Abstract

Os efeitos anti-invasivos e anti-proliferativa de betulins e derivados Abietano foi sistematicamente testados utilizando um modelo organot�ica sistema de, cancros avançados da próstata resistente à castração. Um rastreio preliminar do conjunto inicial de 93 compostos foi realizada em duas dimensões condições (2D) de crescimento utilizando células epiteliais prostáticas não transformadas (EP156T), uma linha de sensível ao androgénio da próstata de células de cancro (LNCaP) e a resistente à castração, A linha de células altamente invasivo PC-3. Os 25 compostos mais promissores foram todos derivados de betulina. Estas foram seleccionadas para uma tela secundária focada em tridimensionais condições de crescimento (3D), com o objectivo de identificar os compostos anti-invasivos mais eficazes e específicos. testes de sensibilidade e de citotoxicidade adicionais foram então realizada utilizando um painel de linhas de células prolongada. Os efeitos destes compostos sobre a progressão do ciclo celular, mitose, proliferação e citotoxicidade não específica versus a sua capacidade de interferir especificamente com a motilidade celular e a invasão da célula tumoral foi dirigida. Para identificar potenciais mecanismos de ação e metas compostos prováveis, foi realizada profiling multiplex de efeitos compostos sobre um painel de 43 proteínas quinases humanos. Estes estudos de-convolução alvo, combinados com a fenotípica análises de Organóides multicelulares em modelos 3D, revelou inibição específica da AKT sinalização associada aos efeitos sobre a organização do citoesqueleto de actina como o piloto mais provável da morfologia celular alterada e motilidade.

Citation: Härmä V, Haavikko R, Virtanen J, Ahonen I, Schukov HP, Alakurtti S, et al. (2015) Optimização dos Efeitos Invasão-específicos de derivados de betulina em células de câncer de próstata através do desenvolvimento de chumbo. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10.1371 /journal.pone.0126111

Editor do Academic: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Austrália

Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 23 de março de 2015; Publicado: 12 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Härmä et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. os autores gentilmente agradecer o apoio financeiro (número Projeto 252308; BARC – Betulins, abietans e resinas como novos compostos de chumbo para o câncer) da Academia da Finlândia ( para KMOC), e tumor microambiente Metástase em resistente à castração do cancro da próstata (número do projeto 267.326) para MN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Além de câncer de pele, câncer de próstata (AEP) é o câncer mais comum em homens, especialmente na Europa. Prca é tipicamente dependente de hormonas e o papel dos androgénios na progressão de a refractário a hormonas AEP dependente de androgénio está bem estabelecido [1]. Early-stage AEP pode ser controlado com sucesso pela operação sozinho e tumores recorrentes são tratados por ablação de andrógenos circulantes pela castração química. Em contraste, em estágio final resistente à castração PRCA (CRPC), com disseminação metastática característica do tumor primário, geralmente até os ossos, continua a ser a principal causa de morte associada ao câncer. Embora o progresso significativo foi feito no tratamento de tumores de próstata primário e andrógeno-sensíveis, terapias curativas que visam especificamente a propagação metastática do avançado e agressivo CRPC actualmente não existem. Em parte, isso está relacionado com a falta de sistemas de modelos experimentais que representam fielmente as características de invasão e celular motilidade

in vitro

ou

in vivo

.

Nem dois padrão dimensional modelos (2D) de cultura de células (linhas celulares) nem modelos animais (rato) xenotransplantes representar fielmente a complexidade dos tumores clínicos. 2D modelos particularmente falta o microambiente tumoral (TME), a matriz extracelular (ECM), e tipos de células do estroma. Tais modelos apenas fracamente corresponder com sensibilidade fármaco observada

in vivo

[2]. Estas deficiências funcionais de descoberta de drogas pré-clínicos são reflectidas pelas altas taxas de desgaste para medicamentos contra o câncer ( 95%) [3] em estudos clínicos subsequentes. Assim, biologicamente mais relevantes

in vitro

modelos de tumores precisam ser desenvolvidas para melhorar a produtividade da descoberta de medicamentos e reduzir o número de animais necessários no desenvolvimento de medicamentos [4]. preparações de ECM de diferentes origens têm-se revelado particularmente crítica para investigar interacções célula-célula e diferenciação na cultura 3D [5]. Integrado, robusto e plataformas 3D padronizadas tornaram-se compatível tanto para alto rendimento (HTS) e de rastreio de alto teor de configurações (HCS) [2], ea tradução eficiente de métodos de cultura celular 3D a partir de pesquisa básica para aplicações industriais está em curso [6 ]. ECM biologicamente relevantes, tais como colagénios ou extractos de membrana de base rica em laminina como Matrigel são agora amplamente utilizados para estudar os mecanismos celulares tais como a motilidade celular e invasão. O espectro de morfologias multicelulares formados por células epiteliais e de cancro da próstata em culturas 3D varia de ácinos glandular totalmente funcional, esferóides tumorais disfuncionais; para estruturas estreladas invasivos [7,8] que não possuem propriedades mais diferenciadas. Assim, a diferente morfologia manifestado em cultura 3D lrECM é um indicador sólido que se correlaciona com várias fases de progressão maligna. Tais modelos celulares 3D biomiméticos fornecer um meio poderoso para quantificar os processos biológicos relacionados com o cancro. Invasão e metástase são as características mais importantes de câncer que pode transformar câncer localizado em uma doença com risco de vida [9]. Na cultura em 3D, a invasão de células de tumor é manifestado tanto por células individuais ou agregados de células que invadem activamente a ECM circundante, utilizando diferentes modos de motilidade (por exemplo ameboides invasão ou colectiva) [10]. PC-3 é uma das poucas linhas de células PRCA que exibe características de invasão coletiva tanto

in vitro

e

in vivo

[7,11]. Tais processos multicelulares complexos não pode ser reproduzida na, sistemas 3D não aderentes independente de ancoragem que carecem de ECM biologicamente funcional, tais como poli-HEMA [12], agar mole [13] ou de culturas “pendurado-gota” do esferóides isolado [14] . Um estudo recente mostrou que os perfis de cancro da mama células cultivadas em 3D lrECM de expressão de genes eram muito mais perto de

in vivo

de monocamada ou culturas poli-HEMA [15]. telas de conteúdo elevadas (HCS), utilizando plataformas baseadas em lrECM foram relatados para próstata [16], de mama [15], pancreático [17], e cancro do ovário [18]. Tais modelos de tecido semelhante cuidadosamente normalizados e miniaturizados são necessárias para capturar sistematicamente os efeitos dos compostos de molécula pequena e /ou drogas, siRNAs, (por exemplo, anticorpos e péptidos) biológicos, factores de crescimento, toxinas ou sobre a biologia do tumor. Estas abordagens biomiméticos complexos são úteis como ferramentas de pré-clínicos fiel para investigar respostas de curto e longo prazo da droga, a falta de terapia, ou o desenvolvimento de resistência às drogas [19]. Combinado com métodos de alto conteúdo de imagem e de análise de imagens microscópicas, modelos fenotípicos 3D também pode ser altamente informativo para a descoberta de chumbo e estudos de otimização de chumbo (LD ou LO, respectivamente), em especial se a droga alvo molecular é desconhecido, e mecanismos complexos, tais como a diferenciação específica de tecido, e célula-célula-interações pode ser avaliado com base na imparcial, multiparamétrica de leitura. A multiplexação de leitura à base de imagiologia também permite a avaliação simultânea de citotoxicidade, a apoptose, e efeitos sobre o ciclo celular, v.g. por utilização de sondas fluorescentes apropriados [2,20], reduzindo assim a necessidade de estudos de validação excessivas. Além disso, ensaios de células vivas 3D em tempo real e com base na análise de alto conteúdo de imagem podem ser combinados com estudos de ponto de extremidade que abordam a expressão de biomarcadores, tal como descrito nas publicações anteriores [7,11].

(produtos naturais NPS) foram inestimáveis ​​como ferramentas para decifrar a lógica da biossíntese e como materiais para o desenvolvimento de drogas de primeira linha [21] partida. Na verdade, a maioria das novas entidades químicas aprovadas como drogas por os EUA Food and Drug Administration (FDA) têm sido consistentemente tanto NPs ou compostos NP-derivados [22]. Os triterpenóides pentacíclicos, metabólitos secundários de plantas abundantemente encontrado em frutas de casca, folhas e casca do caule, têm despertado grande interesse como agentes terapêuticos e suplementos alimentares [23,24]. Além disso, os derivados semi-sintéticos dos triterpenóides que ocorrem naturalmente têm sido estudados activamente na busca de novos agentes anticancerígenos, com foco específico sobre as propriedades anti-invasão [24-29]. Betulina e ácido betulínico são do tipo lupano triterpenos pentacíclicos abundante na casca das espécies de bétula do género

Betula

L. [30]. derivados de ácido betulinico e betulina outro tem efeitos anti-virais, anti-inflamatória, anti-maláricos, anti-cancerígenas e [31]. Além disso, o ácido betulínico foi identificado como um indutor selectivo de apoptose em células de melanoma [32], provocando um forte interesse em triterpenos como agentes anticancerígenos. Além disso, a betulina foi encontrado para bloquear as propriedades invasivas de cérebro e cancro do pulmão de células, bem abaixo da sua concentração citotóxica, sugerindo um efeito quimiopreventivo promissora contra metástases [33]. No presente estudo, utilizamos uma combinação de modelos de células em 2D e 3D AEP e métodos HCS baseada em imagens e análise de imagem automatizado, para avaliar e validar as propriedades antineoplásicos e anti-invasivos de uma biblioteca de 93 compostos. Nesta biblioteca, incluímos o betulin compostos parentais, ácido betulínico (2) e seus derivados semi-sintéticos e compostos a partir de uma outra classe de terpenóides com efeitos biológicos menos estudada, a abietanes. No geral, a biblioteca composta por 78 betulins e 15 abietanes.

Resultados e Discussão

Síntese de uma biblioteca de betulina e Abietano derivados

partida

Um conjunto de 76 derivados de betulina foi preparado de betulina e ácido betulínico (1), ao passo que 13 derivados foram preparados a partir de ácido dehidroabiético e dehydroabietylamide (figuras 1-3, consulte Arquivo também S1), utilizando nossa experiência em química de produtos naturais e seguimento de nossos procedimentos relatados anteriormente ou os de outros [ ,,,0],34-37]. ácido Betulonic (2) foi obtida a partir da betulina por oxidação de Jones, e usado como um intermediário versátil para a síntese química. Diferentes substituintes foram inseridos nas posições 3 e 28 do núcleo lupano. Alguns derivados também foram preparadas por fusão de heterociclos de anel A, nas posições 2 e 3. Outros compostos continha um anel adicional fundida com anéis de C, D e E. A redução da cadeia lateral do núcleo isoproprenyl triterpeno foi feito para alguns dos derivados . rearranjo da cadeia lateral também resultou em compostos do tipo germanicane. Nos abietanes definir os compostos preparados consistia principalmente de derivados de ureia e amida.

High Throughput Screening (HTS) para bioatividade

Estes compostos foram compilados como uma biblioteca e actividade biológica foi testada utilizando culturas de células em 2D em placas de 384 poços em alta throughput screening (HTS) formato (Fig S1). As linhas celulares utilizadas foram EP156T (epitélio da próstata não transformada), LNCaP (andrógeno sensível AEP), e PC3 (resistente à castração, invasivo AEP). Os experimentos foram realizados em três concentrações diferentes de compostos (0,1, 1 e 10 pM) em triplicado, usando CellTiterGlo como um ponto final read-out para a proliferação celular. Um painel de 25 derivados de betulina foi sintetizado de acordo com os compostos mais eficazes e específicos do cancro identificados no rastreio preliminar 2D, e seleccionadas para mais estudos.

alta Triagem conteúdo (HCS) para a actividade de bloqueio de invasão

em seguida, estes 25 compostos mais eficazes foram testados em ambientes 3D para propriedades anti-invasivos específicos. Três padrão de compostos de cuidados amplamente utilizados contra a AEP foram adicionados como controlos; ou seja, o antagonista do receptor de androgénio enzalutamida (MDV3100), o C17α-hidroxilase /C

17,20-liase de abiraterona inibidor (Zytiga), e o paclitaxel inibidor mitótico clássico. Tratamentos começou no dia 4, quando ácinos redondos bem diferenciados foram estabelecidos. exposição composto foi então continuou durante seis dias, quando a maioria das estruturas multicelulares não tratados tinham transformado em um fenótipo altamente invasivo.

imagem morfométricas automatizado de análise (AMIDA) e avaliação estatística

A célula 3D ao vivo culturas foram então coradas com corantes reactivos calceína AM para detectar estar, e homodímero de etídio para detectar células mortas. Imagens (Fig 4A) foram adquiridos com os dados do microscópio e de imagem confocal foram analisados ​​com o software AMIDA [38]. Os princípios de análise de imagem morfométricas são brevemente descritos no S2 Fig.

PC-3 células foram cultivadas em 3D Matrigel ECM por 4 dias e tratados durante 6 dias com 25 derivados de betulina (de telas 2D de alta produtividade), DMSO /controlo de veículo, e três compostos de referência. A) as projeções de intensidade máxima de representação de imagens de pilha microscópio confocal para tratamentos compostos selecionados a 300 concentração nM (5 × objetivo, escala de 100 m). B) três gráficos que mostram o impacto relativo de três parâmetros morfométricos para 7 derivados de betulina, controlo de DMSO, e um composto de controlo (paclitaxel). dimensionamento de dados: mostra a diferença relativa entre mediana de Rácio de área /Complexidade /Area, ao controle de DMSO. tratamentos de paclitaxel e controlos DMSO foram atribuídos valores de -100 e 0, respectivamente. C) de agrupamento hierárquico foi feito usando três parâmetros morfológicos derivados de Organóides PC3: tamanho esferóide (área), a complexidade eo número de células mortas. D) Ferida curvas dos dois derivados de betulina 4 e 20 de cura, com destaque para o nível de corte de 50% (laranja linha tracejada).

Figura 4A mostra imagens de microscópio confocal representativos para alguns dos derivados de betulina . A, controle antimitotic paclitaxel altamente eficaz drogas destacou-se mesmo em concentrações muito baixas (30 e 100 nm), mostrando um forte efeito sobre todas as medidas morfométricas (Fig 4B): isto resultou em menor (área reduzida), Organóides menos invasivos (redução da complexidade ), com um aumento do número de células mortas. O abiraterona compostos de controlo e enzalutamida não teve qualquer efeito perceptível sobre células PC-3. Curiosamente, o ácido betulinico (1) e ácido betulonic (2) não mostraram efeitos anti-invasivos significativas, enquanto que o composto 3, com um substituinte isopropilo a C19, era um dos agentes inibitórios anti-invasivo, crescimento mais potentes. Da mesma forma, os derivados de isoxazol 4 e 5 mostrada forte inibição do crescimento e efeitos anti-invasivos em concentrações mais baixas (tão baixas quanto 100 nM para 4 e 300 nM para 5). Todos estes compostos eficazes diferem apenas na posição C19: composto 4 tem uma cadeia lateral de isopropilo, enquanto o composto 5-isopropenil tem a cadeia do lado original. Além disso, quando o anel de isoxazole de 5 foi substituído com um anel pirazole, o composto resultante 6 foi ainda mais potente e provou ser especificamente anti-invasiva. Em contraste, os derivados de isoxazol com um grupo formilo (7) ou um grupo acetoxi (8), uma amida primária (9) ou um grupo hidroxi (10) grupo na posição C28 exibido efeitos insignificantes sobre o fenótipo invasivo. A relevância do grupo carboxilo na posição original é C28 (ácido betulonic, 2) para a actividade anti-invasiva ou citotóxica foi estudada através da substituição deste grupo com vários grupos amida. Nenhum destes compostos apresentou efeitos anti-invasivos significativas (11, 12, 13, e 14) (não mostrados). Além disso o composto 15 mostrou efeitos anti-invasivos fortes a 1,0 uM, sem qualquer inibição do crescimento. No entanto, quando o seu grupo carboxilo em C17 foi convertido num grupo amida primária, o composto resultante 16 tinha o mesmo nível elevado de efeitos anti-invasivos como o composto 15. Em contraste, os derivados de amida terciária com (17) ou grupos de nitrilo (18) em C17 foram inactivos (não mostrado). Dois derivados de piridina foram também testados. Nenhuma perda de actividade anti-invasiva foi observado se o azoto da piridina foi adjacente à posição C3 do esqueleto original é lupano (19), ou ao lado da posição C2 do esqueleto lupano (20). Curiosamente, ambos os compostos 19 e 20 foram potentemente anti-invasivo na significativamente as concentrações mais baixas, em comparação com o composto 15.

Em seguida, foram realizadas análises estatísticas para interpretar os dados de imagem de complexos (Figura 4B e 4C). Por simplicidade, focada em apenas três, parâmetros histológicos básicos do multiparamétrica AMIDA leitura (Fig 4B): 1) Área (indicando crescimento do Organóides), 2) a complexidade estrutural (como uma medida da intensidade da invasão), e 3) Área relativa de células mortas dentro Organóides (sinal vermelho, como uma medida de citotoxicidade ou apoptose). Área (Tamanho de Organóides; Figura 4B, painel superior) foi medida como o número de pixels dentro de uma estrutura segmentada. A transformação logarítmica da área de dados /Tamanho foi usado, que mostrou uma distribuição perto de Gaussian (normal) dentro das imagens. Forma Complexidade (Fig 4B, painel do meio) foi obtida usando o tamanho da estrutura (área) e perímetro (número de pixels de fronteira). O mais regular a forma de um organ�de, o mais próximo estiver de um círculo perfeito, minimizando assim o perímetro em relação ao tamanho do objeto. Observou-se perto de dependência linear entre log (Area) e log (Perimetral), indicando uma relação natural (funcional) entre essas duas características. Montagem de uma linha de regressão com os dados resultou em uma estimativa útil do perímetro médio de qualquer estrutura organ�de. Desvios desta média (resíduos) foram interpretados como uma medida para a complexidade da forma Organóides. Como um limite inferior lógica para esta medida (representado por um círculo perfeito), ajustamos a intercepção (nível de altura) da linha de regressão para processar todos os resíduos retornado como números positivos. Esta medida simplificada, rápida da complexidade multicelular indicou que o logaritmo de resíduos resulta numa distribuição de valores quase simétrica. agrupamento hierárquico, usando essas três medidas básicas de culturas PC3 produziu um dendrograma simples com dois ramos principais: o primeiro grupo incluía os compostos mais potentes anti-proliferativa e anti-invasivos (Fig 4C: amarelo). O segundo grupo representa fraco (Fig 4C: vermelho) e não efetiva (Fig 4C: cinza). Compostos

Validação de propriedades anti-invasivos

Com base na tela principal, foram selecionados seis derivados de betulina para uma validação adicional dos efeitos anti-invasivos por métodos adicionais. Num ensaio de cicatrização da ferida padrão realizado em monocamada de cultura 2D, a eficácia de alguns compostos era notavelmente diferente para configurações 3D. Por exemplo, os compostos 4 e 20 completamente reduzida de invasão em 3D já a 300 nm, respectivamente (Figura 4A), mas mostrou apenas uma redução de 50% de encerramento de feridas após 64 horas (Fig 4D) na mesma concentração. Além disso, o composto 5 inibiu eficazmente a transformação invasiva de PC-3 esferóides já a 300 nm em 3D (S3A figura), medido como “% arredondamento” retida depois de 10 dias), mas concentrações superiores a 1 uM foram necessárias na cultura 2D para efeitos comparáveis (Fig S3B). Também os agentes anti-invasivos mais potentes 6, 16 e 19 (activos a 100 nM em condições 3D) reduziu o fechamento da ferida em 2D única em 50% a 3 | iM e 1 uM, respectivamente (Fig S3B). Composto 21 é incluído aqui como um exemplo para os derivados inativos. O facto de muitos compostos não tinham a mesma potência em cultura em monocamada 2D convencional sugere que os alvos biológicos ou vias envolvidas na motilidade celular não são igualmente activos na migração de células em superfícies de plástico. É também provável que a mobilidade celular em cultura de monocamada 2D é controlado por outros mecanismos que invasão colectivo em um andaime 3D.

ecrãs 3D secundárias.

Em seguida, os 25 derivados de betulina seleccionados representado nas Figs 1-3, incluindo os compostos de controlo foram novamente testados completamente através do mesmo painel de linhas de células derivadas da próstata já utilizados no, tela de alto rendimento preliminar 2D. Os dendrogramas resultantes foram quer gerada separadamente para cada linha celular (Fig S4), combinadas em um único dendrograma (Figura 5A), ou como mostrado reduzidos tamanhos organ�de (área; Figura 5B). Nos não-invasivas, mas sensível ao hormônio Organóides LNCaP, a maioria dos efeitos compostos foram relativamente suaves. Os tratamentos não eficazes constituem a vasta maioria do gráfico (Fig S4: cinzento), enquanto os poucos compostos eficazes caem em dois ramos ligados (amarelo e vermelho). Como esperado, o antagonista do androgénio enzalutamida mas não abiraterona estavam entre os tratamentos eficazes. clusters de paclitaxel em conjunto com derivados de betulina em concentrações mais elevadas-destes compostos foram também eficazes na, células PC-3 invasoras resistentes ao hormônio. O dendrograma para dependente de hormonas, não-invasivo LAPC-4 (Fig S4B) novamente demonstra a eficácia de todos os controlos positivos (abiraterona, enzalutamida e paclitaxel; nos pólos de amarelo e vermelho). Os derivados de betulina mais ativos novamente cair dentro desses mesmos clusters (3, 4, 6, 16, 19 e 20) adjacentes aos controles positivos. Em contraste com linhas de células de AEP, a linha não transformada, como células normais-Ep156T (Fig S4C), também respondeu a betulonic ácido (2), pelo menos na concentração mais elevada. Em geral, tal como com células LNCaP e LAPC4, os efeitos sobre o crescimento Ep156T foram ligeiros (Fig 5B).

derivados de betulina experimentais e compostos de controlo foram testados através de um painel de linhas de cancro da próstata (LNCaP, LAPC-4) e não transformadas, as células epiteliais da próstata (EP156T) em cultura 3D. A) O dendrograma é baseada em três principais parâmetros morfológicos e combina todos os dados de telas 3D primárias e secundárias. tratamentos compostos eficazes são indicados em vermelho e amarelo, amarelo sendo específico invasão a mais. B) boxplots mostrando o impacto de compostos selecionados no tamanho do esferóide (Area). dimensionamento de dados:., tal como descrito na figura 4 C) Efeitos de todos os derivados de betulina e compostos de controle sobre a morte celular (número de células mortas)

A fim de auxiliar a categorização funcional dos nossos derivados de betulina, combinamos todos os dados para um único dendrograma, mostrado na figura 5A. Além disso, a representação multiparamétrica de todos os dados experimentais como um único mapa de calor é altamente informativa (Fig S5) e uma forma potente para ilustrar os efeitos dos compostos sobre o crescimento, a complexidade estrutural e morte celular em várias linhas celulares. Foram divididos os compostos e os controlos em três grupos: compostos 1) inibidor do crescimento, 2) compostos anti-invasivos fortes e fracos, e 3) compostos inactivos. Os efeitos morfológicos na cultura 3D estão resumidos na S6 Fig os efeitos anti-invasivos mais potentes (em células PC-3) foram mostrados por compostos 3, 4, 6, 15, 19 e 20, em concentrações de 300 nM ou inferiores (com a excepção de o composto 15), sem efeitos significativos sobre as outras linhas celulares. A maior parte destes compostos, no entanto, mostrou efeitos inibidores do crescimento em todas as linhas de células a concentrações de 1 uM ou superior. Em conclusão, muitos derivados de betulina são citotóxicos e inibir o crescimento das células em concentrações elevadas ( 1? M). No entanto, a concentrações mais baixas, estes compostos podem actuar como inibidores potentes e específicos de invasão celular e a motilidade.

Estimativa de anti-invasivo vs actividade citotóxica.

Para excluir que os efeitos citotóxicos e anti-mitóticos foram mal interpretados como anti-invasivo, testámos os compostos 4, 5, 6, 19 e 20 para inibição da proliferação e na indução de morte celular de uma cultura em monocamada em 2D (resumidos na Figura 6). Uma ampla gama de concentrações de composto (1 nM a 30 uM) foram usados ​​para, linhas celulares LNCaP e PC-3 Ep156T, e analisadas com o gerador de imagens de alta conteúdo PerkinElmer Opereta. Em células PC3, a maioria dos compostos não mostram efeitos significativos sobre a proliferação a concentrações inferiores a 10 uM (Fig 6A). As células LNCaP foram mais sensíveis, com inibição do crescimento /citotoxicidade a partir de 3? M. Os efeitos sobre as células não transformadas Ep156T, sensível à apoptose foram mais fortes. Aqui, os efeitos citotóxicos foram já observadas tipicamente em 0,3-1 uM. Nenhum dos compostos especificamente induzida morte celular em PC-3 ou células de LNCaP em concentrações inferiores a 30 uM (Fig 6B e 6C, excepto para o composto 19). Nós ainda calculados CE

50 valores para a proliferação, apoptose e morte celular para cada composto, utilizando o software Harmony PerkinElmer (validação do método mostrado na S7 Fig). O único ensaio que produziu resultados consistentes com os dos derivados de betulina testados no modelo de cultura de células em 2D foi o ensaio de proliferação (Tabela 1).

A) A proliferação celular /número de células, B) a morte celular programada (apoptose ), e C) o número de células mortas foram avaliadas por ensaios convencionais, combinado com elevado teor de microscopia (Opereta). As células foram tratadas com os cinco derivados de betulina mais eficazes, incluindo o controlo de paclitaxel durante 72 horas. A proliferação foi medida como o número total de núcleos (= células), a apoptose como a relação da caspase-3 positiva contra todas as células, a morte das células e como homodímero de etídio-2 núcleos positivos contra todas as células.

efeitos sobre a progressão do ciclo celular e a mitose

próximo testado se os derivados de betulina teve efeitos específicos sobre a progressão do ciclo celular e a mitose em concentrações de 300 nM (não mostrado) e 1 uM em cultura 2D (figura 6D e Fig S8). Não houve diferenças perceptíveis na progressão do ciclo celular em resposta a qualquer um dos compostos testados. Também avaliamos a proliferação celular e mitose medindo PCNA e os níveis de proteína ciclina B1 (S8B FIG). Como esperado, os derivados de betulina não mostrou qualquer efeito sobre a expressão da proteína, quer na concentração testada. Estes achados novamente apoiar essa derivados de betulina são apenas citotóxica ou causar danos no DNA em concentrações elevadas (AEP CE

50 valores variando de 1-90? M), ao passo que eles promovem efeitos anti-invasão consideráveis ​​em baixas concentrações nanomolares.

mecanismo possível (s) de ação dos derivados de betulina.

a fim de elucidar possível mecanismo de ação para os nossos derivados de betulina, foi utilizada uma matriz de fosfo-quinase que quantitativamente detecta os níveis de fosforilação de 43 cinases em Os lisados ​​celulares (Fig 7). Os lisados ​​foram extraídos a partir de culturas de células em 3D de células PC-3, e expostos a compostos derivados de betulina para curto (4 horas) ou longo prazo (6 dias) períodos. Para estes estudos, foram selecionados os dois derivados representativos 5 e 20 como os inibidores citotóxicos mais específicos, menos de invasão celular. A curto prazo (4 h) A exposição foi realizada a uma relativamente elevada concentração de 1 uM, enquanto que para a exposição de longo prazo (6 d), uma concentração de apenas 300 nM foi utilizado; ambos bem abaixo da CE citotóxica

50 valores (10 mm para composto 5 e 67 mm para composto 20). As matrizes também cinase foram quantificadas por densitometria de imagem (Fig 7A). níveis de fosforilação de quatro cinases, em ambas as exposições de curto e longo prazo, claramente foram diminuídos: STAT3 (Y727), c-Jun (S63), eNOS (S1177) e PLC-γ1 (Y783) (Fig 7A painéis superior e inferior) . Ambos os compostos também reduzida p53 (S15) a fosforilação da exposição de curto prazo e P70 S6 cinase (T389), p53 (S392) e PYK2 (Y402) fosforilação na exposição de 6-d, e aumento da fosforilação AMPKα1 (T174). efeitos específicos de compostos para substância 20 incluídos fosforilação diferencial de sites, pan-JNK, GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) e WNK1 (T60) Hck (Y411). Akt (S473) fosforilação só foi inibida pela exposição de 6-d. Composto 20 também aumentou a fosforilação de mTOR (S2448), Fyn (Y420) e Src (Y419). Em contraste, o composto 5 não causou alterações específicas na actividade de cinase na exposição de curta duração, e mostrou apenas algumas alterações distintas no tratamento a longo prazo. Mais notavelmente, Akt (T308), também a fosforilação foi suprimida quase inteiramente em resposta à exposição com o composto 5, ao passo que a fosforilação de sítios p53 S46 e S392 foram consistentemente diminuída (Fig 7A). A redução de actividade de AKT por ambos os compostos foi validada por transferência de Western, utilizando um anticorpo independente, p-AKT específico (Fig 7B). Os tratamentos de curta duração causadas mudanças modestas apenas com uma redução máxima de fosforilação da proteína por duas vezes (20: GSK-3α /β S21 /S9 e STAT3 Y705). níveis de fosforilação de apenas três quinases foram alterados mais de 2 vezes nos riscos a longo prazo, ou seja, AKT (T308), p53 (S46) e eNOS (S1177), causadas por concentrações nanomolares de composto 5. Composto 20 teve muito menos dramática efeitos sobre a fosforilação da quinase quando comparada ao composto 5, apesar dos seus efeitos anti-invasivos geralmente mais pronunciados. Em resumo, o observado AKT e p53 actividade, bem como os níveis de fosforilação de várias proteínas alteradas incluindo eNOS, pan-JNK, e GSK-3α /β reduzida, sugerem uma desaceleração do metabolismo celular ou diminuiu a viabilidade celular.

PC -3 esferóides foram expostas a dois derivados de betulina representativos, 5 e 20, durante 4 h (a 1 uM) e 6 dias (a 0,3 uM). A) quantificação Computacional de intensidades de sinal a partir dos painéis alinhados quinase, por alterações observadas dobragem (esquerda para a direita). B) Western blot do total e fosfo-Akt (S473) mostrado tanto para curto e longo prazo da exposição a 20 e 5.

Nós também explorou as morfologias multicelulares 3D de PC-3, LNCaP e esferóides Ep156T expostos aos 5 derivados de betulina selecionados, tanto para períodos curtos e longos de 4 horas e 6 dias. A partir de uma análise detalhada do citoesqueleto de actina F (coloração faloidina), tornou-se evidente que os compostos 5, 6, 15 e 20 efetivamente interrompido a organização do citoesqueleto de actina após 48 horas de exposição (Fig 8a). Curiosamente, uma actina fenótipo “saca-rolhas” quase idêntico foi visto nos ácinos Ep156T normal e PC-3 (Fig 8A esferóides: ampliação do painel do lado direito), enquanto que a organização da actina cortical típico em esferóides LNCaP permaneceu intacta. Isto sugere que estes derivados de betulina pode ter como alvo vias relevantes na morfogénese acinar e processos dinâmicos envolvidos na mobilidade celular (também células EP156T formar dinâmica “ramificação” estruturas que penetram no ECM). Para comparações fenotípicas, testou-se um painel de compostos de referência segmentação Akt, Rac, ROCK, Src, e outras vias, em geral ligadas ao citoesqueleto de actina. Nenhum dos compostos testados de controlo afectado o citoesqueleto de uma forma comparável, com excepção de a, estaurosporina inibidor não-específico pan-cinase. No entanto, estes efeitos não foram uniformes em todo o painel de linhas celulares (Fig 8B, ampliação à direita).

citoesqueleto de actina (filamentosa ou F-actina) é manchado verde (phalloidin), núcleos com um corante vermelho (