Abstract

Fundo

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) apresenta-se como uma doença progressiva abrangendo pré-cancerosas, pré-invasiva, localmente invasivo e lesões metastáticas. Identificação de vias biológicas reflexivas desses estágios progressivos, e genes expressos de maneira aberrante associados com estas vias, seria concebível reforçar abordagens terapêuticas para esta doença devastadora.

Metodologia /Principais Achados

Através da construção e análise de bibliotecas SAGE, nós determinamos perfis transcriptoma para carcinoma-in-situ pré-invasiva (CIS) e carcinoma invasivo de células escamosas (SCC) do pulmão, e comparou-os com perfis de expressão geradas a partir de ambos epitélio brônquico e metaplásico pré-cancerosas e lesões displásicas usando

Ingenuity Pathway Analysis

. Expressão de genes associados com o desenvolvimento da epiderme e perda de expressão de genes associados com a biologia mucociliar, são características predominantes do CIS, em grande parte comuns com lesões pré-cancerosas. Além disso, a expressão de genes associados com xenobióticos metabolismo /desintoxicação é uma característica notável do CIS, e é em grande parte mantido em câncer invasivo. Os genes relacionados com a fibrose tecidual e a resposta imunitária de fase aguda são característicos do fenótipo invasivo SCC. Além disso, os dados aqui apresentados sugerem que o tecido remodelação /fibrose é iniciada nas fases iniciais de CIS. Além disso, este estudo indica que a alteração no status de cópia-número representa um mecanismo plausível para a expressão diferencial de genes em CIS e SCC invasivo.

Conclusões /Significado

Este estudo é o primeiro relato de grande- dimensionar perfis de CIS do pulmão expressão. perfil de expressão imparcial destas lesões pré-invasivas e invasivas fornece uma plataforma para futuras investigações sobre os eventos genéticos moleculares relevantes para estágios iniciais de desenvolvimento NSCLC escamosas. Além disso, up-regulamentados genes detectados em diferenças extremas entre o CIS e câncer invasivo pode ter potencial para servir como biomarcadores para a detecção precoce

Citation:. Lonergan KM, Chari R, Coe BP, Wilson IM, Tsao MS, Ng RT, et ai. (2010) transcriptoma Perfis do carcinoma-in-situ e invasivos não-pequenas células do cancro do pulmão como revelado por SAGE. PLoS ONE 5 (2): e9162. doi: 10.1371 /journal.pone.0009162

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de outubro de 2009; Aceito: 07 de janeiro de 2010; Publicação: 11 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Lonergan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Genome Canada /Genoma British Columbia, Cancer Institute canadense Research Society (CCS # 20485) e da Canadian Institutes of Health Canada (MOP200113 e MOP 86.731). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é estimado para infligir a maior taxa de mortalidade por câncer nos Estados Unidos em 2009 [1]. terapias moleculares alvo dirigidos a vias de transdução de sinal activas na proliferação celular, diferenciação, apoptose, e a angiogénese, têm sido usados ​​no tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), mas com resultados variados e muitas vezes desapontantes [2], [ ,,,0],3], [4], [5], [6]. Como a orientação simultânea de múltiplas vias de sinalização tem mostrado melhorias na resposta clínica [6], ainda conhecimento de vias biológicas envolvidas no desenvolvimento do cancro do pulmão, juntamente com a identificação de genes expressos de maneira aberrante dentro destas vias, seria esperado para facilitar o desenvolvimento da nova intervenção terapêutica [7], [8].

Carcinoma-in-situ (CIS) do pulmão, são lesões pré-invasivas de NSCLC escamosas, frequentemente associados a histológica, citológica e aberrações genéticas e progressão para cancro invasivo normalmente segue-se [9], [10], [11], [12]. Como essas lesões minutos são otimamente visíveis nas vias aéreas centrais por broncoscopia fluorescente ou VIDA (pulmão-imagem fluorescente endoscopia) [13], [14], estudos experimentais e clínicos são raros (Figura 1). Embora muitos estudos de expressão profiling têm sido relatados para os tumores de pulmão estágio avançado [15], [16], fase inicial (CIS e localmente invasivo) lesões permanecem largamente inexplorado. análise genética molecular das lesões pré-invasivas, livre de ruído de fundo associado a tumores avançados comumente estudados, é essencial para a identificação de genes-chave e vias moleculares subjacentes eventos precoces na transformação neoplásica e desenvolvimento de câncer correspondente. A compreensão destes primeiros aberrações é essencial para a intervenção terapêutica rápida desta doença devastadora.

A broncoscopia usando A. luz branca para a detecção de lesões da CEI (indicado pela seta), ou B. VIDA (pulmão-imaginar a endoscopia fluorescente ) para a detecção de lesões da CEI (indicado pela seta). seção C. histológica identificação de uma lesão CIS dentro do epitélio brônquico, caracterizado por extensa estratificação escamosas.

em larga escala estudos de expressão gênica frequentemente empregam tecnologias de microarray. Estudos recentes enfatizam o valor de matrizes feitas sob medida, com a seleção de alvos baseada em conhecimento prévio da expressão do gene, para refletir com mais precisão o transcriptoma do tecido de interesse; especificamente aplicada ao estudo do NSCLC [17]. SAGE (análise em série da expressão do gene) oferece uma abordagem baseada em sequência, não enviesada para análise transcriptoma abrangente, com nenhum conhecimento prévio de expressão necessários [18]. Além disso, as informações obtidas a partir da análise SAGE potencialmente contribui para o design de microarrays mais apropriadas para a pesquisa focada e fins de diagnóstico.

Em um estudo anterior, descrevemos as transcriptomes de epitélio brônquico danificada pelo fumo e parênquima pulmonar por meio de SAGE [19]. Aqui nós estendemos nossa análise para a fase de pré-invasiva inexplorada no desenvolvimento do câncer de pulmão, e apresentar o primeiro relatório de grande escala de perfil do carcinoma-in-situ do pulmão expressão. Além disso, descrevemos transcriptomes para carcinoma invasivo de células escamosas (SCC), e metaplásico pré-cancerosas e lesões displásicas (PC), derivados da construção e análise de várias bibliotecas SAGE, culminando em mais de 22 megabases de informações sequência. Através da utilização de

genes Engenho Caminho Análise

, foram identificados associados com o desenvolvimento e o metabolismo xenobiótico epidérmico /desintoxicação como componentes de lesões da CEI, e os genes associados com a resposta imune e a remodelação de tecido /fibrose como componentes de SCC invasivo. Além disso, encontramos genes associados à diferenciação mucociliar a ser regulada para baixo em ambas as lesões da CEI e PC. Discutimos a possibilidade de relevância dessas aberrações de transcrição para os estágios iniciais de desenvolvimento do cancro do pulmão, e apresentar uma visão do transcriptoma CIS até então desconhecida.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Este estudo foi aprovado pela Universidade de Conselho de Ética em Pesquisa britânica Agência Columbia-Britânica Cancer Columbia (UBC-BCCA REB). Foi obtido consentimento escrito de todas as disciplinas.

Os espécimes

epitelial brônquica (BE) espécimes de escovação foram previamente descritos [19]. amostras de biópsia incluído pré-cancerosa (PC) lesões (metaplasia, displasia), lesões de carcinoma-in-situ (CIS), e tecido tumoral de carcinoma invasivo de células escamosas (SCC). PC e espécimes da CEI foram obtidos por meio de broncoscopia autofluorescente (Figura 1). Todas as biópsias (exceto os utilizados na construção de bibliotecas CIS-3, SCC-5 e SCC-6) foram coletadas em RNA

depois

® [Applied Biosystems (Ambion Inc., Canadá)] e armazenado a – 85 ° C. A biópsia utilizado na construção da biblioteca de cis-3 foi incorporado em meio OCT e guardadas a -85 ° C. Para a construção de bibliotecas SCC-5 e SCC-6, o RNA foi isolado a partir de tecido de tumor de oito indivíduos por isotiocianato de guanidínio e extracção com fenol /clorofórmio. Todos os indivíduos que contribuem para este estudo ou eram antigos ou actuais fumadores (Tabela 1).

SAGE construção da biblioteca e processamento sequência

Com a exceção de construção de bibliotecas SCC-5 e SCC -6, cada amostra (biópsia brônquica ou escovagem, como previamente descrito [19]) foi recuperada a partir de ARN

mais tarde

® (ou OCT para a biblioteca de cis-3), e homogeneizado em lise /solução de ligação. Para bibliotecas SCC-5 e SCC-6, o ARN foi reunido a partir de quatro amostras em quantidade igual, e ~19 ug de RNA total foram imersos em lise /solução de ligação e usado para a construção de cada biblioteca. Os lisados ​​resultantes foram usadas directamente para SAGE construção da biblioteca de acordo com o protocolo MicroSAGE, utilizando

Nla

III, tal como a enzima de ancoragem e

Bsm FI

como enzima de marcação (www.ncbi.gov/SAGE ). Esta abordagem foi mostrado para produzir bibliotecas SAGE altamente reprodutíveis [19]. Em média, 10

5 marcas SAGE, excluindo ligador e duplicar ditags, foram sequenciados por biblioteca; Todos os dados em bruto SAGE foi depositado com GEO (Tabela 1). Para a normalização, as contagens de tag foram dimensionadas para 10

6 tags para cada biblioteca, ou seja, como tags por milhão (TPM).

Cluster análise

Para avaliar o grau de similaridade entre o pulmão bibliotecas SAGE gerado neste estudo (duas bibliotecas PC, cinco bibliotecas da CEI, e seis bibliotecas SCC invasivos) e os gerados em um estudo anterior (14 BE bibliotecas e duas bibliotecas do parênquima pulmonar), foi utilizada a análise de cluster. Para esta análise, as 300 marcas mais abundantes foram retidos de cada biblioteca, produzindo uma lista mesclada de 1128 tags únicas. Os dados foram então log

10 transformado e agrupados usando

Genesis

, usando um algoritmo de ligação média e uma distância euclidiana métrica [20]. Para tags com contagem de zero, os dados não foi transformada, e foi mantido como zero.

A expressão diferencial análise

Salvo disposição em contrário, a expressão diferencial de genes foi definida por uma diferença de três vezes o mínimo (arredondados para uma casa decimal) nas contagens médias normalizadas tag (TPM) entre dois conjuntos de dados que estão sendo comparados. Além disso, uma contagem normalizada média mínima tag de 40 TPM era necessário no conjunto de dados-over expressar. Tag-to-gene mapeamento foi de acordo com o banco de dados SAGE Genie, 17 de setembro de 2009 Versão [21] (cgap.nci.nih.gov/SAGE). Como o mais novo lançamento da SAGE Genie não alinhar automaticamente para transcritos mitocondriais, utilizamos uma abordagem de mapeamento manual para identificar essas transcrições.

A análise dos dados

Os conjuntos de dados de genes diferencialmente expressos foram analisados ​​principalmente através da uso de

Ingenuity Pathway Analysis

(IPA), versão 8.0 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Análise funcional dos conjuntos de dados inteiros

identificaram as funções e /ou doenças que foram mais significativas para o conjunto de dados biológicos. Genes do conjunto de dados que foram associados com funções biológicas e /ou doenças no Ingenuity Pathways Knowledge Base foram considerados para a análise (IPA elegíveis mapeados IDs).

análise de caminho Canonical de conjuntos de dados inteiros

identificados os caminhos da biblioteca IPA das vias canônicas que eram mais significativa para o conjunto de dados, com base em genes dentro do conjunto de dados que foram associados a uma via canônica na Ingenuity Pathways Knowledge Base.

Análise lista de Toxicidade de conjuntos de dados inteiros

identificadas as listas Tox da biblioteca IPA de listas Tox que eram mais significativa para o conjunto de dados. Genes do conjunto de dados que foram associados com uma lista foram considerados para a análise. Para cada uma destas análises, o significado de a associação entre os genes no conjunto de dados e a função biológica atribuído e /ou doença via canonical lista //toxicidade, foi medida pelo teste exacto de Fisher para calcular um valor de p para determinar a probabilidade de que a associação foi explicado apenas pelo acaso.

meu Pathways

é uma representação gráfica das relações biológicas entre produtos de genes, que são apoiados por pelo menos uma referência da literatura, a partir de um livro de texto, ou a partir de informações canônica armazenado no Ingenuity Pathways Knowledge base. Os genes são apresentados através de vários formas que representam a classe funcional do produto do gene, como indicado na legenda dentro dos números específicos.

isolamento de ARN a partir de amostras clínicas

Para a análise quantitativa por RT-PCR, o ARN de tumor combinados e parênquima pulmonar normal foram coletadas a partir de tecidos ressecados. Resumidamente, várias seções de cada tumor foram cortadas, com o primeiro e último de uma série coradas com H E para inspeção por um patologista de pulmão. Depois de confirmar o diagnóstico e avaliação da heterogeneidade do tumor original patologia, que capturou aquelas porções de o tumor ter um mínimo de células cancerígenas de 70%. RNA foi extraído de ambos tecido tumoral microdissecção e do tecido normal associado com o

RNeasy

kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá). No total, a partir de amostras de ARN de parênquima nove tumorais e normais emparelhado foi utilizado para a análise de RT-PCR. Além disso, o ARN foi extraído como descrito anteriormente [19], a partir de seis escovagens brônquicas que representam três corrente e três antigos fumadores, para análise RT-PCR quantitativo.

análise de RT-PCR

Para quantitativa RT-PCR (qPCR), cerca de 1 ug de RNA total foram convertidos em ADNc, utilizando o High-Capacity kit de cDNA Archive (cat # 4322171, Applied Biosystems), e PCR quantitativa foi realizada utilizando TaqMan Universal PCR master Mix e iniciadores TaqMan específicas do gene (cat # 4.326.708; Applied Biosystems), de acordo com a recomendação do fabricante. Beta-actina foi utilizado como um controle endógeno (código de produto iniciador 4352935E). Códigos de iniciadores para genes de teste foram como se segue: ECE2 (Hs00981189_g1), MAGEA9 (Hs00245619_s1), MAGEA11 (Hs00377815_m1), CLDN1 (Hs00221623_m1), CKS1B (Hs01029137_g1), POSTN (Hs00170815_m1), ARTN (Hs00754699_s1), SFRP2 (Hs00293258_m1), UBE2S (Hs00819350_m1), C19orf48 (Hs00364147_m1), FBXO27 (Hs00381091_m1), MCM2 (Hs00170472_m1), NTS (Hs00175048_m1), SLC6A8 (Hs00373917_g1) e SLC2A1 (Hs00197884_m1, Hs00892681_m1). As reacções foram corridas num iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd., Mississauga, ON, Canadá). A expressão diferencial foi determinada usando o método de delta CT-delta. Para os pares do parênquima tumorais /normal, dobre mudanças foram calculados para cada par. Ao comparar os tumores para as escovagens, mudanças de dobragem foram calculados comparando cada tumor com a expressão média das seis amostras BE. O tumor média ao longo de mudança parênquima vezes normal e do tumor média ao longo ser a mudança vezes são relatadas para cada gene.

dosagem Gene determinação

espécimes Carcinoma-in-situ usados ​​para a cópia-número de perfis foram coletado em formalina a 10% tamponada. Microdissecção foi realizada em secções de parafina para obter células cancerosas. Normalmente mais de 20 cortes seriados foram necessárias para produzir material suficiente. O ADN foi isolado a partir de células colhidas por proteinase K, extracção com f enol /clorofórmio como anteriormente descrito [22]. matriz caminho análise CGH genoma inteiro ladrilhos foi realizada utilizando a versão 2 SMRT matriz como descrito anteriormente [23], [24]. Esta plataforma é adequado para perfilar formalina embebido em parafina material fixado [22], [23], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. segmentação genoma e estado do número de cópias foi realizada utilizando aCGH-Smooth em dados de imagem da matriz e visualizada utilizando software SIGMA [31], [32], [33], [34]. elementos da matriz de perda foi atribuído um valor de -1, manteve elementos um valor de 0, e ganhou elementos um valor de 1. Vinte espécimes da CEI foram perfilado no total, e um limite para específicos do gene do número de cópias ganho /perda foi fixado em 20 %. O limiar de 20% foi imposta em um esforço para reduzir a detecção de eventos espúrios ou aleatórias devido ao fundo instabilidade genômica inerente às amostras, e, assim, a seleção para esses eventos que ocorrem com algum grau de regularidade.

microarray Pública comparações de dados

dados de expressão de Microarray para 53 tumores epidermóide com tumor primário foi recuperado do cancro do Dataset Lung no NCBI, GEO número de acesso GSE3141 [35]. dados de expressão de Microarray para 67 escovações brônquicas recuperados a partir de uma população mista de fumantes atuais e antigos, foi perfilado internamente. Todos os dados microarray foi RMA normalizadas [36].

Resultados e Discussão

SAGE oferece uma abordagem imparcial e abrangente para perfil de expressão, limitada apenas pela profundidade de sequenciamento escolhido pelo pesquisador e ofertas uma oportunidade sem precedentes para a descoberta de transcrição. Isto está em nítido contraste com a análise de microarray, onde perfil de expressão eo âmbito de análise é pré-determinado pelo design do alvo tipicamente empregando um número limitado dos genes mais comumente caracterizadas [17]. Em um estudo anterior, descrevemos as transcriptomes de epitélio brônquico danificada pelo fumo e parênquima pulmonar por meio de SAGE [19]. Aqui nós estendemos nossa análise para a área inexplorada de desenvolvimento de câncer de pulmão em estágio inicial, e apresentar o primeiro relatório de grande escala de perfil do carcinoma-in-situ (CIS) do pulmão expressão do gene. Uma compreensão da genética molecular que regem os estágios pré-invasivas é fundamental para facilitar a detecção precoce e intervenção terapêutica imediata antes da progressão para cancro invasivo segue. No estudo atual, apresentamos uma análise comparativa, com ênfase nos genes sobre-expressos em CIS e transcriptomes cancerosas invasoras, em relação ao transcriptomes não-cancerosas do pulmão incluindo epitélio brônquico (BE), e lesões pré-cancerosas (PC: escamosas metaplasia e displasia).

Vinte e sete bibliotecas SAGE pulmão composto de 3,997,729 etiquetas de seqüências totais (~ 40 megabases de sequência de DNA de alta qualidade) foram analisadas neste estudo. do pulmão normal é representado por 14 bibliotecas epiteliais brônquicas (BE-1 através BE-14) [19], [37]. fase pré-cancerosas é representado por duas bibliotecas derivadas de metaplasia escamosa (Met) e displasia escamosas (Dys). carcinoma de células escamosas do pulmão é representado por cinco bibliotecas de carcinoma in-situ (CIS-1 através de cis-5), e seis bibliotecas de carcinoma invasivo (SCC-1 através SCC-6) (detalhado na Tabela 1 e Tabela 2). (Note-se que as amostras que compõem o BE, PC, CIS, e conjuntos de dados SCC eram de uma população mista de fumantes atuais e antigos.) Estes dados identificou mais de 129.000 tags únicas seqüência /transcrições potenciais em lesões da CEI, e quase 140.000 única etiquetas de seqüências /transcrições potenciais em invasivo NSCLC escamosas.

análise das 300 principais marcas mais abundantes em BE, conjuntos de dados CIS e SCC SAGE

a análise de agrupamento.

a análise de agrupamento resultou agrupamento antecipada de bibliotecas SAGE, atestando para provar qualidade. Para esta análise, as 300 marcas mais abundantes foram retidos de cada biblioteca, produzindo uma lista mesclada de 1128 tags únicas. análise média ligação agrupamento com base nos 1128 etiquetas SAGE mais abundantes, revela que todas as bibliotecas de câncer (tanto CIS e SCC invasivo) do cluster juntos e separadamente do BE bibliotecas (Figura 2A). Notamos alguns agrupamento das bibliotecas SCC invasivos (quatro de seis). agrupamento similar é observada quando se usa o top 500 ou superiores 1000 tags únicas per biblioteca (dados não mostrados).

A. A análise de agrupamento de bibliotecas SAGE pulmão. Todas as bibliotecas SAGE deste estudo, incluindo cinco bibliotecas carcinoma in situ (CIS-1 a CIS-5), seis bibliotecas carcinoma de células escamosas invasivos (SCC-1 a SCC-6), uma biblioteca de metaplasia escamosa (Met), e um biblioteca displasia escamosas (Dys), bem como 14 bibliotecas epiteliais brônquicas (BE-1 através BE-14), e duas bibliotecas de parênquima pulmonar SAGE normais (LP-1, PL-2; adesão GSE3708) gerados num estudo anterior [19 ], [37], foram analisados ​​por análise de agrupamento utilizando um algoritmo de ligação média. Os 300 principais tags mais abundantes foram retidos de cada biblioteca e análise foi baseada em 1128 tags únicas no total. No dendrograma, comprimento ramo representa a distância. B-D. IPA análise funcional dos genes mais abundantes nas BE, CIS, e conjuntos de dados cancerosas invasivas. mapeamentos de tag-a-gene para os 300 melhores etiquetas mais abundantes do BE, CIS e conjuntos de dados SCC, foram utilizados para a análise do núcleo IPA, composto de 220, 231 e 233 IPA elegíveis mapeados IDs, respectivamente. Os três conjuntos de dados foram apresentados em conjunto usando comparações centrais do IPA, e as cinco funções mais significativas dentro

Physiological System Development and Function

são mostrados para cada um dos três conjuntos de dados. Os dados na B é classificada de acordo com a mais alta importância na BE, os dados no C é classificada de acordo com maior significado na CEI, e os dados D é classificada de acordo com a mais alta importância na SCC invasivo. A linha laranja indica o limite limiar da significância, predefinir a um valor-p de 0,05. Para uma lista completa das tags /mapeado IDs utilizados para esta análise consulte a Tabela S1.

análise de caminho Ingenuity.

Para caracterizar e comparar os brônquios epiteliais e de cancro transcriptomes, nós computated contagens médias normalizadas tag para BE (14 bibliotecas), da CEI (5 bibliotecas) e SCC invasivo (6 bibliotecas) conjuntos de dados e, posteriormente seleccionadas as mais abundantes 300 tags únicas de cada conjunto de dados para análise (Tabela S1). Etiquetas mapeamento para genes codificados em mitocondriais e genes de proteínas ribossomais, foram encontrados em frequências semelhantes dentro do top 300 marcas mais abundantes, em todos os três conjuntos de dados de BE, CIS e SCC, a ~ 8% e ~18%, respectivamente. Utilizou-se o componente de análise do núcleo de

Ingenuity Pathway Analysis

(IPA) para categorizar esses genes de acordo com as funções biológicas. Apenas as moléculas que têm, pelo menos, uma anotação funcional no IPA Base de Conhecimento qualificar para análise, e incluiu 220 (BE), 231 (CIS), e 233 genes elegíveis (SCC) IPA. Estas análises revelam que os genes dentro da categoria de

Cabelo e Desenvolvimento da pele e função

são altamente expressos no SIA transcriptoma em relação ao tempo, ser e SCC, e genes dentro das categorias de

hematológica Desenvolvimento de Sistemas e função

e

Tráfico de células imunes

são altamente expressa no transcriptoma SCC em relação ao tempo, ser e CIS. Assim, a alta expressão de genes associados com o desenvolvimento epidérmico é identificado aqui como uma característica do transcriptoma CEI, e alta expressão de genes associados com o movimento celular, como uma característica do transcriptoma SCC. Veja a Figura 2B-D para um resumo dessas análises.

Uma característica notável de ambos os CIS e conjuntos de dados SCC é a abundância de mapeamento de tags para a região constante de imunoglobulina pesadas correntes. Na verdade, a marca SAGE para IGHG1 é a tag mais abundante em ambos os CIS e os conjuntos de dados cancerosas invasivas (Tabela S1). expressão Embora seja possível que a expressão destas cadeias de imunoglobulina origina a infiltração de tecido linfóide e envolvente do estroma, estudos anteriores demonstraram de constante da cadeia pesada e regiões variáveis ​​das imunoglobulinas em células epiteliais de cancro da mama [38], [39], [40], e expressão de IgG cadeias pesada e leve em várias células de cancro epiteliais incluindo SCC pulmonar [41]. Estas cadeias de imunoglobulina pode representar auto-anticorpos de células de cancro, e estimular o crescimento de forma autócrina /paracrina [40]. Curiosamente, a abundância de mapeamento de etiquetas de imunoglobulinas pesadas transcritos da cadeia em cis lesões pré-invasivas do pulmão, em contraste com o relativamente baixo de detecção em ambos BE e metaplásico pré-canceroso e lesões displásicas (descrito nos quadros subsequentes), sugere que a sobre-regulação destas transcrições podem ter relevância para o início do NSCLC.

a expressão genética muda comum a carcinoma-in-situ e lesões pré-cancerosas

a transição de um epitélio brônquico saudável para câncer invasivo é pensado para prosseguir via progressão da histológicas e genéticas anormalidades: BE para PC para CIS a SCC, onde PC representa lesões pré-cancerosas (metaplasia escamosa e displasia). metaplasia escamosa é um componente transitória de cicatrização normal do epitélio brônquico, e normalmente resolve um epitélio diferenciado-re composta por células ciliadas e secretoras pseudoestratificado, restaurar a função dos brônquios [42]. (O uso do termo PC aqui não implica uma progressão obrigatória ao câncer, mas sim refere-se a lesões /anormalidades que, apesar de progressão pouco frequente ao câncer, são considerados como precursores de câncer.) Por outro lado, as lesões da CEI demonstrar uma frequência de regressão baixo com uma alta incidência da progressão para cancro invasivo [43], [44] e são caracterizadas por um mais extenso estratificação de tipos de células escamosas em comparação com PC [9], [11], [12]. Ao identificar a expressão do gene muda comum a ambos PC e CIS relação ao BE, vamos nos concentrar nesses eventos genéticos que ocorrem cedo e persistem até a CIS. De acordo com os nossos critérios de selecção (diferença de três vezes mínima em média abundância tag normalizada; média mínima tag abundância normalizada de 40 TPM na sobre-expressão de conjunto de dados), 868 marcas SAGE foram encontrados para ser semelhante diferencialmente expressos em PC e CIS em relação ao BE, que consiste de 190 etiquetas de sobre-regulada, e 678 etiquetas regulada para baixo (Figura 3A).

Critérios de expressão diferencial de genes foi definida como uma diferença de três vezes na contagem de um mínimo de tag médios normalizados, e com um mínima abundância tag média de 40 TPM nos conjuntos de dados-sobre-expressão. Up-setas indicam mudanças de expressão de genes regulados positivamente; down-setas indicam mudanças de expressão de genes regulados negativamente; valores numéricos referem-se ao número de marcadores diferencialmente expressos. Áreas de intercepção refletir as mudanças de expressão de genes em comum entre os dois conjuntos de dados. A. Expressão muda no carcinoma-in-situ e lesões pré-cancerosas em relação ao BE. muda de expressão B. Em conjuntos de dados de câncer em relação a ambos epitélio brônquico e conjuntos de dados pré-cancerosas. BE: epitelial brônquica; PC: pré-câncer; CIS: carcinoma-in-situ; SCC:.. Carcinoma de células escamosas invasivo

Up-regulada mudanças de expressão

Aproximadamente 35% das tags-regulada no CIS em relação ao BE (190 dos 529 marcas) foram Verificou-se que normalmente sobre-regulada em lesões de PC, e cerca de 25% de etiquetas sobre-regulada em lesões PC relativa a ser (190 dos 754 Tag) foram encontrados a ser igualmente regulado para cima em CIS (Figura 3A). Ver Tabela S2 para uma descrição dessas tags-regulada no PC e CIS. análise funcional IPA (com base em 143 elegíveis mapeado IDs) indica que aproximadamente 35% destes geralmente sobre-regulada genes estão associados com o desenvolvimento epidérmico e distúrbios associados, tal como descrito na Tabela 3. Em adição a esses genes descritos na Tabela 3, uma avaliação da literatura identificados outros genes dentro do PC /CIS-regulada conjunto de dados a ser associada com o desenvolvimento epidérmico, incluindo SBSN, CNFN, CRCT1, membros adicionais da família pequena rica em prolina de proteínas (SPRR2E e SPRR3), e membros adicionais a família S100A de proteínas de ligação de cálcio. Muitos destes genes são codificados quer dentro do complexo de diferenciação epidérmica lócus (EDC) em 1q21 [45], [46] ou dentro de um locus de conservada em 19q13 [47], e especificar os componentes do envelope celular cornificado, uma estrutura que proporciona uma barreira proteção a epiderme e epitélio interno em resposta a insultar ou lesão [48], [49].

representação gráfica via IPA dos genes comumente regulados positivamente em CIS e PC em relação ao SER, é apresentada na Figura 4. Considerando as interações moleculares identificados pelo IPA, as associações funcionais entre cadherins desmossômicas e cateninas são proeminentes dentro do PC /conjunto de dados CIS-regulada. Desmossomos são junções de adesão intercelular que fornecem integridade mecânica ao epitélio, e estudos indicam que cadherins desmossômicas modular a diferenciação dos queratinócitos e epidérmica morfogênese [50]. Esta análise também sugere que uma cascata de sinalização mediada por membros da família de proteínas 14-3-3, pode ser activo aqui. 14-3-3 sigma (SFN) medeia diferenciação dos queratinócitos e estratificação da epiderme [51]. O diagrama a via também sugere que aspectos específicos da diferenciação terminal dos queratinócitos pode ser mediada pelo factor de transcrição AP-1 FOSL2, o qual pode ter um papel adicional na remodelação da matriz extracelular. Com efeito, FOSL2 tem sido identificada como um mediador da fibrose pulmonar [52]. Uma consideração de genes associados com o factor de transcrição HIF1A nas lesões PC /CIS, é sugestivo de uma remodelação /resposta fibrótica a condições hipóxicas de crescimento [53], [54], [55]. Com efeito, uma ligação funcional entre a hipóxia e fibrose está documentada na literatura [56], [57], [58]. A expressão de outros genes aqui identificados, tais como NCF1 (a subunidade reguladora da NADPH-oxidase), e o heme catabólico HMOX1 enzima, também é indicativo de uma resposta ao stress relacionadas com o oxigénio e o tecido remodelação /fibrose [59], [60], [ ,,,0],61], [62]. Note-se que uma análise adicional IPA identificou

fibrose hepática /hepática Stellate activação de células

e

14-3-3 mediada sinalização

categorias significativas dentro

Canonical Pathways

e identificada

fibrose hepática

como a categoria mais significativa dentro

Listas de toxicidade

(dados não mostrados).

155 genes (IPA mapeados IDs) são representados de 190 SAGE Tag up -regulated em ambos os CIS e PC em relação ao BE. (Ver Tabela S2 para os dados de tag.) Os produtos de genes são posicionados de acordo com a localização subcelular. Somente conexões diretas (isto é, o contato físico direto entre duas moléculas) entre os produtos de genes individuais são mostrados para clareza de apresentação; linhas indicam interacções de ligação proteína-proteína, e as setas referem-se a “atos em” interacções, tais como proteólise, expressão, e proteína-DNA /RNA interacções. Genes associados ao desenvolvimento epidérmico (ver Tabela 3) são destacados.

análise adicional de Gene Ontology usando o

REUNIR ferramenta

anotação [63], o desenvolvimento epidérmico semelhante identificado como um componente proeminente do transcriptoma de comumente up-regulamentados genes em lesões da CEI e PC, em relação ao BE (Figura S1A, Tabela S3).

mudanças de expressão regulada para baixo.

a maioria das tags de down- regulada em relação CIS a ser, foram encontrados para ser comumente regulados negativamente em lesões de PC (678 marcas fora de 904 tags), e vice-versa (678 marcas em 912 marcas regulada no PC em relação ao BE) (Figura 3A) .