Abstract
A exposição à radiação durante o desenvolvimento fetal induz tumores de células germinativas testiculares (TGCT) e reduz a espermatogénese em ratinhos. No entanto, se de ADN prejudiciais agentes quimioterápicos provocam esses efeitos nos ratos permanece obscuro. Entre tais agentes, ciclofosfamida (CP) é usado atualmente para tratar o cancro da mama em mulheres grávidas, e os efeitos da exposição fetal a esta droga se manifesta na prole deve ser melhor compreendida a oferecer esses pacientes aconselhamento adequado. O presente estudo foi desenhado para determinar se a exposição fetal à CP induz o cancro testicular e /ou toxicidade gonadal em 129 e em 129.MOLF congênica ratos (L1). A exposição a CP em dias embrionárias 10,5 e 11,5 aumentou dramaticamente TGCT incidência para 28% em prole de 129 ratos (valor controle, 2%) e 80% na prole masculina de L1 (valor de controlo de 33%). Estes aumentos são semelhantes aos observados em ambas as linhas de ratinhos por radiação.
No útero
exposição a CP também reduziu significativamente os pesos testiculares em 4 semanas de idade para ~ 70% do controle e induzida túbulos seminíferos atróficas em ~ 30% dos testículos. Quando o
in utero
expostos-CP 129 ratos atingiram a fase adulta, houve reduções significativas no testículo e epidídimo contagens de esperma a 62% e 70%, respectivamente, de controles. Na prole feminina, CP causou a perda de 77% dos folículos primordiais e aumento da ativação crescimento do folículo. Os resultados indicam que i) a dano do ADN é um mecanismo comum que leva à indução de cancro testicular, ii) aumento da indução de cancro do testículo por agentes externos é proporcional à incidência espontânea devido a susceptibilidade genética inerente, e iii) as crianças expostas à radiação ou DNA agentes quimioterápicos prejudiciais
in utero
pode ter aumentado os riscos de desenvolver câncer de testículo e de ter reduzido tempo de vida potencial reprodutivo ou diminuído espermatogênica
Citation:. Comish PB, Drumond AL, Kinnell HL, Anderson RA, Matin Um, Meistrich ML, et al. (2014) Fetal Ciclofosfamida Exposição Induz câncer testicular e Redução espermatogênese e Números folículo ovariano em camundongos. PLoS ONE 9 (4): e93311. doi: 10.1371 /journal.pone.0093311
Autor: Stefan Schlatt, Hospital Universitário de Münster, Alemanha |
Recebido: 28 Janeiro, 2014; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 01 de abril de 2014
Direitos de autor: © 2014 Comish et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Florence M. Thomas Professorship em Cancer Research para MLM, Cancer Support Center Grant P30CA016672 dos Institutos Nacionais de Saúde e G1100357 concessão Conselho Reasearch Medical a RAA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
nos últimos 50 anos, a incidência de tumores de células germinativas testiculares (TGCTs) entre Caucasiano homens idade 15-40 anos, o grupo em que essas doenças malignas ocorrem mais frequentemente, aumentou 3 vezes [1]. a produção de esperma dos homens também diminuiu constantemente ao longo dos últimos seis décadas [2]. Ambos estes resultados adversos são sugeridos como sendo o resultado de exposição pré-natal aos agentes ambientais, principalmente endócrino disruptores [3]. No entanto, não existem estudos que mostram inequívocos desreguladores endócrinos ser os fatores causais por trás de um aumento na incidência TGCT [4], [5]. Além disso, há um aumento na menopausa precoce (falência ovariana prematura) em mulheres que parece ser em grande parte atribuível ao aumento da sobrevida dos pacientes com câncer tratados com radioterapia e quimioterapia como crianças ou jovens mulheres [6]; no entanto, não foram examinadas a contribuição de exposições fetais.
O modelo 129 rato [7], que tem uma incidência de 5% de teratomas testiculares, é o único modelo animal de TGCTs humanos, e embora se os resultados utilizando neste modelo podem ser extrapoladas para tumores que surgem em homens jovens é ainda uma questão de algum debate, existem muitas semelhanças. Estes teratomas são histologicamente e developmentally semelhante ao teratomas humanos. Em ambos os seres humanos e ratos, teratomas surgem durante o desenvolvimento pós-natal precoce devido a uma falha dos PGCs pluripotentes, chegando ao cume genital, de se diferenciar em gonócitos comprometidos com a espermatogênese [7], [8]. Além disso, ambos estão predispostos por mutações nos genes KITL ou Dmrt1 [9] – [12], e ambos parecem envolver alterações epigenéticas na sua etiologia [13], [14]
Em um estudo anterior,. verificou-se que a incidência TGCT de camundongos expostos a baixas doses de radiação ionizante
in utero
foi dramaticamente aumentada acima do que a dos ratos de controle [5]. Nós também descobrimos que, testículos que não incidem tumorais foram significativamente menores aos 28 dias de idade, em comparação com os seus homólogos não irradiados, indicando espermatogênese reduzida. A extrapolação destes resultados para as condições humanas nos levou à hipótese de que a exposição à radiação
in utero
pode aumentar os riscos de TGCT e infertilidade dos machos. No entanto, dadas as doses relativamente baixas de radiação que as mulheres em idade fértil recebem actualmente, é pouco provável que a radiação
in utero
tem sido responsável pela elevação global na incidência TGCT e declínio na contagem de esperma. Pelo contrário, a exposição a um produto químico cujo mecanismo de acção biológica primária é similar à de radiação poderiam ser responsáveis por estes efeitos adversos.
porque a radiação atos por danos no ADN, a hipótese de que os produtos químicos que danificam o ADN, particularmente o altamente agentes alquilantes cancerígenos, podem ser candidatos para a indução de TGCT. Nós escolhemos examinar os efeitos da ciclofosfamida (CP), porque tem sido amplamente estudada e é usada para tratar as mulheres grávidas, tais como aqueles com cancro da mama como parte do FAC (5-fluorouracil, adriamicina, ciclofosfamida) regime de quimioterapia de combinação [15] . CP poderia ser cancerígeno para o embrião, pois tem alta transferência transplacentária em primatas não humanos [16], induz quebras no DNA de embriões de ratos [17], e faz com neoplasias secundárias em pacientes com câncer [18]. Além disso CP é um dos principais efeitos tóxicos na reprodução em ratos masculinos e femininos [19], [20] e os seres humanos pré-púberes e adultos expostos a CP pode desenvolver azoospermia permanente e insuficiência prematura do ovário [21], [22]. No entanto, seus efeitos sobre a carcinogênese e função reprodutiva após a exposição fetal ainda não foram investigados.
Por isso, a hipótese de que
in utero
exposição CP pode ser cancerígeno para o testículo e induzir toxicidade reprodutiva em ambas sexos. Utilizou-se o 129, bem como o modelo de rato mais sensível 129.MOLF-L1 câncer de testículo para testar a indução de TGCT por este produto químico e também para testar a toxicidade testicular. Apenas os ratinhos 129 foram usadas para testar a toxicidade do ovário. As exposições foram efectuadas a E10.5 e 11,5, que é conhecido por ser uma fase sensível para a indução de cancros testiculares [5], [7]. Além disso, existem apenas 1.000 a 3.000 células germinativas nestas idades e as células do estroma estão apenas a ser formado, fazendo ambas as células germinativas gonadal e células do estroma alvos de toxicidade reprodutiva.
Materiais e Métodos
ratos e melhoramento
ratinhos consanguíneos congênica 129.MOLF-L1, conhecido como L1, tinham sido obtidas por cruzamento 129S1 /SvImJ e Molf /Ei ratinhos consanguíneos dos
Mus musculus molossinus
subespécies [23]. Cerca de 30% dos homens L1 desenvolver tumores testiculares espontâneas. Além disso, 129S1 /SvImJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) e 129 /S5 (previamente obtidos a partir de Taconic e mantidas no nosso laboratório) ratos, ambos os quais têm também foram utilizadas ~ 5% de incidência de TGCTs desenvolvida espontaneamente. Não foram observadas grandes diferenças significativas entre os resultados com os dois 129 sublinhas, de modo que os dados poderiam ser combinadas.
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do MD Anderson Cancer Center institucional com números de protocolo aprovados 110712632 e 110712633. os ratos utilizados no estudo foram alojados em instalações no MD Anderson que são registrados pelo Departamento de Agricultura dos EUA e credenciados pela Associação americana para o Acreditação do Laboratório animal Care.
Tratamentos
acasalamentos temporizados foram realizadas com pares de L1 ou 129 ratos.
As fêmeas grávidas foram irradiadas com duas doses de 0,8 Gy de
6 ° radiação Co-gama administradas nos dias 10.5 e 11.5 da gravidez (E10.5 e E11.5), tal como descrito anteriormente [5]. A prole masculina de 129 e L1 barragens das mesmas colónias reprodutoras que não recebeu qualquer um destes tratamentos ou manipulações foram analisados como controles.
camundongos grávidas 129 ou L1 foram injectados (ip) com CP, dissolvido em solução salina em doses de 7,5 mg /kg nos dias 10,5 e 11,5 de gravidez. A prole de fêmeas de uma mesma colónia de criação que recebeu soro fisiológico nesses dias foram utilizados como controle.
Análise
filhotes machos expostos a ciclofosfamida ou radiação
in utero
e controle filhotes machos foram sacrificados após 4 semanas de idade, porque a maioria dos tumores testiculares são facilmente observáveis nesta idade [23]. Para determinar os efeitos do
in utero
exposição ciclofosfamida sobre a espermatogênese em adultos, alguns descendentes de ratos 129Sv foram mantidos até às 8 semanas de idade e, em seguida, submetidos à eutanásia. Os testículos foram pesados e, em seguida, fixado em solução de Bouin para exame histológico e os tumores foram identificados através da análise de hematoxilina e-eosina, como descrito anteriormente [5].
Nas seções de não-portador de tumor normais testículos de ratos com 4 semanas de idade, os números de moderadamente grandes túbulos atrofiado, sem quaisquer células germinativas (Sertoli-túbulos apenas), observados na maior parte da região interior de uma única secção intermédia transversal do testículo, foram contadas. Os pequenos túbulos atróficas presentes na região periférica perto dos testículos rete foram excluídos desta análise. testículos ocasionais nos grupos de controle ou de tratamento que tiveram 20% túbulos atróficas, possivelmente devido a uma anormalidade inerente, foram excluídos desta análise ou a partir das médias de peso dos testículos
Os dados históricos de um estudo anterior sobre a indução. de TGCT em
in utero
ratos irradiados L1 [5] também foram utilizados para comparação.
a produção de espermatozóides foi avaliada em adultos 129 ratos que não carregam tumores. Um dos testículos foi homogeneizado após pesagem e ultra-sons. As cabeças de esperma foram contadas num hemocitómetro [24]. Para a contagem do esperma do epidídimo, ambos epidídimo Cauda foram picados separadamente em 1 ml de PBS e incubados a 37 ° C durante 30 min, e a suspensão foi passada através de um filtro metálico de tamanho de poro de 80 ^ m. Espermatozóides foram contadas utilizando um hemocitómetro.
Para analisar os efeitos da
in utero
exposição CP sobre o desenvolvimento folicular ovariano, filhotes fêmeas foram sacrificados aos 7 dias após o nascimento e os ovários foram fixadas em fluido de Bouin . Os ovários foram incluídos em parafina e seccionados com uma espessura de 5 mm e as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina.
Para determinar mudanças no volume ovariano, a cada 10 slides foi utilizado para gerar uma medição da área usando o Image- software Pro Plus. Estas medições da área foram então usados para calcular o volume do ovário com base na espessura das secções e o número total de lâminas que compreendem o ovário.
Para contar diferentes tipos de folículos, uma secção de cada corrediça 10a foi representada por imagem usando um 40 × objetivos e azulejos [25]. Os folículos foram classificados como um ou outro primordial (possuindo uma única camada de células da granulosa achatada); primário de transição (com alguns, mas não todos, das células da granulosa já cúbico); primária (possuindo uma única camada de células da granulosa cubóides); ou secundária (tendo mais do que uma camada de células da granulosa cubóides). O número total de folículos /ovário foram calculados a partir das contagens do folículo matérias por seção usando a equação Abercrombie [26] para corrigir o tamanho do folículo.
Análise Estatística
Os dados numéricos são apresentados como média ± erros padrão das médias. A significância das diferenças entre variáveis contínuas (por exemplo, tamanho de leitegada, pesos, a contagem de espermatozóides, tubulares ou números foliculares) entre expostos e ratos de controle foram avaliados por um estudante
t
-teste. A significância das diferenças em variáveis categóricas (por exemplo, produção de descendência, presença de tumores ou túbulos atróficas) entre ratos expostos e de controlo foram determinados utilizando o teste exato de Fisher.
valores P Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Foi utilizado um programa de estatísticas assistida por computador (IBM SPSS versão 19).
Os dados para a prole dos controles CP (
in utero
ratos tratados com solução salina) e radiação de controles (descendentes de ratos não tratados) não foram significativamente diferentes (com uma exceção indicado na Tabela S1) e foram reunidos.
ratos
resultados
grávida 129 (129S1 /SvImJ e 129S5) e L1 foram tratados com duas doses de CP, uma em cada um dos dias 10,5 e 11,5 de gravidez. Estudos iniciais testadas doses de 25 e 10 mg /kg administrada em ambos os dias, mas, apesar de todas as fêmeas sobreviveram, 0/15 e 0/7 fêmeas de encaixe positivo, respectivamente, descendentes produzidos. Quando a dose foi reduzida para CP 7,5 mg /kg /dia, 24% e 31% do acasalado com sucesso 129 e L1 ratinhos, respectivamente, da progénie produzida (Tabela 1). A percentagem de tratados com CP 129 barragens de produção de progenia (24%) foi significativamente mais baixa do que as barragens de controlo (50%), mas não foi significativamente diferente da das barragens tratados com radiação (33%). No entanto, CP ou radioterapia não afetou os tamanhos da maca. Além disso, camundongos expostos à radiação ou CP não mostraram grandes efeitos teratogênicos, exceto que a maioria dos ratos expostos a CP
in utero
tiveram torções nas suas caudas (Fig. S1). No geral, houve pequenas, mas significativas reduções dos pesos corporais dos ratos após a exposição fetal, quer CP e radiação.
Testes foram colhidas a partir da descendência masculina e a presença e tipos de tumores foi determinada por exame histológico (Figura 1 A . B). A exposição a CP durante a gravidez significativamente (
P
0,001) aumento da incidência TGCT na descendência masculina de 129 ratos de um valor de 2% para 28% de controlo e em murganhos L1 a partir de 33% a 80% (Tabela 2). Em ambas as linhagens de camundongos, a maior incidência de tumores entre os ratos expostos a CP
in utero
foi semelhante ao de camundongos expostos à radiação
in utero
. Os números de ratinhos com tumores unilateral ou bilateral seguiu uma distribuição binomial, indicando que a ocorrência de um tumor em cada testículo foi um evento independente. Assim expressando os dados numa base por testículo, CP induzida TGCTs em 18% dos testículos nos ratinhos e 129 em 64% dos testículos nos ratinhos L1. A maioria destes tumores foram teratomas (Fig. 1A); o resto continha apenas células tumorais neuroepiteliais (Fig. 1B). Em comparação com os de ratinhos de controlo, os testículos TGCT de rolamento de ratinhos L1, mas não em ratinhos 129, CP expostas a radiação ou eram significativamente mais pesados. Isto sugere que ambos CP- e radiação induzida múltiplos focos tumorais em alguns dos testículos de ratos L1. Para determinar se pequenas diferenças na composição genética afetou a indução de tumor, comparamos estes resultados sobre induzida incidência TGCT de ratos 129S1 /SvImJ aos de ratos 129S5 (Tabela S1). Havia apenas uma diferença marginalmente significante (
P
= 0,04), com maior incidência de TGCTs em tratados com CP 129S5 ratos do que em ratos 129S1 /SvImJ tratados com CP.
(AD) Testes de camundongos 4 semanas de idade. (A) TGCT caracterizado como um teratoma provenientes de múltiplas camadas da derme; (B) TGCT contendo apenas células neuroepiteliais. Abreviaturas: BM: medula óssea; CA: cartilagem; EEP: epitélio endodérmico; NE: As células gliais; MS: muscular; ST: túbulos seminíferos. (C) testículo não-TGCT-bearing mostrando túbulos de ativos e atróficas. (D) de alta ampliação de túbulos atróficas contendo apenas células de Sertoli. (E-H) Os ovários de ratos de 7 dias de idade. (E, G) de um ratinho tratado em E10.5 e 11,5 com 7,5 mg de CP /kg /dia. ovário (F, H) de controlo da mesma idade. G e H são as vistas ampliadas de partes de E e F, respectivamente, mostrando primordial (PO), principal-de transição (PT) e folículos (PR) primários. A barra representa 100 um de A, B, C, E F; 30 um em D; 10 mm em G e H.
Além disso, aos 28 dias de idade, os pesos dos testículos livres de tumor de 129 e camundongos L1 expostos a CP
in utero
foram reduzidos para 74% e 72%, respectivamente, dos dos ratinhos de controlo (Tabela 3); similar à diminuição observada com 2 × 0,8 Gy de radiação
in utero
. Esta redução no peso dos testículos não pareceu ser o resultado da perda de peso corporal, como a razão entre o peso do testículo com o peso corporal dos ratinhos expostos à substância tóxica, também foi significativamente mais baixa do que a dos ratinhos de controlo. Atrófica Sertoli cell-somente túbulos eram frequentemente observada nos grupos de ratos tratados (Fig 1 C . D), mas raramente observado nos controles. Por exemplo, cerca de 30% dos testículos do CP- ou tratados com radiação 129 ratinhos tinham túbulos atróficas com uma média de 6 por secção testículos (Tabela 3). Em contraste foram observadas túbulos atróficas em apenas 4% dos testículos de ratos de controlo, com uma média de 1,6 túbulos atróficas por secção. Mesmo quando
in utero
expostos-CP 129 ratos atingido a idade adulta, os pesos dos testículos manteve-se reduzido a 78% dos valores de controlo (Tabela 4). Reduções nas contagens de testicular e esperma do epidídimo a 62% e 70%, respectivamente, dos controles foram observadas nesses camundongos após
in utero
exposição CP, demonstrando que a perda de células germinativas foi a principal responsável pela redução no testículo pesos.
em prole feminina,
in utero
exposição a CP reduziu significativamente o volume dos ovários para um valor de 5,5 ± 0,6 × 10
7 mm
3, em comparação com 13,0 ± 1,4 × 10
7 mm
3 em controles (
P
= 0,001; a Fig. 1 e F). Nestes ratos, o número de folículos primordiais por ovário foi de apenas 23% dos ratos controle (Tabela 5 e Fig 1 G . H). Curiosamente, apesar de ratinhos expostos a CP
in utero
tinham números mais baixos de crescimento (primário de transição, primário, secundário) e folículos do que os controlos, a proporção do número total de folículos em desenvolvimento para o número de folículos primordiais foi aumentada de 0,23 em controles para 0,62 em
in utero
crias expostas ao CP (
P Art 0,05).
Discussão
no presente estudo demonstrou pela primeira vez que a exposição química durante o desenvolvimento fetal pode induzir TGCTs. Também demonstrou que
in utero
exposição à radiação ou CP aumenta drasticamente a incidência de tumores testiculares em 129 ratos, estendendo assim os nossos resultados anteriores com ratos L1, que são altamente suscetíveis a tumores testiculares [5], a um utilizada estirpe de ratinhos que é apenas moderadamente sensíveis a tais tumores. As semelhanças qualitativas e quantitativas na indução de TGCTs entre os camundongos expostos à radiação
in utero
e aqueles em camundongos expostos a CP
in utero
indicam que a radiação e CP têm mecanismos semelhantes de tumorigênese testicular . Nós também mostrou que estes
in utero
-exposures resultou em reduções acentuadas no número de células germinativas em ovários de descendentes do sexo feminino e nos testículos dos descendentes do sexo masculino que não desenvolveram tumores.
Os pontos de tempo por exposição a agentes cancerígenos potenciais para a indução da TGCTs foram inicialmente escolhidos ao E10.5 e E11.5 [5] uma vez que estes são os primeiros dias logo após as PGCs colonizar a gônada fetal e estão passando por grandes mudanças epigenéticas [14]. Além disso, as PGC ainda expressam marcadores de pluripotência e têm a capacidade de formar teratomas em ensaios de transplante [7], que são perdidos por dia E13.5. A demonstração de susceptibilidade à indução de TGCTs durante esta janela de tempo por dois agentes, CP e radiação, e por duas linhagens de camundongos, 129 e L1, apoia esta escolha. Embora outras idades ainda não foram investigados, o mais provável é que a janela de sensibilidade à indução de TGCTs por radiação e CP é limitada a E10.5 E12.5 a em ratos, que é o período em ratinhos durante o qual as PGC sejam nos testículos e são pluripotentes, e que ainda não comprometidos com linhagens de células germinativas.
estudos anteriores demonstraram que as exposições individuais de baixa dose (-1,5 Gy) de radiação entregues entre E14.5 e causar o nascimento de longo prazo danos para a espermatogénese em ambos os ratinhos [27] e ratos [28]. Os resultados do presente estudo sugerem que esta janela de sensibilidade à radiação é ainda maior, estendendo-se tão cedo quanto E11.5 ou E10.5. Os efeitos que observamos demonstrar que os testes pré-natais são mais sensíveis aos efeitos a longo prazo da exposição à radiação do que os testículos de adultos são.
Embora CP é um teratógeno conhecido e tóxicas para a reprodução de mamíferos após a exposição pós-natal, os seus efeitos pré-natais sobre espermatogênese são relativamente desconhecidos. Um estudo [29] indicaram que CP administrado a ratos no dia 12 de gravidez afetou a migração de PGCs nos fetos, mas não acompanhou o desenvolvimento pós-natal das gônadas. Nossa descoberta de que uma dose total de CP, de 15 mg /kg tem efeitos a longo prazo sobre a espermatogênese indica que gônadas masculinas em E10.5-E11.5 são muito mais sensíveis a CP de testículos de adultos são [30]. Porque a espermatogénese era sensível à radiação de E10.5 de nascimento, é provável que a espermatogénese também é sensível ao PB nestes momentos. No entanto, esta continua a ser testado.
A sensibilidade dos oócitos e para o tratamento foliculares números CP era esperado uma vez que o tratamento que afectou a espermatogénese foi dada em E10.5-E11.5 quando as PGC foram em gônadas indiferenciadas. Se o esgotamento dos PGCs não foi compensada através da proliferação extra de ovogônias, isso deve resultar em menos oócitos no ovário. Estudos que investigaram a exposição de fetos de ratos fêmea a baixas doses de radiação [31] ou de busulfano [32] demonstraram que o ovário é sensível a estes agentes entre E13.5 e 17,5. Por isso, é provável que o ovário será sensível ao PB durante a última metade do desenvolvimento fetal.
Como CP, como a radiação, é um agente danificador de ADN, danos de ADN pode ser um mecanismo comum que leva a perda de células e formação de germe TGCT em gônadas embrionárias. Os danos causados pela radiação e que a causada pela CP têm algumas características comuns. Radiação, diretamente ou através de espécies de radicais livres /reativas de oxigênio, indiretamente provoca quebras principalmente simples e dupla vertente, mas também cria algum dano base [33]. As CP metabólitos formas fosforamida de mostarda adutos e ligações cruzadas intercadeias com DNA [34] e da acroleína metabólito produz espécies reativas de oxigênio e adutos de DNA [35]. O dano ao DNA provável mata as PGCs que levam a deficiências na espermatogénese e reservas ovarianos. Além disso, em ordem a reparar ou ignorar a danos no ADN, uma via de ADN-dano-resposta é activado e o relacionamento dos genes desta via para o cancro testicular humano foi demonstrada num estudo de associação em todo o genoma [36]. Uma possibilidade para o mecanismo através do qual a resposta de ADN-provoca danos TGCT é que ele interfere com as extensas alterações que ocorrem dentro dos epigenética PGCs entre E10.5 e 11.5 que estão envolvidos na perda da pluripotência e compromisso com a diferenciação das células germinativas [14] .
o papel da herança genética na indução de TGCT por agentes exógenos e sua relação com a incidência espontânea foi avaliada comparando a indução em ratos L1
129
vs.. Uma vez que os tumores estavam presentes numa percentagem elevada de testículos expostas e o aumento do tamanho indicado focos tumorais múltiplos, foi necessário para estimar o número de focos do tumor por testículo, tendo em conta a distribuição de Poisson. Os números de focos eram muito maiores em ratinhos tratados L1 (0,81 e 1,38, respectivamente, para CP e radiação) do que em ratinhos 129 (0,19 e 0,16, respectivamente) (Tabela S2). Os dados sugerem que o aumento em TGCTs induzido por agentes que danificam o DNA é proporcional à incidência espontânea, e que o susceptibly para indução de TGCT em seres humanos irá depender da incidência espontânea em diferentes origens étnicas [37].
o mecanismo pelo qual a radiação ea causa CP defeitos espermatogênicas provável envolve a morte dos PGCs ou células de Sertoli de apoio. Considerando testículo menores poderia resultar tanto menos células de Sertoli ou células estaminais espermatogoniais para preencher os nichos, a presença de túbulos atróficas com células de Sertoli morfologicamente normais (Fig 1C . D) indica que a perda de células germinais é o efeito predominante
.
A redução do número de folículos ovarianos que observamos também poderia ter resultado da CP esgotar as PGCs em gônadas indiferenciadas. Além disso, a maior proporção de desenvolvimento de foliculos primordiais para os folículos em ratos expostos-CP em comparação com controlos demonstra um aumento na taxa de recrutamento folicular, tal como foi observado em ratos nos quais a exposição ao busulfano
in utero
empobrecido a piscina folículo primordial [38]. Esta activação aumentada de recrutamento folicular pode ser um resultado de concentrações mais baixas de factores inibitórios produzidos a partir do menor número de folículos primordiais-se [39] ou a partir de quantidades mais baixas de hormona antim�leriana produzido a partir de redução do número de folículos em desenvolvimento pré-antrais [40]. O aumento da taxa de recrutamento folículo sequer esgotar ainda mais o pool de folículos primordiais como estes ratos com idade; assim o tratamento CP
in utero
antes da entrada em meiose pode ser um potencial modelo para o envelhecimento precoce do ovário.
Os resultados do presente estudo tem importância clínica, como muitas mulheres grávidas são diagnosticadas com cancro da mama ou outros tipos de câncer com risco de vida que requer tratamento imediato, que normalmente inclui agentes alquilantes que danificam o ADN, tais como CP. Nos últimos anos, vários grupos descreveram em mais de 400 crianças de mulheres tratadas com quimioterapia durante o segundo e /ou terceiro trimestres [41] – [45]. A taxa de defeito de nascimento e estado geral de saúde e crescimento dessas crianças não são significativamente diferentes daqueles das crianças cujas mães não foram tratados com a quimioterapia durante estes tempos. Estas crianças incluídas as de mais de 100 mulheres que receberam doses CP de cerca de 2.000 mg /m
2, uma parte do FAC quimioterapia para o câncer de mama ou ginecológico durante a gravidez da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center [15] (JT Litton, comunicações não publicados). No entanto, a maioria das crianças a partir dos estudos acima são atualmente pré-púberes e ainda não tenham atingido a idade em que os sinais evidentes de possíveis resultados adversos, tais como patogenia testicular ou insuficiência ovariana se tornar aparente.
Nos seres humanos a janela de susceptibilidade a efeitos de PGCs tumorigénicas de agentes que danificam o ADN é provavelmente mais prolongado do que nos roedores. A razão de ser, em seres humanos a transformação de PGCs potencialmente pluripotentes para células germinativas cometidos, que começa após as PGCs ter chegado a os testículos com 6 semanas de desenvolvimento fetal, continua gradualmente ao longo do resto da gravidez e até mesmo após o nascimento [46]. Assim, embora a quimioterapia é administrado durante o segundo e terceiro trimestre, as células germinais são ainda susceptíveis aos efeitos tóxicos da quimioterapia e tumorigénicas.
É importante ter em conta a forma de extrapolar os possíveis efeitos prejudiciais de CP encontrados em o presente estudo para humano. Se os machos humanos expostos a CP
in utero
ter um aumento de 6 vezes na incidência de câncer testicular, como foi observado nos ratos no presente estudo, a incidência cumulativa de câncer de testículo em homens até a idade de 44 anos seria ser aumentada de cerca de 3 por 1000 a cerca de 18 por 1000 machos [47]. Para detectar esse efeito, um grande estudo é necessário com longo prazo de acompanhamento, como a maioria dos cânceres testiculares ocorrem após a puberdade. No entanto, porque a dose CP cumulativa para mulheres grávidas (2.000 mg /m
2) [15] é 40 vezes que foi dado aos ratos no presente estudo (50 mg /m
2), a incidência de câncer testicular poderia ser maior e, assim, mais facilmente detectável. Em qualquer caso, os efeitos da CP sobre a função reprodutora pode ser mais generalizada e mais fácil de detectar em populações específicas.
Como os efeitos, se houver, de
in utero
exposição em seres humanos permanecem incertas , os médicos devem usar marcadores não-invasivos de possíveis resultados negativos. potencial espermatogênica nos machos pré-púberes pode ser avaliada por medidas do tamanho testicular. desenvolvimento da puberdade normal do sexo masculino é esperado porque a ausência de células germinais, não interfere com a puberdade, e em machos pós-puberdade, folículo-estimulante níveis hormonais e inibina B, e a contagem de espermatozóides pode ser medido. Nas meninas pré-púberes antim�leriana níveis hormonais [22] deve ser medido para avaliar a reserva ovariana e os dados devem ser obtidos na puberdade, a menarca, a regularidade da menstruação subsequentes, e fertilidade posterior para avaliar o potencial reprodutivo geral. Os resultados do presente estudo enfatizam a urgência de testar estes parâmetros reprodutivos em meninos e meninas de modo que os pacientes que provavelmente serão dadas CP possa ser devidamente aconselhados sobre os riscos potenciais da droga para seus filhos nascituros, e medidas apropriadas tomadas para reduzir quaisquer consequências.
Informações de Apoio
Figura S1.
de quatro semanas de idade 129 ratos expostos a ciclofosfamida (7,5 mg /kg) nos dias embrionários 10.5 e 11.5 têm torções nas suas caudas (setas), um efeito teratogênico conhecido
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0093311.s001
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Tabela S1.
Comparação de tumor de células germinativas testiculares (TGCT) a incidência e formato em duas sublinhas de 129 camundongos expostos à radiação ou ciclofosfamida (CP)
in utero
em dias embrionárias 10,5 e 11,5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0093311.s002
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Tabela S2.
Comparação de aumento do número calculado de focos tumorais por testículo em 129 e camundongos L1 expostos a ciclofosfamida (CP) ou radiação
in utero
doi:. 10.1371 /journal.pone.0093311. S003
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Reconhecimentos
Agradecemos Joseph A. Munch no Departamento de Publicações científicas do MD Anderson para a edição do manuscrito.