Abstract

CK2 proteína quinase é frequentemente elevado em uma variedade de humano cancros. A via de sinalização Hedgehog (Hh) foi implicada na manutenção de células estaminais, e a sua activação aberrante tem sido indicada em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do pulmão. Neste estudo, mostramos que CK2 está envolvido positivamente na sinalização Hh /Gli no cancro do pulmão linhas celulares A549 e H1299. Em primeiro lugar, encontramos uma correlação entre os níveis de mRNA e CK2α Gli1 em 100 tecidos de câncer de pulmão primário. Down-regulação da actividade expressão e transcrição Gli1 foram demonstrados após o silenciamento de CK2α em células de câncer de pulmão. Além disso, CK2α siARN regulada negativamente a expressão de genes alvo de Hh. Além disso, dois inibidores de pequenas moléculas CK2α levou a uma inibição dependente da dose da expressão Gli1 e actividade de transcrição em células de cancro de pulmão. Inversamente, forçado a sobre-expressão de CK2α resultou em um aumento tanto na expressão Gli1 e actividade de transcrição em células A549. Finalmente, a inibição de HH /Gli CK2α por siARN conduziu a uma redução de uma população de células-lado como haste do cancro que mostre um nível mais elevado de expressão ABCG2. Assim, relatam que a inibição da CK2α down-regula a sinalização Hh /Gli e, posteriormente reduz população lateral-tronco como em células de câncer de pulmão humanos

Citation:. Zhang S, Wang Y, Mao JH, Hsieh D, Kim IJ, Hu LM, et ai. (2012) Inibição da CK2α sub-regula Hedgehog /Gli Sinalização levando a uma redução de um Stem-Like Side População em células de câncer de pulmão humano. PLoS ONE 7 (6): e38996. doi: 10.1371 /journal.pone.0038996

editor: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 16 Janeiro, 2012; Aceito: 14 de maio de 2012; Publicado: 29 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção R01 CA140654-01A1 (LY) e Natural Science Foundation da província de Guangdong, PRC 2009 (9451008901003072). Estamos também gratos pelo apoio do Kazan, McClain, Abrams, Fernandez, Lyons, Greenwood, Harley Oberman Foundation, Inc; do espólio de Robert Griffiths; a Jeffrey e Karen Peterson Family Foundation; Paul e Michelle Zygielbaum; o Estate of Norman Mancini; eo Isackson Cancer Research Fund Lung Barbara. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CK2 proteína quinase (anteriormente conhecida como a caseína-quinase II) é uma serina /treonina quinase que fosforila altamente conservada mais de 300 proteínas [1]. CK2 tem uma estrutura heterotetramérica que consiste em duas subunidades catalíticas (42-kDa alfa ou 38-kDa α ‘) e a subunidade reguladora (28-kDa β), formando a configurações α2β2, αα’β2 e α’2β2. CK2 é uma proteína quinase multifuncional [2], que tem sido mostrado para ser envolvido em quase todos os aspectos da proliferação celular e sobrevivência [3], [4], [5]. O nível de expressão CK2α é fortemente regulada em células normais [6], e aumento do nível de actividade CK2α e foi consistentemente observado em uma variedade de cancros humanos [7], [8], [9]. Por exemplo, o nível elevado e /ou de localização nuclear de CK2α é um marcador de prognóstico para pacientes com leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crónica, cancro da próstata e cancro gástrico [10], [11], [12], [13] . CK2 também afeta várias vias de sinalização celular, incluindo PI3K, NFkB e Wnt [6], [14], [15].

The Hedgehog (Hh) família de proteínas secretadas, que consiste em Sonic, indiana e Desert Hedgehog, desempenha um papel importante no desenvolvimento dos mamíferos e na manutenção de células estaminais [16], [17]. A activação da via de Hh é iniciada na superfície da célula pela ligação ao seu receptor Patched (Ptc) de ligando de Hh, resultando em desrepressão da proteína efectora, um receptor acoplado à proteína G, Smoothened (Smo) [18]. Em última análise, Smo activa a família de factores de transcrição Gli e genes alvo. Existem três proteínas Gli em seres humanos: Gli1 serve para activar genes alvo HH, Gli2 actua como activador e repressora de genes alvo HH, enquanto Gli3 actua como um repressor de genes alvo Hh [19], [20]. A desregulação da sinalização de Hh /Gli está implicada como um factor inicial ou a manutenção na progressão de vários cancros, incluindo carcinomas de células basais, meduloblastomas, leucemia, pulmão, gastrointestinal, pulmão, do ovário, da mama e os cancros da próstata [19], [21]. Por exemplo, o gene é amplificado na Gli1 de glioma humano e activado no carcinoma de células basais [22], [23], [24]. Transgénico sobre-expressão de Gli1 em ratos leva ao desenvolvimento de carcinoma de células basais [25]. activação Gli1 foi demonstrada no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) células e tecidos [26].

A evidência directa de que a sinalização de Hh /Gli desempenha um papel importante no cancro de células estaminais (CCC) deriva a partir de uma série de estudos em diferentes tipos de tumores [21]. Estudos recentes indicam que o ATP de ligação membro cassete transportador 2 de proteína da família G (ABCG2) é um alvo direto da transcrição do HH /Gli sinalização [27]. A subpopulação, a população lado nomeado (SP), com maior nível de expressão ABCG2 em células cancerosas humanas, incluindo células A549 cancro do pulmão, mostrou série de características dos CSCs [28], [29], [30]. Diversas linhas de evidência recente sugere que a sinalização hedgehog regula população lado da haste-como em células de câncer de pulmão humano. Por exemplo, a população lado da linha celular de cancro de pulmão H460 exprime preferencialmente ABCG2 e SMO, um mediador importante da sinalização de hedgehog. Ciclopamina, um inibidor natural circuito de hedgehog, inibe significativamente a progressão do ciclo celular e a proliferação de células da linha de células H460 [30]. Ciclopamina também reduziu a população de lado, em células de cancro humano [31]. Além disso, inibidor da via do ouriço GDC-0449, um fármaco aprovado pela FDA para o tratamento de carcinoma metastático das células basais, o crescimento celular reduzido eficazmente em linhas celulares de cancro do pulmão humano. O efeito é mediado pela inibição da população lado da haste, do [32].

Até à data, não há nenhuma evidência para a relação entre CK2 e sinalização de Hh /Gli em células de mamífero. Para investigar se a CK2 está envolvida na via de Hh em células de câncer de pulmão humanos, testamos a atividade de Gli1 após a inibição CK2.

Resultados

CK2α e GLI1 genes são ativados e correlacionados em NSCLC humano genes

Ambos CK2α e GLI1 foram mostrados para ser sobre-expresso em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de pulmão [26], [33]. Através da utilização de semi-quantitativo de RT-PCR (Figura 1A) e análise Western blot (Figura 1B), examinou-se o gene e proteína CK2α em oito linhas celulares de NSCLC. Os dados mostraram que CK2α é expresso em todas estas células cancerosas. Entre eles, pelo menos, cinco linhas de células (A549, A427, H1299, H358 e H838) mostrou relativamente mais elevado de expressão CK2α tanto no ARNm e os níveis de proteína. CK2α expressão foi mostrado previamente para ser mínima nas células pulmonares normais [34]. expressões de genes e proteínas Gli1 foram amplamente detectada em todas as linhas de células, exceto H358. Curiosamente, pareceu haver uma correlação entre a expressão de CK2α e Gli1 nestas linhas celulares. Foi realizada em tempo real de RT-PCR de CK2α e Gli1 em 100 amostras de NSCLC primária. Uma correlação fraca entre os níveis de mRNA e CK2α Gli1 foi encontrados nestes tecidos (r = 0,37,

P

0,05) (Figura 1C). Para estudos experimentais posteriores, A549 foi escolhido porque o estado das vias relacionadas ao câncer em células A549 foi bem caracterizada. H1299 também foi escolhido devido à sua relativamente mais elevado de expressão de genes e CK2α GLI1.

(A) RT-PCR. (B) Western Blot. O gene CK2α foi activada nas oito linhas celulares de NSCLC examinados (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 e H322), e o gene Gli1 foi expressa em todas as linhas celulares excepto H358. curva de correlação (C) linear dos níveis de ARNm e CK2α Gli1. A correlação fraca (r = 0,37,

P Art 0,05) foi mostrado na análise de correlação linear pelo SPSS. tecidos primária NCSCL de pacientes submetidos à ressecção foram coletadas no momento da cirurgia e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. Estas amostras de tecido foram mantidas a -170 ° C num congelador de azoto líquido antes da utilização.

CK2α knockdown Inibe HH /Gli sinalização através da regulação negativa Gli1

Para investigar se a supressão CK2 ter um efeito sobre a via de Hh, nós silenciados expressão CK2 usando siRNAs específicos da subunidade CK2. Quarenta e oito horas após a transfecção, a eficiência de interferência de ARN foi monitorizada por semi-quantitativo de RT-PCR (Figura S1). Os níveis de ARNm correspondentes das três subunidades diminuiu, e o knockdown de α e α ‘foi confirmada por co-transfecção dos seus ARNsi. A expressão dos componentes da via de Hh indicados também foi determinada (Figura S2). No geral, os resultados de RT-PCR demonstraram que os níveis de ARNm de PTC1 e Gli1 em células A549 e H1299 foram consistentemente regulada para baixo após CK2α ou CK2β knockdown, enquanto que alterações mínimas foram observados em outros componentes da via de Hh. Por em tempo real de RT-PCR, confirmou-se que o silenciamento de CK2α inibiu significativamente a expressão tanto em Gli1 A549 e linhas de células H1299 (Figura 2A). Silenciamento de CK2β também resultou em uma diminuição significativa da Gli1 em ambas as linhas de células (Figura 2A). Além disso, a expressão Gli1 foi mínima no controlo de pulmão normal. Ao nível das proteínas, o silenciamento de CK2α conduziu a um 71% (A549) e uma diminuição de 73% (H1299) de Gli1, enquanto o silenciamento de CK2β conduziu a um 67% (A549) e uma diminuição de 35% (H1299) de Gli1. O tratamento com siRNA alvejando-CK2α’ produzida nenhuma diferença óbvia, em vez de diminuir de Gli1 em A549, e produziu um aumento de 60% em H1299, tanto no ARNm e os níveis de proteína (Figura 2B). Além disso, foi realizada a coloração por imunofluorescência com um anticorpo monoclonal anti-Gli1, uma vez que a localização nuclear da Gli1 reflecte a actividade da via de Hh [35]. GLI1 proteínas nucleares foram drasticamente diminuída na presença de CK2α siRNA (Figura 2C). Além disso, o silenciamento de CK2α resultou numa diminuição significativa (45% a 25 uM e 60% a 50 ^ M, P 0,01) na actividade repórter Gli impulsionou-Gli1, em comparação com o não-targeting siRNA (controlo) (Figura 2D) .

os níveis de (a) Gli1 quantitativa de ARNm após o tratamento com siRNA CK2 específica da subunidade detectado em tempo real por RT-PCR. O silenciamento de CK2α reduziu significativamente os níveis de mRNA Gli1 tanto em A549 e linhas de células H1299 (por 50% e 45%, respectivamente). Silenciamento de CK2β também resultou em uma diminuição significativa da Gli1 em ambas as linhas celulares. nível de mRNA Gli1 mínima foi notado no pulmão normal (NL). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. os níveis de (B) de proteína detectadas por Western Blot. O silenciamento de CK2α levou a uma redução de 73% (H1299) de Gli1 71% (A549) e, ao mesmo tempo silencia de CK2β conduziu a 67% (A549) e 35% (H1299) diminuição de Gli1. Tratamento por CK2α’-siRNA alvejando produziu nenhuma diferença óbvia, em vez de diminuir de Gli1 em A549, e produziu um aumento de 60% em H1299, tanto em ARNm e os níveis de proteína. (C) A localização de Gli1 detectada por fluorescência verde. A proteína Gli1 localiza principalmente no compartimento nuclear das células, e mostra uma grande redução após CK2α knockdown. Barra de escala = 30 mm. (D) A atividade transcricional de Hh via no A549 detectado pelo ensaio de repórter Gli. O silenciamento de CK2α resultou numa diminuição significativa (mais do que 40% a 25 uM e 60% a 50 uM) da actividade transcricional, comparada com o ARNsi de controlo. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. os níveis de (E) Gli1 quantitativa de ARNm após o tratamento com TBB e CX-4945 por em tempo real de RT-PCR. Gli1 expressão em A549 diminuiu visivelmente nos níveis de dosagem de 1 uM CX-4945 e 10 ^ M TBB, de forma significativa a 10 uM CX-4945 e 50 ^ M TBB (50% e 60%). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. níveis (F) de proteína detectadas por Western Blot. No nível de proteína, estas diminuições subiu para 76% (10 ^ M CX-4945) e 89% (50 ^ M TBB) em A549, e 81% (10 ^ M CX-4945) e 93% (50 ^ M TBB) em H1299, respectivamente . (G) A expressão proteica de Gli1 detectada por fluorescência verde. As células foram mimo com TBB 30 uM ou veículo DMSO, coloração de imunofluorescência com mAb anti-Gli1 em células em cultura mostraram uma fluorescência verde distintamente inferior na presença de 30 ^ M TBB. (Barra de escala = 30 mm). (H) A atividade transcricional de Hh via no A549 detectado pelo ensaio de repórter Gli. Uma diminuição de 50% foi detectado na presença de 10 uM CX-4945 ou 10 uM TBB. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01, teste t de Student

pequena molécula CK2α Inibidores regular negativamente Gli1 Expressão e transcricional Atividade

Para validar ainda mais o papel desempenhado pela CK2α na via Hh, foram utilizados dois inibidores de pequenas moléculas CK2α: TBB (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole), um inibidor conhecido de CK2α [36], e CX-4945 (5- (3-clorofenilamino) benzo [c] [2], [6] naftiridina-8-carboxílico), um primeiro-em-classe, inibidor selectivo e oral de CK2α sob investigação na Fase 1 de ensaios clínicos [37].

as células foram tratadas com várias concentrações de TBB (10, 30, 50 uM) ou CX-4945 (1, 3, 10 | iM), ou com o veículo DMSO durante 48 horas. Os tratamentos com BTB ou CX-4945 levou a uma diminuição dependente da dose de ARNm Gli1 e os níveis de proteína tanto em A549 e linhas de células H1299 (Figura 2E, 2F e S3). Os níveis de ARNm quantitativos foram detectados por em tempo real de RT-PCR. Tal como mostrado na Figura 2E, a expressão Gli1 em A549 diminuiu visivelmente nos níveis de dosagem de 1 uM CX-4945 e 10 ^ M TBB, e diminuiu significativamente a 10 uM CX-4945 e 50 ^ M TBB (50% e 60%,

P

0,05). Ao nível da proteína, estas diminuições atingiu a 76% (10 ^ M CX-4945) e 89% (50 ^ M TBB) em A549, e 81% (10 ^ M CX-4945) e 93% (50 ^ M TBB) em H1299, respectivamente (Figura 2F). coloração de imunofluorescência com um anticorpo monoclonal anti-Gli1 em células em cultura mostraram uma fluorescência verde dramaticamente mais baixa na presença de 30 ^ M TBB (Figura 2G). Em seguida, demonstraram que as pequenas moléculas inibiu a actividade repórter Gli na linha de células A549, em que uma diminuição significativa (55%, P 0,01) foi detectado na presença de 10 uM CX-4945 ou 10 ^ M TBB (Figura 2H). Estes resultados são consistentes com o que encontramos em estudos de siRNA.

Forçado Over-expressão do gene CK2α Leva a Gli1 Up-regulamento e transcricional Activation

Para confirmar se o gene CK2 afeta positivamente a a actividade de transcrição de Gli1, nós transfectadas células A549 com qualquer uma pcDNA3.1-CK2α ou controlo plasmídeo pcDNA3.1-LacZ. Como esperado, a sobre-expressão de CK2α foi atribuída à activação de Gli1 na linha celular A549. A sobre-expressão de CK2α foi detectada por RT-PCR (Figura 3A) e Western blot (Figura 3B). O nível de ARNm Gli1 elevada também foi detectada por RT-PCR (Figura 3A). Através de análise de transferência de Western, que mostrou que o nível elevado de proteína Gli1 (2,35 dobras) em células com expressão ectópica de sobre-CK2α (Figura 3B). Além disso, o ensaio de repórter também mostraram um aumento significativo ( 2 dobras, p 0,01) aumento da actividade de transcrição Gli1 (Figura 3C). Estes resultados sugerem que a expressão excessiva do gene CK2α leva a um aumento da regulação da expressão do gene Gli1 e atividade transcricional. Células A549

(A) foram transfectadas quer com um pcDNA3 controle pcDNA3.1-CK2α ou. 1-LacZ vectores de plasmídeo, o sobre-expresso CK2α e supra-regulados por Gli1was detectados em tempo real de RT-PCR. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. (B) Western Blot. O nível de proteína de Gli1 foi regulado para cima neste sistema com um aumento de duas vezes. (C) Além disso, o ensaio de repórter também mostrou um (mais do que 2 vezes) aumento significativo da actividade de transcrição Gli1. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. (D) Em uma análise de degradação de proteínas, células A549 apresentaram redução de proteína Gli1 no ponto de tempo de 2 horas depois tratada com CK2α siRNA.

O silenciamento de CK2α Promove Gli1 Degradação

Nós ainda realizado um experimento de tempo de curso para examinar Gli1 intervalo. As células A549 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou CK2α, e os níveis de proteína GLI1 foram detectados nos pontos de tempo de 0, 1 e 2 horas após o tratamento com o inibidor de proteína, ciclo-heximida. No grupo knockdown CK2α, o nível de proteína Gli1 reduzida para mimimum às 2 horas após o tratamento com ciclo-heximida (quando comparada com a de 0 horas), o que sugeriu que a meia vida do Gli1 após CK2α siRNA knockdown é 2 horas. Estes dados indicam que CK2α knockdown resulta na degradação de Gli1 (Figura 3D). Este, por sua vez, sugere que CK2α regula a atividade Gli1, impedindo a sua degradação.

CK2α Knockdown sub-regula Hh genes a jusante e reduz SP Perfil via ABCG2 no A549

Hh controla supostamente a proliferação de vários tipos de células através de vários mecanismos moleculares e metas genes a jusante, incluindo a PTC, membros da família ciclina, e de auto-indução de Gli1 [20], [38]. Analisou-se os níveis de mRNA de quatro (Gli1, PTC1, PTC2 e ciclina E1) destes genes utilizando em tempo real de RT-PCR (Figura 4A). A expressão dos quatro genes alvo Hh diminuiu significativamente (

P

0,05). Após CK2α knockdown, que sugere uma actividade de transcrição deprimida da via de Hh

(A) Hh genes a jusante expressão detectado por em tempo real de RT-PCR. O nível de mRNA dos quatro genes-alvo Hh (Gli1, PTC 1, PTC2 e ciclina E1) diminuiu significativamente após CK2α knockdown. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, teste t de Student. (B) A expressão de ABCG2 diminuiu em células A549 CK2α-silenciados. (C) A proporção de células SP caiu de 26,8% para 15,4%, e de 9,4% para 3,4% na presença de 50 uM de verapamil, respectivamente. As células foram marcadas com o Hoechst 33342 e depois analisadas por citometria de fluxo. (Direita) resulta quando as células foram tratadas com 50? M de verapamil durante o procedimento de marcação. O SP é descrito e mostrado como uma percentagem da população celular total. Estas experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes. (D) Gráfico de barras para (C). (E) Modelo de HH /Gli1 sinalização regulada por CK2. Os pormenores são descritos no texto.

Demonstrou-se que ABCG2 é o principal contribuinte para o fenótipo SP em várias linhas celulares de cancro incluindo A549 [28]. O fenótipo SP tem sido caracterizado por uma série de estudos de cancro de células estaminais derivadas da próstata, mama, cólon, glioma, bexiga, ovário, colo uterino, e melanoma [29], [39], [40], [41], [ ,,,0],42]. Estudos recentes mostram que ABCG2 é um alvo directo da via de Hh, que está envolvido na manutenção de células estaminais [27]. Em primeiro lugar, examinou expressão ABCG2 após CK2α knockdown e descobriu que o nível ABCG2 diminuiu drasticamente em células A549 CK2α-silenciados (Figura 4B). Consistente com outros achados, relativamente mais elevada percentagem (26,8%) de células A549 foram classificados como células SP no nosso estudo. Na presença de verapamil, um inibidor de transportador ABC, a proporção de células SP caiu para 9,4%. Após o tratamento com siRNA CK2α, a proporção diminuiu para 15.4% (sem verapamil) ou 3,4% (com verapamil) (Figura 4C e 4D). Em seguida, classificados células SP e não-SP neste sistema. Na análise posterior por semi-quantitativo de RT-PCR, as células SP ordenadas mostraram maior expressão de ABCG2 do que células não-SP, mas não alterou a expressão ABCG2 em células SP ou não-SP foi mostrado entre a CK2α siRNA e de controlo (Figura S4). Em resumo, nós mostramos uma redução de 42,5% de proporção SP após CK2α knockdown.

Discussão

Nossos resultados sugerem que CK2 é um regulador positivo em HH /Gli1 sinalização no cancro do pulmão humano. Isto é suportado por várias linhas de evidência. Em primeiro lugar, a correlação das expressões CK2 e GLI1 foram observadas em várias linhas celulares de cancro do pulmão. Demonstramos ainda uma correlação linear em 100 tecidos NSCLC primários. Em segundo lugar, a inibição da CK2α por siARN ou inibidores moleculares pequenos resultou na diminuição da regulação da expressão e actividade de transcrição Gli1. Em terceiro lugar, forçado a sobre-expressão de CK2α resultou num aumento da expressão e actividade de transcrição Gli1. Finalmente, CK2α knockdown levou a uma redução da população lado via-down regulação ABCG2, um alvo direto de HH /Gli sinalização [27].

Até o momento, não há nenhuma evidência para a correlação entre CK2 e HH /sinalização Gli em células cancerosas humanas, embora CK2 foi sugerido como um regulador positivo da via de transdução de sinal de Hh e dois resíduos de serina no SMO foram fosforilada por CK2 em

Drosophila

[43]. No entanto, este mecanismo de fosforilação de Smo por CK2 não parece aplicar-se a seres humanos, uma vez que estes dois resíduos não Smo são conservados em Smo humana quando alinhadas com Clustal W [44] (Figura S5). Além disso, vários estudos têm sugerido que mamíferos Smo e

Drosophila

Smo são reguladas por mecanismos fundamentalmente distintas [45], [46]. Recentemente, Chen et al. demonstrou que mamíferos Smo é activada através de fosforilação multi-site, CK1α e GRK2 e propôs mecanismo de dois passos para a fosforilação Smo em células de mamíferos [47].

Para investigar o potencial mecanismo através do qual CK2 regula positivamente a expressão Gli1 humana e a actividade de transcrição, foi realizada ensaio de degradação de proteína de Gli1 após o tratamento com siRNA CK2α. Os nossos resultados indicaram que CK2 silenciamento reduz a meia-vida da proteína Gil1 humano em células A549. Além disso, tanto CK2 siRNA e inibidores de moléculas pequenas regulada negativamente a actividade de transcrição reforçada-Gli1. Além disso, forçado a sobre-expressão de CK2α resultou em actividade de transcrição Gli1. Além disso, encontramos dois previu sítios de fosforilação CK2 em Gli1 humana usando Scansite com rigor médio [48] (Figura S6). Os nossos dados sugerem que podem regular CK2 Gli1 em células cancerosas humanas de um modo semelhante com que em

Drosophila

. Por exemplo, Jia et al. informou que CK2 fosforila diretamente Ci em

Drosophila

, em seguida, impede a sua ubiquitinação e degradação [43]. Por outro lado, tem sido proposto que a glicogénio sintase quinase-3 beta regula negativamente a factores de transcrição Gli1 que cooperam com outras quinases tais como PKA e CK1s em células A549 do cancro do pulmão [49]. Assim, dois passos são provavelmente envolvidos na regulação positiva de Gli1 por CK2. No primeiro passo, a inibição da degradação CK2 promove Gli1, seguido por acumulação reduzida de Gli1 no compartimento nuclear. No segundo passo, como o factor de transcrição chave da via de Hh, a proteína Gli1 reduzida subsequentemente suprime a transcrição dos genes alvo de Hh. Este, por sua vez, forma um circuito fechado de realimentação para diminuir ainda mais o nível de Gli1, que actua como um gene alvo da via (Figura 4E) expressão. Embora o mecanismo de regulação CK2 em cancros humanos permanece em grande parte desconhecida, existem evidências de que CK2 é essencial para Wnt /beta-catenina sinalização [50], [51]. Por exemplo, foi implicada CK2 que se pode ligar e fosforilar β-catenina e promove a sua degradação [52]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que CK2α pode estabilizar de proteína Gli1 humano através de fosforilação direta. Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos precisos.

A via do factor de transcrição Hh Gli1 regula a expressão do ABCG2 proteína transportadora de ABC por ligação directa ao promotor ABCG2 [27], ABCG2 é um determinante molecular do SP fenótipo e expressos em níveis mais elevados em células SP, em comparação com células não-SP [28], [31]. As células SP já estariam enriquecida com células-tronco do câncer, uma vez que mostra as propriedades de células-tronco (altamente tumurigenic e quimio-resistentes). Estudos anteriores detectado fenótipo SP com maior nível de expressão e ABCG2 ABCG2 implicado como um marcador CSC em células A549 do cancro do pulmão [28]. Por exemplo, as células de SP em A549 mostrou potencial mais tumurigenic [29]. Em nosso estudo, o gene alvo de HH /Gli ABCG2 sinalização foi regulada para baixo após a inibição CK2α, onde a população lateral-driven ABCG2 foi reduzido posteriormente. Assim, informamos que CK2 participa na manutenção CSCs através da regulação de sinalização Hh /Gli.

Hh via pode desempenhar um papel-chave na manutenção de CSCs, no entanto as metas druggable em Hh via é muito limitado. CK2 fornecer um alvo adicional para a inibição da sinalização de Hh /Gli. inibidores CK2 não têm sido extensivamente desenvolvidos como agentes terapêuticos, parcialmente devido a que o bolso de ligação ao ATP de CK2 não é tão druggable como algumas outras cinases de proteína [50], [53], [54]. Até à data, apenas um inibidor de CK2 pequena molécula foi introduzida para os ensaios clínicos como um potencial fármaco anticancro. CX-4945, um inibidor CK2 pequena molécula altamente seletivo, é um primeiro-in-class agente terapêutica oral promissora segmentando vários cancros humanos. CX-4945 mostra um perfil de segurança favorável na fase I de ensaios clínicos [55]. Além disso, a CIGB-300 (um medicamento à base de péptido sintético visando o domínio CK2 phosphoaceptor) provou ser seguro e de benefício clínico na Fase I de ensaios de cancro cervical [56].

Em resumo, nós relatam que CK2 é um regulador positivo na via de sinalização de Hh /Gli, e a inibição da CK2α sub-regula HH /Gli sinalização em células de cancro do pulmão humano. Dada a importância emergente de sinalização Hh /Gli na iniciação e progressão tumoral, nossos resultados fornecem uma evidência importante para os potenciais benefícios dos inibidores da CK2.

Materiais e Métodos

Cultura celular e pequena molécula Tratamento

linhagens de células NSCLC humano (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 e H322) foram obtidos de American Type Culture Collections (Manassas, VA). As células foram mantidas rotineiramente em meio RPMI-1640 suplementado com soro inactivado pelo calor 10% fetal de bovino, penicilina (100 ug /ml) e estreptomicina (100 ug /ml). Todas as células foram rotineiramente cultivadas a 37 ° C numa incubadora húmida com 5% de CO2. O tratamento com CX-4945 (Synkinase, San Diego, CA) e TBB (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido em DMSO foi administrado em várias doses (1, 3 e 10 uM de CX4945, 10, 30, 50 uM de TBB ). As células foram cultivadas em meio durante 48 horas após o tratamento.

siRNA e plasmídeo de DNA transfecção

siRNAs

CK2α, CK2α ‘e CK2β específicas-(ON-TARGET

além

SmartPool) ARN de controlo e foram adquiridos a Thermo Scientific (Waltham, MA). Em resumo, as células foram semeadas numa placa de 6 poços como 10

5 células /poço um dia antes da transfecção, com um alvo de 30-50% de confluência no momento da transfecção. As células foram transfectadas com 50 nmol /L de siRNA utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. inibição adequada do knockdown mediada por siARN foi confirmada por RT-PCR. Os pcDNA3.1-CK2α ou controlar os vectores de plasmídeo pcDNA3.1-LacZ foram então transfectado para as células A549 (0,5 ug /mL na placa de 24 poços), utilizando Lipofectamine 2000 de reagente de transfecção (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas por RT-PCR e transferência de Western ou utilizados em ensaios de repórter às 48 horas pós-transfecção.

Isolamento de ARN, síntese de ADNc e semi-quantitativa por RT-PCR

Isolamento de ARN foi realizada utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Pulmão Humano O ARN total foi adquirido a Applied Biosystems (Foster City, CA). Quinhentos ng de ARN total foi convertido em ADNc de 20 ul usando iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), de acordo com as recomendações do fabricante. bandas de PCR foram visualizados sob luz UV e fotografados.

em tempo real de RT-PCR

Um total de 2 ul de reacção de transcrição reversa foram usadas como modelo para a detecção em tempo real de expressão Gli1 usando tecnologia TaqMan em um sistema de detecção de seqüência 7000 Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de genes foi quantificada para os genes testados (Gli1, PTC1, PTC2 e ciclina E1) e controle endógeno gene da b-glucuronidase (GUSB) usando as sequências iniciadoras e sonda comercialmente (Applied Biosystems).

Western Blot e análise coloração por imunofluorescência

de proteína total foi extraído por M-PER de mamíferos proteína Reagente de Extracção (Thermo) a partir de linhas celulares adicionadas com fosfatase Inhibitor Cocktail Set II (Calbiochem, San Diego, CA) e inibidor de protease completo Cocktails (Roche, Lewes , Reino Unido) de acordo com protocolos fabrica ‘. As proteínas foram separadas em géis de gradiente de 4-15% de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas Immobilon-P (Millipore, bellerica, MA). Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-CK2α (Millipore), anti-Gli1 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-ABCG2 (Millipore), e anti-GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD). Depois de serem incubados com anticorpos secundários apropriados, os complexos antigénio-anticorpo foram detectados utilizando um sistema de análise de transferência de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). imunofluorescência foi realizada. O exame foi realizado utilizando laser scanning microscopia confocal (LSM510, Carl Zeiss, Oakland, CA). As imagens digitais de fatias confocal individuais foram preparadas usando o Adobe Photoshop 6.0.

degradação de proteínas Ensaio

O CK2α- e controlar células A549 transtected-siRNA foram expostos a 50 mg /ml de cicloheximida e colhidas no Os pontos de tempo de 0 e 6 horas. proteínas celulares totais foram extraídas e foram analisadas por análise de Western blot.

Luciferase Reporter Ensaios

Para medir a actividade de transcrição de Hh Gli-mediada, o repórter luciferase constrói, Gli local de ligação 8 × de tipo selvagem (8 × Gli

em peso Luc) ou 8 × mutante Gli local de ligação (8 × Gli

mut Luc) plasmídeos [57] e um vector de expressão Gli1 humana (pcDNA3.1-Gli1) foram co-transfectados em A549 As células na placa de 24 poços. O

Renilla luciferase

plasmídeo pRL-TK (Promega, Madison, WI), cuja expressão é conduzida pelo promotor do gene da cinase de timidina de limpeza, foi co-transfectado para normalizar para a eficiência de transfecção. Todas as experiências de transfecção foram realizadas utilizando o Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 h as células foram lisadas e os ensaios de luciferase foram realizados como descrito anteriormente [58]. Os resultados são expressos como a indução de dobragem, que é a relação entre a actividade da luciferase induzida em células Gli-transfectadas relativos a actividade de luciferase basal em células A549 transfectadas de controlo. Todas as experiências foram realizadas em triplicado;