Abstract

Apesar de seus efeitos colaterais, docetaxel (DTX) continua a ser um tratamento de primeira linha contra cancro da próstata resistentes à castração (CRPC). Portanto, as estratégias para aumentar a sua eficácia anti-tumor e diminuir os seus efeitos secundários são urgentemente necessárias. Segmentação da tensão constitutiva retículo endoplasmático (ER) em células cancerosas está sendo investigado como uma abordagem quimiossensibilização. Nossa hipótese é que a indução simultânea de ER-stress e supressão de PI3K via de sobrevivência /AKT será uma abordagem mais eficaz. Numa linha de células CRPC, C4-2B, observou-se significativa (p 0,005) aumento da citotoxicidade induzida pelo seguinte coexposure DTX a tapsigargina e um inibidor de AKT-. No entanto, uma vez que estes dois agentes não são clinicamente aprovado, investigou-se uma combinação de nelfinavir (NFR) e curcumina (CUR), conhecido por alvo ambas as vias metabólicas, pode aumentar de forma semelhante DTX citotoxicidade em células CRPC. Dentro de 24 horas após a exposição a concentrações fisiológicas de NFR (5 uM) e CUR (5 uM) um aumento significativo (p 0,005) maior citotoxicidade foi evidente com baixa concentração de DTX (10 nM). Esta combinação de 3-droga aumentou rapidamente a apoptose em células C4-2B agressivos, mas não em RWPE-1 ou células epiteliais da próstata em células primária (PrEC). Estudos moleculares comparativos revelaram que esta combinação de 3-fármaco causou uma supressão mais pronunciada de fosforilada por AKT e maior indução nas fosforilado em células-eIF2α C4-2B, em comparação com células RWPE-1. A exposição aguda (3-9 horas) a esta combinação de 3 de drogas se intensificou ER-stress induzido marcadores pró-apoptóticos, ou seja ATF4, CHOP e TRIB3. Em concentrações muito mais baixas, crônicas (3 semanas) exposições a estes três agentes reduziram drasticamente unidades formadoras de colónias (CFU) por células C4-2B.

In vivo

estudos utilizando ratinhos contendo xenoenxertos de tumor mostrou C4-2B significativa (p 0,05) aumento da de DTX (10 mg /kg), a eficácia anti-tumoral seguintes coexposure para NFR (20 mg /kg) CUR (100 mg /kg). Imuno-histoquímica (IHQ) analisa de secções de tumor indicados diminuiu Ki-67 coloração e aumento da intensidade TUNEL em camundongos expostos à combinação de 3 drogas. Portanto, subvertendo ER-stress no sentido de apoptose usando a terapia adjuvante com NFR e CUR pode chemosensitize as células CRPC para DTX terapia

Citation:. Mathur A, Abd Elmageed ZY, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel- Mageed AB, et al. (2014) Subvertendo ER-Stress no sentido de apoptose por Nelfinavir e curcumina Coexposure aumenta Docetaxel Eficácia em Castração resistentes células cancerosas da próstata. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10.1371 /journal.pone.0103109

editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Janeiro, 2014; Aceito: 12 de junho de 2014; Publicação: 14 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mathur et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados por bolsas do Departamento de Defesa, a DM (# PC080811) e a A.B.A. (# PC081598) e fundos do Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em homens nos Estados Unidos. O tratamento inicial de tumores localizados consiste em cirurgia e radioterapia, seguido de terapia de privação de andrógeno (ADT). No entanto, ADT só é eficaz para uma média de 18-24 meses, e a recorrência de câncer de próstata resistente à castração (CRPC) determina morbidade e mortalidade em pacientes [1]. Embora o receptor (AR) antagonistas de androgénio mais novos e mais potentes, por exemplo MDV-3100 (enzalutamida), têm mostrado alguma promessa, a resistência já está sendo encontrado na clínica [2]. Portanto, a quimioterapia com taxanos continua a ser a droga de escolha para pacientes com CRPC agressivos e metastáticos. No entanto, uma estratégia segura e eficaz para aumentar a eficácia de taxanos representa uma necessidade clínica não satisfeita.

O docetaxel (DTX), um agente anti-microtúbulo, foi aprovado pelo FDA dos Estados Unidos como o principal tratamento contra CRPC [3 ]. Embora inicialmente eficaz,-DTX baseada regime mostrou apenas uma sobrevida média de 18-20 meses e taxa de resposta de apenas 50%. Além disso, DTX apresenta efeitos adversos significativos em pacientes com comorbidades, que a redução da dose mandato, o que aumenta a possibilidade de seleção de clones resistentes. Estudos recentes têm mostrado que o desenvolvimento de resistência após o tratamento a longo prazo com DTX pode ocorrer devido à regulação positiva de PI3K /AKT em células CRPC [4], [5]. Portanto, a regulação negativa de PI3K /AKT em células CRPC deve aumentar a eficácia deste agente quimioterapêutico [6].

células cancerosas agressivos também são capazes de escapar à quimioterapia, através da modulação vias reguladoras mestre que ditam a sua sobrevivência ou morte decisão fazendo habilidades. A este respeito, o controlo da tradução de proteínas através da cascata primorosamente regulamentado ER-stress tem sido mostrado para promover a sobrevivência de células de tumor e escapar apoptose [7]. A ligação directa entre o fenótipo tumoral agressivo e aumento da expressão do marcador de ER-stress, BiP /Grp78, tem sido documentado [8] – [10]. De fato, vários relatórios recentes estabeleceram que ER-stress pode facilitar o crescimento do tumor persistente e sua resistência terapêutica. Por conseguinte, os investigadores sugeriram que o direccionamento de ER-stress pode ser uma estratégia potente quimio-sensibilização [11] – [13]. Wu et al, (2009) demonstraram que o ácido methylseleninic ER-stress indutor (MSA) sensibiliza células PC-3 para os efeitos citotóxicos de paclitaxel e DTX [11]. compostos naturais como galato de epigalocatequina, um composto polifenólico do chá verde, pode melhorar a eficácia da quimioterapia em células de glioblastoma, aumentando ER-stress [14]. No entanto, a eficácia da simultânea down-regulação da via PI3K /AKT sobrevivência e sobre-regulação da apoptose induzida ER-stress como uma abordagem quimiossensibilização potente não foi testado.

estudos fornecem evidência clara de cruzadas conversações entre múltiplos caminhos de transdução de sinal que regulam as decisões destino celular após a indução ER-stress em células cancerosas [7], [15] (consulte a Fig. 1A para uma descrição detalhada). Um nível moderado de ER-stress ativa uma resposta de sobrevivência chamado Response proteína Unfolded (UPR). No entanto, o ER-stress severa subverte esta RPU para uma via de pro-apoptótica, o que é ditado pela expressão de ER-stress induzido factores de transcrição e ATF4 CHOP, e o ER-stress induzido TRIB3 sensor de morte. Curiosamente, sob ER-stress moderado, níveis baixos TRIB3 actuar como um regulador negativo de ATF4 e CHOP, que favorece a sobrevivência das células. No entanto, durante ER-estresse severo, altos níveis de ATF4 e CHOP aumentar a expressão TRIB3 e uma supressão paralelo de AKT, que favorecem a apoptose [16] – [18]. Portanto, TRIB3 parece funcionar como um mestre ‘interruptor molecular “para a sobrevivência

vs.

Morte sinalização em células de câncer submetidos a ER-stress (Fig. 1B). Assim, os agentes farmacológicos que induzem elevados níveis de TRIB3 deve sensibilizar células cancerosas à quimioterapia.

(A). Sob condições homeostáticos normais, o ATF6, IRE1 e proteínas PERK são obrigados a BiP /Grp78 na membrana do RE. Uma resposta proteína desdobrado (UPR) libera esses transdutores ER-stress de BiP. ATF6 libertado transloca-se para o núcleo para aumentar a XBP-1 a expressão do gene. activação de IRE1 paralelo permite que o splicing da XBP-1 de mRNA, que codifica um factor de transcrição que estimula vários genes induzíveis de stress. PERK Lançado ativa eIF2α, que, em seguida, inibe a tradução de proteínas dependentes de tampão para proteger ainda mais as células de progressão UPR. Assim, cruzadas conversações entre estes transdutores ER-stress actuar através de vias paralelas para facilitar a sobrevivência das células e restaurar a homeostase celular na sequência de um ER-stress leve e transitória. No entanto, sob ER-estresse prolongado ou grave, a tradução independente de cap de ATF4 continua. níveis ATF4 Nuclear desregulamentar homeostase celular, aumentando a expressão de sensores de morte ER-stress, CHOP e TRIB3. (B). TRIB3 atua como o ‘interruptor molecular’ que dita as decisões de sobrevivência celular ou morte celular seguindo ER-stress. Os baixos níveis de funções TRIB3 através de uma reacção de ciclo negativo para suprimir ATF4 e CHOP expressão, permitindo assim que a sobrevivência das células (painel da esquerda). No entanto, altos níveis de TRIB3 down-regula a via de sobrevivência AKT, mas não suprime ATF4 e CHOP, que continua a produzir níveis descontrolados de TRIB3. Este desequilíbrio subverte as respostas UPR e ER-estresse de um modo de sobrevivência em relação a apoptose (painel direito).

Thapsigargin (Tg), um conhecido indutor ER-stress, pode sensibilizar células PC-3 para ambos o paclitaxel e DTX [11]. Além disso, o inibidor de AKT (Aktí-IV) pode sensibilizar linhagens de células HeLa e SKOV3 tanto à cisplatina e etoposido [19]. No entanto, estes compostos experimentais não pode ser utilizada em pacientes, uma vez que manifestam

In vivo

toxicidades significativas [11], [19]. Além disso, a aprovação clínica de novos agentes que os objectivos de segurança e de AKT-ER estresse seria um processo caro e demorado. A este respeito, o reposicionamento de drogas está se tornando um anti-câncer muito gratificante e estratégia de quimio-sensibilização [20]. Investigou-se dois agentes farmacológicos aprovados, ou seja, o nelfinavir e curcumina, conhecida para atingir as vias de stress e ER-AKT, pode aumentar a eficácia anti-tumor de DTX contra células CRPC.

Nelfinavir (NFR) é uma das primeiras inibidores da protease de HIV-1 (HPI) para ser clinicamente aprovado [21], [22] e está actualmente a ser reposicionado como um agente anti-cancro, bem como (ClinicalTrials.gov). Numerosos estudos demonstraram que tanto pode NFR chemosensitize radiossensibilizar e uma variedade de células tumorais diferentes [23] – [28]. Os seus efeitos sensibilizadores têm sido associados à indução de ER-stress e a inibição da Akt [28]. Com efeito, o ritonavir, um outro IPH com mecanismo de acção semelhante, foi também demonstrado para melhorar os efeitos anticancerígenos de DTX numa linha celular de CaP altamente agressivo, DU-145 [29]. No entanto, os efeitos sensibilizadores de NFR só são expostos a concentrações de ≥10 uM, o que é mais elevado do que os seus níveis de segurança e fisiologicamente atingíveis, isto é, 4,5-6 uM [30], [31]. Assim, a combinação de NFR com outro composto que segura de forma semelhante como alvo ER-stress e AKT vias podem ser mais eficazes.

Curcumina (CUR) é o componente activo de

Curcuma longa, um leste planta -Indian. Isto tem fitoquímicos bem conhecido propriedades anti-inflamatórias e anti-cancro e um número de laboratórios estão a investigar a sua utilidade como adjuvante à quimioterapia [32]. De facto, tem sido mostrado CUR inibir a via de PI3K /AKT e induzem níveis baixos de ER-stress [33] especificamente em células cancerosas, [34]. Em células de cancro do pulmão, CUR exibiu efeitos antitumorais sinérgicos quando combinada com DTX [35]. Recentemente, foi mostrado CUR também para provocar a morte celular em células do cancro do cólon por meio de ER-stress induzido autofagia [36]. No entanto, semelhante a NFR, o

in vitro

efeitos quimio-sensibilizadores de CUR foram evidentes apenas em concentrações elevadas (≥10 ^ M), que é difícil de alcançar

in vivo

[37], [38 ]. Portanto, a hipótese de que CUR e NFR combinação deve potencialmente aumentar suas habilidades quimio-sensibilizadores individuais.

As investigações com células C4-2B (uma linha celular CRPC) mostraram significativamente maior eficácia anti-tumoral de DTX seguinte coexposure a NFR e CUR . Mecanicamente, esta combinação 3-droga em sinergia para suprimir a AKT e induzir ATF4, CHOP e níveis TRIB3. Ambos os nossos

in vitro

e

in vivo

achados implicam claramente o potencial da terapia adjuvante com concentrações fisiologicamente atingíveis de NFR e CUR para aumentar a eficácia do DTX em pacientes CRPC.

Materiais e Métodos

cultura celular

As células C4-2B, um osso metastático sublinha CRPC derivado de LNCaP, foi um presente amável do laboratório do Dr. Leland Chung (Emory University) [39] . Estas células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a partir de Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) e 1% de solução de penicilina /estreptomicina antibiótico (Cellgro). O RWPE-1 células, uma linha de próstata humano não-tumorigénico de células epiteliais imortalizadas com o vírus do papiloma humano (HPV-18), foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC; # CRL-11609). Estas células foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos (K-SFM) complementado com o factor de crescimento epidérmico (EGF) e extracto de pituitária bovina, todos obtidos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). As células epiteliais de próstata humana primárias (PrEC) foram obtidas da ATCC (# PCS-440-010) e foram cultivadas em meio basal das células epiteliais da próstata e suplementos (ATCC; # PCS-440-030 e # PCS-440-040). As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSC) foram obtidos a partir da instalação do núcleo de células-tronco da Universidade de Tulane (New Orleans, LA) e foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com 20% FBS e antibióticos. Todas as células foram mantidas a 37 ° C, numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2.

Reagentes

mesilato de nelfinavir (NFR) em pó foi extraída e purificada a partir de 250 mg (comprimidos produtos farmacêuticos Agouron; San Diego, CA). A curcumina (CUR) foi obtido a partir de Acros Organics (Fair Lawn, NJ). O docetaxel (DTX) e tapsigargina (Tg) foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO) e o inibidor de AKT-(Aktí-IV, catálogo n ° 124005.) Foi obtido a partir de Calbiochem (Billerica, MA). Para

in vitro

estudos, todos os fármacos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO). Os anticorpos primários contra-total AKT e fosfo-AKT, eIF2α total e fosfo-eIF2α, e contra humanos BiP /Grp78, PARP e CHOP, foram todos adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Os anticorpos contra TRIB3 humana e ATF4 eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), o anticorpo humano contra β-actina foi de Fisher Scientific (Waltham, MA) e contra Ki-67 foi de mola Biosciences (Pleasanton, CA). Todos os anticorpos secundários, tais como de cabra anti-ratinho, de cabra anti-coelho e anti-cabra de bovino, foram todos adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology,.

A viabilidade celular ensaio

O MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] ensaio foi utilizado para determinar a viabilidade celular após a exposição aos compostos de teste [40]. Em resumo, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixou-se aderir durante a noite. as concentrações desejadas dos compostos, isoladamente ou em diferentes combinações, foram adicionados às células em poços de 3 replicados. Após 24-72 h de incubação, o MTT (Sigma) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 3 horas e os cristais de formazan foram detectadas por coloração púrpura. A percentagem de sobrevivência foi calculada por medição da absorvância a 540 nm utilizando um leitor de placas μQuant da Bio-Tek (Seattle, WA).

fragmentação do ADN de ensaio

O ensaio de ADN de fragmentação foi levado a cabo de acordo com a estudos publicados anteriores [41]. Resumidamente, as células em placas de 10 cm de cultura de tecidos foram tratadas com as concentrações desejadas de DTX, NFR e CUR, sozinho e em combinação. As células foram colhidas após 24 horas em um tampão de lise celular {0,2% de Triton-X 100, 10 mM Tris-Cl (pH 7,4) e EDTA 10 mM (pH 8,0)}, seguido de tratamento com 100 ug /ml de ARNase A (Sigma ) e 0,5 mg /ml de proteinase K (Sigma). O ADN de baixo peso molecular foram extraídos por adição de volumes iguais de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico-(25:24:1) e, adicionalmente, com clorofórmio e álcool isoamílico (24:1). O DNA extraído foi precipitado com etanol (300 mM de NaCl e 100% de etanol arrefecido com gelo), redissolvido em TE 1X (Tris /EDTA) de tampão e sujeito a electroforese num gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (0,1 ug /ml). fragmentação do ADN foi visualizado sob luz UV utilizando o software Quantity One (Bio-Rad; Hercules, CA).

A caspase-3 ensaio

O EnzChek Caspase-3 Kit de ensaio (Molecular Probes; Eugene, OR) detectar a apoptose por medição da clivagem proteolítica de um amino-metilcumarina (AMC) substrato fluorescente derivada, Z-DEVD-AMC. Resumidamente, as células em 10 cm placas de petri foram tratados com DTX, NFR e CUR, sozinho e em combinação. As células foram colhidas às 24 horas, lisadas, e o ensaio da caspase-3 foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante. A média intensidades de fluorescência foram medidos usando um leitor de microplacas Flx800 (BioTek) com comprimentos de onda de excitação e emissão fixado em 360 ± 20 nm e 460 ± 20 nm, respectivamente.

imunodeteção Ocidental

lisados ​​de células inteiras foram colhidas em diferentes pontos de tempo (30 minutos a 9 horas) pós-exposição ao DTX, NFR e tratamentos CUR usando tampão de lise celular 1X (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). As proteínas foram quantificados usando o reagente de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific; Rockford, IL). Aproximadamente 30 ug de proteína foi fraccionado em géis de 10% SDS-PAGE da Bio-Rad (Hercules, CA) e transferidas para uma membrana de PVDF. A ligação não específica foi bloqueada através da incubação de membranas com um bloqueador quimioluminescente Blok-CH (Millipore) e hibridados com anticorpos primários (desejados 1:1,000 diluição) durante a noite a + 4 ° C e depois com os anticorpos secundários marcados com HRP (1:5,000 diluição) durante 1 h à temperatura ambiente. As bandas foram detectadas utilizando quimioluminescência amplificada (ECL) e o substrato SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). intensidades das bandas foram quantificados utilizando o programa Image-J (NIH) e do valor de densitometria para cada proteína foi normalizada para os correspondentes níveis de p-actina em cada amostra.

Unidades Formadoras de Colônias ensaio

C4- 2B células foram semeadas em placas de 6 cm pratos com 200 células /prato. As drogas, sozinhos ou em combinação, foram adicionadas após 48 horas e os tratamentos foram realizados em 3 poços replicados. Ambos NFR e CUR foram reabastecidas duas vezes por semana e DTX foi reabastecido uma vez por semana, juntamente com o meio de crescimento fresco. Depois de três semanas, as colónias foram fixadas com etanol a 100% e coradas com azul de metileno, e unidades formadoras de colónias (UFC) foram contadas usando o software Uma Quantidade (Bio-Rad).

estudos de xenoenxerto de tumor

Todos os protocolos experimentais envolvendo animais de laboratório foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal na Universidade de Tulane (IACUC; Protocolo # 4295). O

In vivo

antitumoral eficácia da DTX, sozinho ou em combinação com NFR e CUR, foram determinados em xenoenxertos de tumor em ratinhos nus atímicos (NCI, Frederick, MD). Para cada rato (4 semanas de idade), as células C4-2B (2 × 10

6) foram ressuspensas em 100 ul de meio isento de soro e foram injectados por via subcutânea (SC), juntamente com 100 ul de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Quando os tumores atingiram um volume de 50-75 mm

3 (~ 2 semanas após a injecção), os animais foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com veículo, DTX (10 mg /kg), ou com DTX (10 mg /kg) + NFR (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) por injecção intraperitoneal (ip). Antes de cada injecção, drogas foram recém-dissolvido em seus respectivos veículos [23], [43], [44]. DTX foi administrado uma vez por semana, e NFR e CUR foram administrados 5 dias /semana. Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana, utilizando um compasso de calibre e volumes tumorais foram calculados de Vernier, utilizando a fórmula, 0,5 × comprimento x largura

2 [45]. Peso de cada rato foi medido e proporções de tumor para-volume de total de peso foram calculadas em cada ponto de tempo. Os tumores foram excisados, no final do período de tratamento (4 semanas), e seccionados para imuno-histoquímica (IHC) coloração incorporado parafina.

A imuno-histoquímica

tumores foram fixados em 10% de formalina tamponada neutra para 24 h, seguido por 70% de etanol e, em seguida, foram incluídos em parafina. Seções (~ 5 mm) foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina (H E). IHC para a expressão de Ki-67 foi efectuado para determinar o número de células em proliferação. Resumidamente, as secções foram desparafinadas, hidratadas e antigénio recuperada usando 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0). As secções foram primeiro bloqueadas com 3% H

2O

2 e, em seguida, com 1,5% de soro de bloqueio (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). As secções foram então incubadas com o anticorpo anti-Ki-67 durante 30 min à temperatura ambiente. Após duas lavagens em PBS, as secções foram incubadas com o anticorpo secundário biotinilado e depois com o reagente enzimático (kit Vectastain ABC, Vector Laboratories). Os cortes foram corados com diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com corante nuclear de hematoxilina (Vector Laboratories; # H-3401). Foi adicionado meio de montagem permanente e Ki-67 de coloração foi visualizado e capturados usando um microscópio Eclipse E-400 (Nikon Instruments, Melville, Nova Iorque). Em cada lâmina, 5 campos diferentes foram visualizados por Ki-67 de células marcadas e quantificadas utilizando o programa Image-J

TUNEL

Este kit de ensaio deadend colorimétrico TUNEL (Promega;. Madison, WI) foi utilizado para determinar células apoptóticas em secções de tumores, de acordo com os protocolos do fabricante. Este ensaio mede a incorporação de nucleótidos biotinilados em ADN, que é então visualizadas por estreptavidina marcada com HRP e DAB. A coloração foi visualizada por Eclipse E-400 microscópio e imagens foram capturadas a partir de 4 campos diferentes em cada seção tumor.

Synergy determinação

Foi utilizado o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK) para calcular o índice de combinação (IC) com base no método de Chou-Talalay [46]. Este método baseia-se na equação do efeito mediano que inclui equações de Michaelis-Menton, Hill e Henderson-Hasselbalch e proporciona uma medida quantitativa para o aditivo (IC = 1), sinérgica (CI 1) ou antagonista (CI 1) efeitos.

a análise estatística

as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism versão 4.00 Software (San Diego, CA, EUA). Os resultados são expressos como o erro padrão das médias (± SEM). Mudanças significativas em comparação controles foram determinadas por um teste t de Student de duas caudas e valores de p 0,05 foram considerados significativos

Resultados

exposição combinada a Thapsigargin e AKT-inibidor sensibiliza C4. células 2b para DTX-induzida citotoxicidade

para fazer face a nossa hipótese central que segmentação simultânea de ER-stress e AKT percursos irá resultar em quimiossensibilização de células CRPC, primeiro analisou se Tg e Akti-IV coexposure pode sensibilizar C4 células -2b para DTX-induzida citotoxicidade (Fig. 2A). Os efeitos de concentrações crescentes da droga e do tempo de exposição foram inicialmente monitorada por MTT-ensaios. Às 72 horas após a exposição, o IC valores

50 para DTX, Tg e Akti-IV foram 35,8 nM, 80,8 nM e 5,5 mM, respectivamente (Tabela S1 S1 Arquivo). efeitos sinérgicos possíveis de combinação de fármacos foram então investigadas utilizando concentrações mais baixas do que os seus respectivos

50 valores IC. estudos Coexposure mostrou claramente que a combinação de DTX (10 nM), Tg (25 nM) e Aktí-IV (2,5 mM) resultaram em um aumento significativo (p 0,0005) diminuição na sobrevivência de células C4-2B, em comparação com DTX sozinho ( A Fig. 2B). Futuros estudos foram realizados para investigar se coexposure a dois agentes seguros e aprovados, ou seja, NFR e CUR, podem igualmente aumentar DTX sensibilização de células C4-2B.

(A). indução simultânea de ER-stress por Thapsigargin (Tg) e supressão de AKT por um Akt-inibidor (Akt-I) pode tornar as células cancerígenas sensíveis às acções citotóxicas da quimioterapia. (B). efeitos citotóxicos do DTX, combinação sozinho ou com Tg e /ou Akt-I, sobre a viabilidade celular C4-2B. Coexposure a Tg (25 nM) e Akt-I (2,5 | iM) reforçada DTX (10 nM) induziu citotoxicidade às 72 horas após a exposição (n = 3). As barras de erro representam os valores ± SEM e diferenças significativas são mostrados como valores P (***, p 0,0005).

Coexposure concentrações de fisiologicamente atingíveis de NFR CUR sensibiliza células C4-2B para DTX-induzida citotoxicidade

O IC

50 valores para DTX, NFR ou CUR foram calculados após a exposição a drogas individuais para 24, 48 e 72 horas (Tabela S1 no arquivo S1 ). Observou-se uma concentração e supressão dependente do tempo na sobrevivência das células (MTT-ensaio). Em estudos subsequentes, no sub-IC

50 concentrações de drogas foram usadas em 2- ou 3- combinações de drogas e a sobrevivência das células foi monitorizada em diferentes tipos de células, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, ( C) BM-MSC e (D) PrEC (Fig. 3). Embora em 24 hrs ic

50 para DTX, NFR e CUR sozinhos mostraram-se 590,5 nM, 30,3 uM e 59 uM, respectivamente, um aumento significativo (p 0,0005) foi observada em C4-2B citotoxicidade quando DTX estava utilizado em combinação com NFR e CUR. Curiosamente, a rápida de citotoxicidade observados em células C4-2B não era evidente em células não tumorigénicas RWPE-1 ou nas células primárias, isto é, BM-MSCs e PrECs. A análise do índice de combinação (IC) apresentou um valor de 0,045 em células C4-2B, sugerindo um efeito sinérgico forte da combinação de 3-droga. No entanto, os valores de CI para células RWPE-1 e BM-MSC foram encontrados para ser muito mais elevada, isto é, 0,527 e 0,639, respectivamente. Além disso, o valor CI em células PrEC era 2.074, o que sugere um efeito antagonista. Estudos semelhantes de outra linha celular de CaP agressivo, PC-3, também indicado significativa (p 0,0005) aumento na sensibilização DTX seguinte coexposure para ambos NFR e CUR (Tabela S1 S1 no ficheiro e a Fig S1A no ficheiro S1.). Curiosamente no entanto, ao contrário de células C4-2B, sinergismo de drogas em células PC-3 só foi observada em 72 horas após o tratamento. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram claramente que a coexposure NFR e CUR pode rapidamente e aumentar de forma sinérgica a citotoxicidade induzida por DTX na linha CRPC C4-2B, mas não na linha não tumorigénica, RWPE-1. Por isso, estudos sobre os mecanismos moleculares foram realizados para delinear as acções diferencial desta combinação 3-fármaco em ambas as linhas celulares.

efeitos citotóxicos da DTX (10 nM), isolados e em combinação com NFR (5 uM) e /ou CUR (5 uM), são mostrados nas quatro tipos de células seguintes, (a) C4-2B, (B) RWPE-1, (C) e PrEC (D) BM-MSCs. ensaios de viabilidade celular foram realizadas a 24 horas após a exposição e alteração percentual na sobrevivência das células, em comparação com as células não tratadas (controlo), foram determinados. Os MTT-ensaios foram realizados em 3 poços em duplicado e todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes independentes (n = 3). As barras de erro representam ± SEM e as diferenças significativas entre o grupo + NFR + CUR DTX DTX-only e são mostrados como valores P (***, p 0,0005; ** p 0,005)

diferenciais de NFR combinação CUR na apoptose induzida por DTX em C4-2B e células RWPE-1

Nós monitorado se a citotoxicidade diferencial em C4-2B

vs.

células RWPE1 após o tratamento com a combinação de 3 drogas é devido a diferenças de apoptose (Fig. 4). apoptose celular foi avaliada por várias técnicas, tais como a fragmentação de DNA (Figura 4A . 4B), produção de AMC caspase-3 induzida (Figura 4C . 4D) e a clivagem de PARP (Fig. 4E 4F). O ensaio de fragmentação de DNA mostraram que as drogas individuais não induziu apoptose; No entanto, um aumento na laddering padrão era evidente quando DTX foi combinado com qualquer um ou NFR CUR e a apoptose foi reforçada com a combinação de 3-droga. Embora os padrões de fragmentação similares de ADN foram evidentes em células RWPE-1, o ensaio de AMC demonstrou claramente um aumento significativo da actividade da caspase-3 em células C4-2B, em comparação com células RWPE-1. Nem NFR nem CUR sozinho foi encontrado para aumentar a produção AMC; No entanto, a sua exposição combinada aumentou a actividade da caspase-3, e este era evidente, mesmo na ausência de co-tratamento DTX. Além disso, embora NFR ou CUR sozinho pode aumentar a actividade da caspase-3 em células DTX exposto, foram observados os aumentos mais significativos quando ambos NFR e CUR foram usadas em combinação com DTX (comparar pistas 5 e 8). Dados de ensaios de clivagem de PARP confirmaram ainda mais este efeito diferencial da combinação de drogas em morte celular apoptótica. Em células C4-2B, um aumento de 9 vezes foi observada dentro de 9 hrs pós-exposição; No entanto, apenas um aumento de 2,3 vezes foram observados em células as RWPE-1. Portanto, a exposição combinada a NFR e CUR profundamente aumenta a apoptose induzida por DTX das células C4-2B.

A indução de apoptose em C4-2B (A, C, D) e RWPE-1 (B, E, F) células após o tratamento com DTX (10 nM), isolados e em combinação com NFR (5? M) e /ou CUR (5 uM) foi avaliada através de ADN-fragmentação (A e B), ensaio de Caspase-3 (C e e ) e a clivagem de PARP (D e F). Os ensaios de fragmentação de DNA-caspase-3 e apoptose descrevem após 24 horas de pós-exposição. Mudanças na clivagem PARP foi medido às 9 horas pós-exposição. O padrão de laddering de ADN fragmentado foi indicativa de apoptose, o qual foi adicionalmente confirmada pelo aumento de AMC libertado por activado caspase-3 (n = 3) (*, P 0,05). A expressão de ambos PARP total e clivado foi determinada por ensaios de transferência de Western. As setas indicam os níveis de PARP clivada. Fold alterações na clivagem de PARP em células expostas drogas (pistas 2-8), em comparação com células não tratadas (pista-1) são mostrados a seguir a normalização com respectivos níveis de p-actina.

tratamento combinado com DTX, NFR CUR anula PI3K /AKT sinalização em células C4-2B

Para desvendar os mecanismos subjacentes envolvidos na quimiossensibilização pela combinação de 3 drogas, estudos de imunodetecção ocidentais foram realizados para monitorar tanto a activação AKT e a expressão de vários ER- marcadores de tensão (Fig. 5 e Fig. S2 no ficheiro S1). Os estudos iniciais foram realizados para monitorar o tempo de dose e os efeitos dependentes da DTX, sozinho ou em combinação com NFR e /ou CUR, nas células C4-2B (Fig. S2 em S1 do ficheiro). Para determinar os seus efeitos no tempo sobre a sinalização de Akt, as células foram expostas primeiro C4-2B a drogas a partir de 30 minutos até 6 horas e depois estimuladas com insulin-like growth factor-1 (IGF-1, 10 ng /ml) durante 15 min. Ambos AKT total (T-AKT) níveis e AKT fosforilado na serina-473 (p-AKT) foram determinados. Em comparação com células não estimuladas, p-AKT foi aumentada por 3-4 vezes após estimulação IGF1 (não mostrado). Em células C4-2B, a supressão de p-AKT pode ser visto no prazo de 30 minutos de exposição, e foi claramente dentro no prazo de 3 horas. Curiosamente, embora DTX sozinho foi capaz de aumentar os níveis de p-AKT dentro de 30 minutos, este aumento da via de sobrevivência AKT não foi visto em células coexposed a NFR CUR. Os IGF-1 níveis de p-AKT induzidas foram quase abolida em 6 horas pós-exposição à droga (Fig. S2A no arquivo S1). Nem a concentração, nem o tempo de exposição à droga foi capaz de alterar AKT total (T-AKT) níveis em qualquer um dos tipos de células. (2).