (gemcitabina, 5-fluorouracilo, cisplatina, paclitaxel, docetaxel, etc.) ou terapias específicas (Erlotinib-Tarceva) [4] No momento, não oferecem muito benefício também. A natureza assintomática da doença em seus estágios iniciais garantiu que PDAC continua a ser um cancro mortal e quase intratável apesar de várias tentativas para encontrar melhores estratégias de tratamento [5]. De acordo com o relatório mais recente, cerca de 280.000 novos casos de câncer de pâncreas são diagnosticados a nível mundial e a incidência de câncer de pâncreas continua a aumentar [6], [7]. O aumento da incidência e mortalidade indica que existe ainda muito falta de detecção e tratamento da doença. Portanto, é absolutamente necessário para encontrar a melhor estratégias de diagnóstico e terapêuticas para o tratamento desta doença.

Vários receptores de factores de crescimento tais como receptor do factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF-1R), receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) , etc., são expressas de forma aberrante em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas [8]. Aumento dos níveis de expressão de IGF-1R estão associados com maior risco de desenvolver várias neoplasias [9]. O eixo de sinalização de IGF-1R é altamente activada durante as fases iniciais da carcinogénese do pulmão, onde o papel da sinalização de IGF-1R foi demonstrada não apenas na formação do tumor primário, mas também em progressão para o adenocarcinoma do pulmão mais agressivo [10]. Jie Tang et al., 2013 relataram níveis elevados de expressão de IGF-1R em amostras de tecido de tumor a partir de 25 de 36 pacientes com cancro epitelial do ovário. Eles também relataram níveis consistentemente mais elevados de IGF-1 em culturas de células de cancro primário (230 ng /ml) em comparação com culturas de células normais de ovário de tecido (101,9 ng /ml) [11]. sinalização IGF-1R activa cascatas de sinalização intracelular que incluem fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K), AKT, Rac e MAP quinase (MAPK) [12], [13]. Estas vias regulam genes envolvidos em várias funções celulares tais como a proliferação, a sobrevivência, a diferenciação, a transformação e a apoptose [10]. Além disso, o IGF-1R como alvo 70 a 100% das vias metabólicas essenciais que são frequentemente alteradas em PDAC patogénese [14]. Segmentação de IGF-1R foi já demonstrado para melhorar os efeitos terapêuticos dos inibidores de mTOR em carcinoma de células renais metastático, [15]. Da mesma forma, no cancro epitelial de ovário humano, a segmentação de IGF-1R de nucleótidos anti-sentido proliferação reduzida de 70% e clonogenicidade por 10 vezes [11]. Em ambos in vitro e em sistemas in vivo, foi mostrado um antagonista de IGF-1R (anticorpo monoclonal MK-0646), para regular de forma significativa para baixo inibidor ligada ao X de apoptose de proteínas (XIAP), que tem sido mostrado para ser envolvido na sobrevivência celular e inibição de morte celular no cancro colorrectal [16]. Além disso, o IGF-1R terapias direcionadas já avançaram para a fase I de ensaios clínicos para próstata, mama, colo, fígado, sarcoma sinovial, etc., [12], [17] – [19] com promissores resultados iniciais. No entanto, o benefício potencial do uso de IGF-1R terapia-alvo no câncer de pâncreas não é totalmente explorado. Além disso, ainda existe uma falta de conhecimento detalhado sobre os mecanismos moleculares exactos pelos quais IGF-1R regula carcinogénese pancreática.

Portanto, com base na evidência de montagem para a eficácia de direccionamento de IGF-1R em um amplo espectro de cancros , nós determinamos os efeitos da segmentação IGF-1R em câncer pancreático neste estudo. O objetivo final deste estudo é identificar se a sinalização IGF-1R é um alvo terapêutico eficaz para o cancro do pâncreas com o potencial de traduzir rapidamente em uso clínico. Aqui demonstramos claramente que o bloqueio de expressão IGF-1R intensifica a apoptose e suprime a invasão celular, migração e metástase através da modulação da PI3K /AKT, MAPK e vias JAK /STAT sinalização em células de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos realizados foram aprovados pelo e executado seguindo as orientações do Comité das Texas tech University Health Sciences Center Institucional de Biossegurança.

linhas celulares e Reagentes

linhas pancreático humano de células ductais de adenocarcinoma, PANC-1 (carcinoma epitelióide), MIA PaCa-2 (carcinoma) e HPAC (adenocarcinoma) foram adquiridos da American Type Culture Collection, e foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de FBS, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de dióxido de carbono.

TransIT- siQUEST reagente de transfecção foi adquirido a Bio Mirus (Madison, WI, EUA). A 6,5 milímetros Transwell com 8,0 uM insertos de membrana de policarbonato de poro foi obtido de Corning Incorporated (Corning, NY, EUA). BD Matrigel (Bedford, MA, EUA) e BD Pharmingen Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit I (San Diego, CA, EUA) foi obtido a partir de BD Biosciences. BSA foi adquirida a Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EUA). siRNA alvejando IGF-1R foi comprado de Origene (Rockville, MD, EUA). MTS reagente [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio] foi obtido a partir de Promega (Madison, WI, EUA). Mammalian reagente de extracção de proteína (MPER) foi adquirido a partir de Thermo Scientific (Rockford, IL, EUA)

os anticorpos primários que se seguem foram utilizados neste estudo:. PAKT (SC-101629), AKT (5298), Bcl- 2 (SC-783), pERK, (SC-101760), ERK (SC-94) e STAT3 (H-190) (sc-7179) (Santa Cruz, CA, EUA); IGF-1R (3027), Notch 2 (4530P), Caracol (3879), E-caderina (3195), N-caderina (4061), Zeb (3396), Vimentin (5741), Slug (9585), Bax (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), pPI3K p85 (4228), p85 PI3K (4292), IR-β (3024), Pirs-1 (2388), IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), a COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), a mTOR (4517), p-p70s6kinase (9206) e p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, MA); Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, EUA); β-actina (Sigma Aldrich, (St. Louis, MO, EUA).. Os anticorpos secundários adequados foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA)

pâncreas adenocarcinoma do tecido de matriz

microarray pâncreas adenocarcinoma tecidos (TMA) foi obtido a partir de US Biomax, Inc., Rockville, MD O TMA contendo parafina amostras incorporados fixadas em formalina de adenocarcinoma do pâncreas e tecidos normais do pâncreas foi submetido a imuno-histoquímica (IHQ) para determinar os níveis de expressão IGF-1R. aprovação Institutional Review Board não era necessária para a utilização de TMAs.

imuno-histoquímica (IHQ)

IHC para o antígeno de IGF-1R foi realizada utilizando o pâncreas adenocarcionma TMA. TMA foram primeiro incubadas num forno a 58 ° C durante 2 h, para melhorar a adesão do tecido para as lâminas de vidro carregadas. Desparafinização foi então levada a cabo para remover o meio incorporado utilizando a incubação xileno durante 20 minutos. TMA foram gradualmente re-hidratadas em banhos de álcool de série (100, 95, 70, 50 e 30%), seguido por uma lavagem com água destilada por cinco minutos. Induzida pelo calor com recuperação de epítopo trilogia (Cell Marque, Rocklin, CA) foi então realizada para desmascarar os locais antigénicos no interior das secções de tecido. TMA foram bloqueados em TBS contendo 1% de soro fetal de vitela e 1% de albumina de soro de bovino durante 15 min. reagente de bloqueio Perox-livre (Cell Marque, Rocklin, CA), também foi adicionado durante 10 min para bloquear o anticorpo não específico de ligação. TMA foram incubadas com o anticorpo do IGF-1R (diluição 1:50) durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram então lavadas três vezes em PBS durante 5 minutos e incubou-se com ultra Marque polyscan HRP etiqueta (celular Marque, Rocklin, CA) durante 1 h à temperatura ambiente. TMA foram então lavadas três vezes em PBS e coradas com solução de cromogénio (Cell Marque, Rocklin, CA) durante 20 min. reacção de coloração cromogénio foi parada por lavagem com água destilada. núcleos de células A contracoloração foi realizada com hematoxilina incubação durante 40 seg. TMA foram enxaguadas com água destilada e desidratado com banhos de etanol em série (30, 50, 70, 95 e 100%), seguido por um banho de xileno. Finalmente, TMAs foram lamínulas com a mídia de montagem (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL) e imagens digitais foram captadas com uma Nikon Microscope- ECLIPSE 50i.

O silenciamento de IGF-1R na PANC-1 e HPAC Células

siRNA alvejando IGF-1R foram transientemente transfectados para células PANC-1 e HPAC, utilizando o reagente de transfecção Mirus bio TransIT siQUEST. Mexidos siARN (uma sequência não-silenciamento) foi utilizada como um controlo. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2,5 x 10

5 células /poço. As células foram transfectadas com diferentes concentrações e subtipos diferentes (A, B e C) de siARN que variam de 10 a 50 nM durante 48 h ou 72 h, usando Mirus siQUEST Transfection Reagent. A proporção de siRNA para o reagente de transfecção foi mantida como 1:0.5 para silenciamento eficaz sem toxicidade de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações finais de siRNA foram escolhidos com base em estudos de dose-resposta. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram usadas para o isolamento de proteínas ou clonogenicidade, invasão, migração e, estudos. A apoptose foi estudada a 48 e 72 horas após o silenciamento do IGF-1R.

Ensaio de viabilidade celular

células PANC-1 e HPAC foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 0,3 x 10

4 células /poço e 0,5 × 10

4 células /cavidade, respectivamente, e transfectadas com IGF-1R, a uma concentração final de 30 nM de subtipo “B” e 50 nM de subtipo “a” durante 48 h juntamente com controlos mexidos. Após 48 h de transfeco, a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio de MTS. A absorvância foi lida a 490 nm, a fim de calcular as células viáveis ​​percentuais.

clonogenicidade /Formação de Colónias em agar mole Ensaio

ensaio de formação de colónias foi realizada a fim de medir a capacidade de sobrevivência in vitro em de uma única célula para crescer em uma colônia em um ambiente de crescimento independente de ancoragem. Resumidamente, após a transfecção de células PANC-1 e HPAC com IGF-1R siRNA ou mexidos controlo durante 48 h, as células transfectadas foram semeadas em meio completo a uma densidade de 2 × 10

4 células em pratos de 60 mm contendo uma parte superior camada de agar a 0,7% e uma camada de fundo de 1% de agar. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 3 a 4 semanas, e depois coradas com 0,2% de violeta de cristal. Colónias de maior do que 20 células foram contadas manualmente.

Cicatrização Ensaio

celular migrando capacidade do IGF-1R silenciados células de câncer pancreático foram medidos utilizando o ensaio de zero. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3,5 x 10

5 células /poço para o IGF-1R transfecção. Neste densidade, PANC-1 e as células atingiram a confluência HPAC monocamada após 48 × h. Uma ferida em linha reta ou arranhão foi então delicadamente criado nas monocamadas de células com uma ponta de pipeta estéril. As células destacadas pela zero foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, as culturas foram suplementadas com meio fresco e monitorizados durante 96 h a 37 ° C utilizando o CT BioStation (Nikon Instruments Inc. Melville, Nova Iorque, EUA) para observação contínua. O BioStation foi automaticamente programado para capturar imagens em intervalos de 2 h até 96 h. Migração imagens foram capturadas e documentado em diferentes pontos de tempo, utilizando o software NIS-Elemento AR.

migração e invasão Ensaio

O efeito de IGF-1R em siRNA propriedades invasivas das células de cancro do pâncreas foi avaliada usando Transwell ensaios de migração e invasão. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células PANC-1 e células HPAC foram tripsinizadas e ressuspensas em meio de FBS-livre RPMI-1640. Para o ensaio de migração, um total de 5 × 10

3 células foram plaqueadas na câmara superior do Transwell com uma membrana de policarbonato não revestida (inserção de 6,5 mm de diâmetro, tamanho de poro 8,0 ìm; Corning Incorporated). Para o ensaio de invasão, 2 × 10

4 células foram plaqueadas na câmara superior do Transwell com uma membrana de policarbonato revestidas com Matrigel (1 mg /mL). meio RPMI-1640 com FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após incubação durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO

2, as células na superfície inferior da membrana foram fixadas com 5% de formalina e coradas com violeta de cristal a 0,2%. As células que não migraram no lado superior do inserto foram retiradas com um cotonete. Imagens das células que migraram para a superfície inferior da membrana foram capturados de forma cega em 5 campos microscópicos distintos com 20 × ampliação. O número de células migradas foi contado invadidas ou a partir de cinco ou seis campos seleccionados aleatoriamente de uma maneira cega. Experimentos foram realizados em triplicata para significância estatística.

Análise da Cell Death

O efeito do IGF-1R silenciando sobre a apoptose foi medida usando as I. Células anexina V-FITC kit de detecção de apoptose foram colhidas 48 h e 72 h pós-transfecção e depois coradas com iodeto de anexina V-FITC e de propidio de acordo com as instruções do fabricante. A percentagem de morte celular ou apoptose foi quantificada utilizando um citómetro de fluxo (FACS Accuri C6) [20].

Western blotting

células PANC-1 e HPAC foram transfectadas com IGF-1R siRNA durante 48 h. Após a incubação, a proteína foi extractada a partir de células transfectadas por lise da membrana celular usando proteínas de mamíferos reagente de extracção (MPER) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de proteína foi quantificada usando metodologia padrão de BSA. Quantidades iguais de proteína foram carregadas e separadas por géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA em 1 x TBST durante 1 h e sondadas com um painel de anticorpos primários contra pAKT, AKT, Bcl-2, Perk, ERK, STAT3, IGF-1R, o entalhe 2, caracol, E-caderina , N-caderina, Zeb, Vimentin, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K p85, p85 PI3K, IR-β, Pirs-1, IRS-1, pSTAT3, COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 ou β-actina. Após a lavagem com TBS-T, a membrana foi incubada com anticorpos acoplados a peroxidase de rábano secundária e, em seguida, as bandas positivas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada.

Análise estatística

As diferenças entre os grupos foram analisadas por desemparelhado teste t de Student. O GraphPad Prism 5 pacote de software versão 5.03 foi usado para fazer todos os cálculos estatísticos. Probabilidade valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

IGF-1R é altamente expresso em cancros pancreáticos

Foram examinados os níveis de IGF-1R expressão in. linhas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático (HPAC, MIA PaCa-2 e PANC-1) utilizando western blot. Todas as três linhas celulares tinham um elevado nível de expressão de IGF-1R em comparação com pâncreas normal. HPAC teve a maior expressão de IGF-1R entre as três linhas de células pancreáticas que analisamos enquanto PANC1 tinha a menor expressão. Então, optamos por utilizar HPAC e células PANC1 para todas as nossas experiências com base na sua expressão IGF-1R (Figura 1A). A análise imuno-histoquímica de IGF-1R em microarray pâncreas adenocarcinoma de tecido (TMA) foi feito para confirmar ainda mais o papel fisiopatológico da IGF-1R na PDAC patogênese. PDAC tecidos tumorais em vários estágios mostraram aumento da expressão de IGF-1R em comparação com tecidos normais do pâncreas (Figura 1B).

(A) Os níveis de expressão de IGF-1R em PANC-1, HPAC e MIA PaCa-2 eram em comparação com células pancreáticas normais de ratos usando western blot. (B) análise imuno-histoquímica Representante do IGF-1R pelo estágio do tumor em tecidos de adenocarcinoma do pâncreas e do tecido do pâncreas normal. (C) PANC-1 e as células foram transfectadas com HPAC três predesigned IGF-1R siRNAs (A, B e C) em três concentrações diferentes (10, 30 e 50 nM), juntamente com o controlo scrambled siARN. Silenciando eficácia do IGF-1R siRNA foi determinada utilizando western blot em PANC-1 e células HPAC. (D) Efeito de IGF-1R siRNA na viabilidade das células de PANC-1 e HPAC. As células foram transfectadas com 30 nM e 50 nM de ARNsi de IGF-1R em PANC-1 e células HPAC respectivamente. A viabilidade celular foi ensaiada a 48 h após a transfecção usando o kit de ensaio MTS. Os resultados representados como média ± desvio padrão (n = 3). (E) A inibição da expressão blocos IGF1R formando capacidades de células de câncer de pâncreas, PANC-1 e HPAC colônia. Um ensaio de agar mole foi utilizado para estudar a capacidade de formação de colónias de células PANC-1 e HPAC. Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, células PANC-1 e HPAC foram deixadas crescer em agarose a 0,7% em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% durante 16 e 22 dias, respectivamente. Mostrado aqui são fotos representativas da formação de colónias de duas experiências independentes realizadas em triplicado. (F) colónias percentuais em ambas as células PANC-1 e HPAC foram calculados com controle mexidos (SCR) que serve como linha de base.

Silenciando IGF-1R utilizando siRNAs em linhas celulares de cancro do pâncreas

para silenciar a expressão de IGF-1R, foi utilizado 3 siRNAs diferentes em concentrações que variam de 10 a 50 nm. Mexidos siARN que não se destina a qualquer gene foi utilizado como um controlo. siRNA eficiência de transfecção variou com base no subtipo e concentração de ARNsi para ambas as linhas celulares. Por conseguinte, os níveis de expressão do IGF-1R foram significativamente reduzida a uma concentração de 30 nM de “B” e 50 nM de “A” para células cancerosas PANC-1 e HPAC, respectivamente (Figura 1C). Por isso, foram seleccionados estas duas doses de siRNA para todos os estudos subsequentes.

Silenciamento de IGF-1R Induz efeito antiproliferativo em linhagens de células do cancro do pâncreas

Uma vez que o IGF-1R é conhecido por estimular a proliferação celular, examinámos o efeito de silenciamento de IGF-1R na proliferação de células de adenocarcinoma pancreático. Silenciamento de IGF-1R diminuiu a viabilidade de células de cancro do pâncreas em 48 h após a transfecção comparativamente com mexidos siARN transfectadas células de controlo. Apenas 45.24% 47,28% das células eram viáveis ​​após a inibição de IGF-1R em células PANC1 e HPAC, respectivamente (Figura 1D). O efeito anti-proliferativo do IGF-1R de segmentação é altamente significativa em ambas as linhas de células de cancro pancreático altamente agressivos. Estes resultados sugerem um papel fundamental para o IGF-1R na proliferação de células de câncer de pâncreas agressivos.

Silenciando IGF-1R inibe o crescimento Anchorage independente de células do cancro do pâncreas

potencial de crescimento Anchorage-independente células de cancro é um dos mais importantes e bem conhecidas características de células transformadas. Os ensaios de agar mole em células PANC-1 e HPAC foram realizadas para avaliar se o IGF-1R knockdown colónia influenciado potencial dessas células formadoras. Silenciamento de IGF-1R reduziu dramaticamente a capacidade de colónias em ambas as linhas de células do cancro do pâncreas (Figura 1E) formando. Os resultados de três experimentos independentes foram quantificados, o que revela 85% de inibição da formação de colónias capacidade de IGF-1R silenciados células de câncer de pâncreas (Figura 1F)

A migração celular do cancro do pâncreas IGF-1R silenciamento reprimida /motilidade

(i) a cicatrização de feridas ensaio.

capacidade de formação reduzida colônia é geralmente associado com uma perda correspondente de invadir capacidades de células cancerosas [20]. O ensaio clássico de cicatrização da ferida foi realizada para testar o papel do IGF-1R na regulação da capacidade migratória das células de cancro do pâncreas. As monocamadas de células foram riscados para criar uma ferida para monitorar a capacidade de migrar de controlo e tanto o IGF-1R suprimida células de cancro do pâncreas. IGF-1R suprimida células PANC-1 e HPAC exibiram reduzidas capacidades migratórias comparados com os controles mexidos. HPAC mexidos células controle reformadas uma monocamada completa no prazo de 48 h e PANC-1 mexidos células controle reformadas uma monocamada completa dentro de 96 horas. Em IGF-1R suprimida células PANC-1 e HPAC, uma monocamada completa não foi reformado, mesmo após 96 h (Figura 2A, B C).

(A) ensaio de cicatrização de feridas foi realizada para avaliar a migração de células PANC-1 e HPAC após o silenciamento do IGF-1R. Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, ferida da capacidade de células de cura foram monitorizados com automatizado Nikon BioStation CT em intervalos de 2 h até 96 h. (B C): A migração celular foi determinada pela taxa de células que se deslocam no sentido da área riscada. A percentagem de migração foi calculada pelo software NIS-Elemento AR. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes. (D) Silenciamento de expressão de IGF-1R inibe a migração de células PANC-1 e HPAC. Celulares habilidades migratórias foram determinadas usando transpo� não revestido câmaras de Boyden. células após a transfecção PANC-1 e HPAC foram deixadas migrar através dos poros da superfície inferior da Transwell. células migradas foram fixadas e coradas com 0,2% de violeta de cristal em 5% de formalina. Os dados são representativos de cinco imagens microscópicas de campo aleatório tomadas com ampliação de 20x (E) Percentagem de migração para Transwell ensaios é mostrado para o IGF-1R silenciados células PANC-1 e HPAC a partir dos resultados de três experiências independentes.

(ii) ensaio de migração Transwell.

migração reprimida de PANC-1 e células HPAC alcançados através do bloqueio de expressão IGF-1R foi ainda confirmada usando transpo� ensaios de migração. Uma vez mais, em comparação com os controlos, o IGF-1R siARN transfectadas PANC-1 e células HPAC mostraram uma diminuição significativa no número de células que migraram (Figura 2D E). Isto indica fortemente que o bloqueio da expressão do IGF-1R suprime as capacidades que migram de ambas as linhas de células de cancro pancreático agressivos.

knockdown de IGF-1R Inibe a invasão celular

invasão celular é um dos passos críticos envolvidos na metástase de células de cancro. Fuga de células cancerosas de local primário de origem para locais distantes ocorre quando as células adquirem a capacidade de penetrar na membrana basal de tumor e invadem o tecido circundante e, eventualmente, para o sangue e sistemas linfáticos. Em ensaios de invasão de matrigel in vitro utilizando câmaras de Boyden Transwell que imitam a membrana basal interna do microambiente do tumor foram utilizados para investigar o potencial invasor de IGF-1R siARN transfectadas células de cancro do pâncreas. Consistente com a redução da capacidade migratória, as células tratadas com o IGF-1R siARN demonstrou uma redução significativa na capacidade de invasão de células de mais de 85% em células HPAC PANC-1e em comparação com as células tratadas com siRNA mexidos (Figura 3A B). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o silenciamento de IGF-1R, não só diminui a capacidade de migração, mas também as propriedades invasivas das células de adenocarcinoma ductal pancreático.

(A), PANC-1 e células HPAC invasão foi avaliada em câmaras Transwell revestidas com matrigel. As células que invadiram a inserção revestida de matrigel foram fixadas, coradas e capturado a 20 × ampliação. (B) Número de células invadidas foram contadas e expressas como percentagem invasão. As experiências foram efectuadas em triplicado (C) de IGF-1R silenciamento inibe a expressão de vários marcadores de transição epitelial-mesenquimal. Total de lisados ​​de proteína de controle mexidos e IGF-1R silenciados PANC-1 e células HPAC foram analisadas para a expressão de Notch-2, Caracol, E-caderina, N-caderina, Zeb, vimentina, e Slug com controle de β-actina interno. (D) Os valores de marcadores Densitometic EMT são apresentados como% de expressão. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1R silenciados, HS-HPAC mexidos, HI-HPAC IGF-1R silenciados.

Silenciando Transição IGF-1R Blocos epitelial-mesenquimal (EMT ) em células de cancro do pâncreas

o processo de invasão de células de cancro é activado por EMT que é o iniciador da cascata metastática [21]. As células que sofrem EMT irá atingir propriedades semelhantes a células estaminais que aumentam a proliferação celular, metástase, etc. [22]. Os factores relacionados com a EMT como Notch-2, Caracol, N-caderina, Zeb, vimentina e Slug foram significativamente reduzidos em cima silenciar IGF-1R em células PANC-1 e HPAC (Figura 3C D). Curiosamente, a análise de Western blot em células reprimidas IGF-1R mostraram um aumento da expressão de E-caderina; perda desta molécula de adesão célula-célula é pensado para promover a invasão e metástase [23]. Estes dados indicam claramente que silenciando IGF-1R em células de câncer pancreático resultados na inibição de proteínas que favorecem EMT câncer pancreático.

Silenciando IGF-1R induz a apoptose

Regulamento de apoptose em células de câncer de pâncreas foi analisada sobre o IGF-1R silenciamento utilizando Anexina V-FITC apoptosis Detection Kit I. análise citométrica de fluxo mostrou uma acentuada indução de apoptose de morte /célula por IGF-1R silenciamento em células de cancro do pâncreas (45,4%, 55,4% em PANC-1 e 47,7%, 59,5% em HPAC foi observado após 48 h e 72 h de pós transfecção, respectivamente) (Figura 4A . B)

(a) inibição IGF1R induz a apoptose em PANC1 células HPAC. a transfecção as células post foram coradas com iodeto de anexina-V-FITC e de propídio seguido por citometria de fluxo. A percentagem de apoptose precoce (quadrante inferior direito), apoptose (quadrante superior direito), tardias células apoptóticas e necróticas (quadrante superior esquerdo), e vivem células saudáveis ​​(quadrante inferior esquerdo) são mostrados. (B) A porcentagem de apoptose e morte celular é resumida por três experiências independentes em células PANC-1 e HPAC. inibição (C) de IGF-1R induz receptor de morte e mitocondrial mediada por apoptose em PANC1 células HPAC. Bax, Bcl-2, caspase 8, caspase 3 clivada e PARP e expressão β-actina foi ensaiada utilizando Western blot em células PANC-1 e IGF-1R HPAC siRNA-transfectadas. (D) mostra a análise de densitometria representativas potenciação significativa da apoptose através de vias intrínseca e extrínseca. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1R silenciados, HS-HPAC mexidos, HI-HPAC IGF-1R silenciados.

Para identificar o mecanismo molecular envolvido neste indução de apoptose , investigaram o padrão de várias moléculas de sinalização de apoptose expressão em células de cancro pancreático. As células transfectadas com IGF-1R siARN tinha aumentado significativamente a expressão da Bax, caspase 8, Caspase3 e PARP clivada em comparação com as células tratadas com siRNA mexidos (Figura 4C D). Silenciamento de IGF-1R também diminuiu a proteína anti-apoptótica de Bcl-2 em ambos PANC-1 e células HPAC (Figura 4C D). Estes dados revelam que o IGF-1R siRNA induz a apoptose através de ambas as vias receptor de morte e mitocondrial mediadas de apoptose.

Silenciando IGF-1R Altera Key moléculas sinalizadoras

A inibição de um único membro de uma sinalização específica via ou dirigida a uma única função celular particular pode ser insuficiente para o tratamento de doenças complexas como o câncer. Portanto, tendo como alvo moléculas com o maior impacto sobre múltiplas vias de sinalização oncogênicas terá maior potencial translacional para tratamento clínico PDAC. Neste sentido, optamos por realizar uma análise ainda mais abrangente dos efeitos do IGF-1R silenciamento em células e PANC-1 e HPAC ter verificado que o IGF-1R de facto coordenar a regulação dos múltiplos caminhos celulares envolvidos na sobrevivência, proliferação , metástase, EMT, apoptose e sinalização do ciclo celular (Figura 5)

(A, C e):. O efeito de supressão de IGF-1R em sinalização AKT /PI3K foi examinado em células de cancro pancreático. células PANC-1 e HPAC foram tratados com IGF-1R ARNsi durante 48 h. As células foram colhidas e a expressão de fosfo-AKT, AKT, fosfo-PI3K, PI3K, fosfo-PTEN, fosfo-mTOR, mTOR, fosfo-p70s6kinase, p70s6kinase e o controlo interno β-actina foi medido por transferência de Western. (B, D F): A análise densitométrica também é mostrada à direita de cada imagem representativa

AKT é uma das moléculas mais constitutivamente expresso em muitos cancros e tem sido demonstrado para melhorar maligna. proliferação de células [24].