Abstract

Cancro seleccionados (CSC) foram isolados através de um ensaio de neurosphere não aderente de linhas celulares de três glioma : LI, U87 e U373. Utilizando um ensaio clonal, dois clones (D2 e F11) foram seleccionados a partir de esferas derivadas de células LI e foram caracterizados pela: a expressão de marcadores de células estaminais (CD133, nestina, Musashi-1 e Sox2); proliferação; capacidade de diferenciação (determinado pela expressão de GalC, βIII-tubulina e GFAP); Ca

2 + de sinalização e tumorigenicidade em ratinhos nus. Ambos os clones D2 e ​​F11 expressaram níveis mais elevados de todos os marcadores de células estaminais em relação à linha celular parental. Os clones cresceram mais lentamente do que as células LI com um aumento de duas vezes no tempo de duplicação. Os marcadores de diferenciação (βIII-tubulina e GFAP) foram expressos em níveis elevados em ambas as células LI e em neuroesferas. A expressão de nestina, Sox2, e βIII-tubulina foi regulada para baixo em D2 e ​​F11 quando cultivadas em meio contendo soro, ao passo que Musashi-1 foi aumentada. Nesta condição, tempo de duplicação de D2 e ​​F11 aumentada sem chegar a de células LI. D2, F11 e células parentais não expressou Ca dependentes de tensão

2 + -channels mas eles apresentaram maior intracelulares Ca

2 + níveis em resposta ao ATP. Estes Ca

2 + sinais foram maiores nas células LI e em esferas cultivadas em meio contendo soro, enquanto eles eram menores em meio isento de soro. O tratamento de ATP não afectou a proliferação celular. Ambos D2 e ​​F11 induziu o aparecimento de tumores quando ortotopically injectado em ratinhos nus atímicos com uma densidade de 50 vezes mais baixa do que a de células LI. Todos estes dados indicam que ambos os clones possuem características de CSC e partilham as mesmas propriedades stemness. Os resultados sobre a expressão de marcadores de diferenciação e Ca

2 + -channels mostram que ambos os clones são incapazes de chegar a diferenciação terminal. Ambos D2 e ​​F11 pode representar um bom modelo para melhorar o conhecimento sobre a CSC na glioblastoma e para identificar novas abordagens terapêuticas

Citation:. Iacopino F, Angelucci C, Piacentini R, Biamonte F, mangiola A, Maira G, et ai. (2014) Isolamento of Cancer Stem Cells de Três glioblastoma humano Linhas Celulares: Caracterização de dois clones selecionados. PLoS ONE 9 (8): e105166. doi: 10.1371 /journal.pone.0105166

editor: Giovanni Camussi, Universidade de Torino, Itália |

Recebido: 07 de março de 2014; Aceito: 21 de julho de 2014; Publicação: 14 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Iacopino et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho recebeu um apoio do governo francês concedeu ao laboratório CominLabs excelência e gerido pela Agência Nacional de Pesquisa na “Investir para o Futuro” com a referência ANR-10-LabX-07-01. Ele também foi apoiado pelo Hospital Universitário de Rennes (COREC projeto chamado Connexion, 2012-14). Agradecemos também o Conselho Europeu de Investigação para a ERC-2011-ADG – Grant Agreement N ° 290901 – sigla “NEUCOD”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Há evidências crescentes de que os tumores são organizadas hierarquicamente por populações heterogéneas, incluindo uma pequena fração de células-tronco cancerosas (CSC). CSC partilham muitas semelhanças com células-tronco normais, tais como capacidade de auto-renovação e propriedades de diferenciação multilinhagem [1]. Além disso, a CSC são altamente tumorigénicas e pode gerar fenocópias da malignidade primária humano em ratinhos imunocomprometidos [1]. Do ponto de vista clínico, CSC são responsáveis ​​pela manutenção do tumor, sustentação, recorrência e resistência aos tratamentos convencionais [2] – [4].

Uma fração CSC foi isolado em muitos tipos de câncer, incluindo glioma [2 ] – [5], usando várias abordagens [5] – [9]. A maioria CSC glioma foram extraídos de amostras tumorais clínicos [7], [10], [17] enquanto que apenas alguns foram derivados de linhas celulares estabelecidas: as células de rato C6 e linhas de células de glioma maligno humano (U373, A172, U87 e SU3 ) têm sido usadas [9], [17] – [23], [24]. Alguns autores não recomendam a linhas de células como uma fonte de CSC porque elas crescem no meio contendo soro, o que dá origem a células que diferem geneticamente e biologicamente daqueles dos tumores primários a partir do qual eles foram derivados [25]. No entanto, as linhas de células de cancro têm algumas vantagens em relação ao tecido tumoral. Com efeito, eles não apresentam quaisquer células estaminais normais contaminantes, pode ser considerada uma amostra homogénea e é fácil de obter grandes quantidades de eles [21]. Portanto, a identificação e caracterização de CSC a partir de linhas celulares estabelecidas, podem proporcionar ferramentas importantes para explorar a biologia de CSC [26]. Não existe um único marcador tem sido mostrado para ser suficiente para conferir propriedades de células-tronco-like, portanto, uma combinação de diferentes marcadores é utilizada para identificar e isolar CSC no glioma, incluindo nestina, Sox2 (relacionadas com SRY gene de HMG-box 2) e Musashi -1 (MSI-1). Estas moléculas são expressos em níveis elevados em células estaminais neuronais e são frequentemente consideradas uma característica marcante do estado indiferenciado [27] – [30]

Quando exposto a soro fetal bovino, CSC diferenciar-se a linhagem do pais. tumor [6], [9], [12], [16] – [23]. Portanto, CSC derivado de gliomas preferencialmente diferenciam para astrócitos, mas a diferenciação multilinhagens pode ocasionalmente ser observado com linhagens neuronais, e algumas células anormais com fenótipos mistos. Deve notar-se que estas linhagens são caracterizados com base nos marcadores moleculares, tais como a GFAP astrocítica marcador, o GalC marcador oligodendrocíticos, e o marcador neuronal (βIII-tubulina) [7], [9], [16] – [ ,,,0],23], [25], em vez de sobre os parâmetros funcionais. Por exemplo, o teste crucial para identificar um neurónio deve ser o de avaliar a sua capacidade de gerar potenciais de acção [31], [32], mas este teste não é normalmente realizada. Além disso, o importante papel do Ca

2 + sinais no desenvolvimento de glioblastoma (GBM) foi recentemente revista [33].

Alguns resultados interessantes foram obtidos utilizando CSC derivado de linhas celulares estabelecidas a respeito propriedades invasivas, chemoresistance, a seleção da droga, a apoptose, proliferação, respostas imunes, e expressão gênica [34] – [39].

neste estudo, descobrimos que U87, linhas celulares U373 e Li contêm uma fração As células que podem formar esferas de tumor quando cultivadas em meio de células estaminais neurais isento de soro. As células de tumor a partir de esferas de possuir a capacidade de auto-renovação e formação de esferas secundárias.

é bem conhecido que no GBM existe uma variabilidade e heterogeneidade histológica [40], [41] que resulta no isolamento de distinto subpopulações CSC que mantêm o fenótipo do tumor primário e do genótipo, como foi recentemente descrito [19], [25]. Os nossos resultados mostram claramente que todas as linhas de células de glioma humanas que contêm estudados CSC. Além disso, dois clones selecionados a partir da linha de células LI foram caracterizados por: expressão de marcadores stemness, proliferação, capacidade de diferenciação, presença de Ca

2 + canais e Ca

2 + sinais dependentes de ATP, e voltagem- tumorigenicidade após o transplante ortotópico. Para nosso conhecimento, não existem dados disponíveis na literatura sobre a presença de CSC nesta linha de células LI. Estes dois clones podem representar modelos úteis para futuros estudos sobre gliomas malignos, com o objectivo de encontrar novas abordagens terapêuticas.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

Cultura de linhas celulares de glioma .

a linha de células humanas U373 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, EUA), astrocitoma grau III /glioblastoma, foi gentilmente cedido pelo Professor Pierluigi Navarra, Instituto de Farmacologia da Universidade Católica do Sagrado coração, em Roma.

A linha de células humanas U87 (ATCC, EUA), astrocitoma grau III /glioblastoma, foi gentilmente cedido pelo Dr. Emilio Ciusani, Instituto Nacional de Neurologia “Carlo Besta”, Milan [42].

A linha celular humana LI, astrocitoma grau IV, foi gentilmente doados pelo Professor Gabriella Zupi, Regina Elena Instituto, Roma [43], [44].

As três linhas de células (linhas de células parental ) foram cultivadas em Dulbecco meio de Eagle modificado /de Ham F-12 (DMEM /F12) (Gibco, Carlsbad, CA) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS, Euroclone, Milão, Itália), antibióticos (penicilina /estreptomicina 100 UI /ml /100 M /ml, Euroclone), 4-2-hidroxietil-1-piperazinil-etanossulfónico (10 mM, Euroclone), glutamina (2 mM, Euroclone) e glucose (0,3% w /v, Sigma-Aldrich, St Louis , MO, EUA), a seguir denominado: meio padrão. As células que crescem em monocamada, foram sub-cultivadas até à confluência, e mantida a 37 ° C em ar atmosfera humidificada: CO

2. (95%: 5%)

Neurosphere (NS) cultura

Todas as crescentes linhas celulares em monocamada, U373 (22-25

th passagem), U87-MG (52-55

th passagem) e LI (93-95

th passagem) foram semeadas a uma densidade de 100.000 células /mL, num meio isento de soro definido, DMEM /F12, suplementado com antibióticos (penicilina 100 IU /ml, estreptomicina 100 um /ml), tampão HEPES (10 mM), glutamina (2 mM), de glucose (0,3% w /v), o factor recombinante de crescimento epidérmico humano (rhEGF) (20 ng /ml, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 20 ng /ml, R D Systems) e suplemento N-2 Plus Media (R D Systems) (Neural Stem Médio celular, adiante denominado: NSCM). O meio foi mudado a cada 2 dias. Esferas foram divididas por dissociação mecânica quando atingiram um tamanho de 100-200 células.

diluição limitante /Tumor Sphere Análise de Iniciação

A diluição limitante /Tumor Sphere Análise de Iniciação foi realizado para quantificar, em as três linhas parentais, a frequência de células tumorais Esferas de iniciação (TS-ICs) de acordo com o método descrito por Yu et al. Um [22]. A percentagem de TS-ICs e significância estatística foram determinadas usando a L-CALC (Stemsoft, Vancouver, Canadá), um programa de software gratuito https://www.stemcell.com/Default.aspx.

Individual análise de formação de colónias

mecanicamente células dissociadas foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade teórica de 0,5 células por poço em NSCM. Após cultura durante a noite, a observação microscópica foi utilizado para identificar poços que continham uma única célula. A formação de colónias foi marcado 15-20 dias após a semeadura inicial. A percentagem de células que formaram esferas foi determinada pela seguinte fórmula: em que x (n) é o número de poços em que uma única célula estava presente e Y (n) é o número de poços em que um NS desenvolvido a partir de uma única célula . Os poços contendo quer nenhum ou mais do que uma célula foram excluídas da análise.

ensaio de diferenciação de esferas derivadas de uma célula mãe

esferas Glioma derivado de uma célula mãe no ensaio de formação de subsphere eram desagregada mecanicamente em células individuais, que foram semeadas em permissivas para a diferenciação de meio padrão (sem factores de crescimento e suplementadas com 10% de FBS) em 1-45 dias. Em seguida, as células foram analisadas em diferentes pontos de tempo

Anticorpos

Para avaliar a expressão de marcadores de diferenciação e stemness, foram utilizados os seguintes anticorpos:. Anti-CD133 (AC133 clone conjugado com PE) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha); anti-nestina (Chemicon, Tamecula, CA, EUA); anti-Sox2 monoclonal, (R amp; D System, MAB2018); anti-Musashi-1 (anticorpo monoclonal, R amp; D System, MAB2628); anti-galactocerebrósido (GalC, IgG3 monoclonal, Millipore Corp., Bedford, MA, EUA); anti-Glial fibrilar ácida proteína (GFAP, monoclonal, IgG3, Millipore), anti-Neuronal Classe IIIβ-Tubulin (monoclonal IgG2a, TUJ1 Clone, Covance Research Group Inc.).

A citometria de fluxo

Para avaliar a expressão de CD133 por citometria de fluxo, as células foram dissociadas mecanicamente, lavadas duas vezes em uma solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), e depois incubadas com anti -CD133 /1 (AC133) -PE anticorpo (Miltenyi Biotec, Alemanha) 01:20 durante 30 min. a 4 ° C no escuro. As células foram lavadas, e suspensas em PBS para análise. Eles foram então analisadas por citometria de fluxo em um máquina Sistema APC-96 (goiaba Technologies, Hayward, CA, EUA).

A linha celular Caco-2, uma linha contínua de um adenocarcinoma colorretal humano epitelial heterogénea, foi utilizado como controlo positivo.

a imunocitoquímica

cryosectioning de NS.

NS inteiros foram colhidos a partir de frascos de cultura, lavaram-se com PBS para remover o excesso de meio de cultura, e fixa em 4%

paraformaldeído (PFA) durante 10 min. à temperatura ambiente. NS foram então colocados em A /20% de sacarose PBS durante a noite a 4 ° C. Eles foram, em seguida, montado em OCT composto (temperatura de corte óptico) (Sakura, Tissue Tek; Torrance, CA), seguindo-se o congelamento a -80 ° C. Fatias de 10 m foram obtidos em um criostato, e colocadas em lâminas ( “Super Geada Plus”, Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemanha).

As células que crescem em monocamada foram semeadas em lâminas “Super Geada Plus” e , em diferentes tempos de cultura, que foram fixadas em 4% de PFA durante 10 minutos. A seguir à lavagem com PBS, as lâminas foram mantidas a -80 ° C até serem processadas.

Para a análise imunocitoquímica, após re-hidratação com PBS, o mesmo procedimento foi seguido para criocortes e lamelas. Os cortes foram cobertos com solução de bloqueio (Super bloco, UCS Diagnostics, Roma, Italia) durante 8 minutos. ou com 0,3% (v /v) de Triton X-100, 1% (w /v) de BSA e 10% (v /v) “soro de burro normal” em PBS durante 1 hora. Subsequentemente, elas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos primários (diluído em solução de bloqueio): anti-nestina (1:200); anti-Sox2 (01:50); anti-MSI-1 (1:200); anti-GalC (1:100); anti-GFAP (1:500); anti-βIII-tubulina (1:200). Após lavagem com tampão de solução salina, fatias foram incubadas com o conjugado de polímero HRP (SuperPicture Polímero kit de detecção, Zymed, San Francisco, CA, EUA), e depois de um passo de lavagem, 3,3′-diaminobenzidina (Vector, Burlingame, CA, EUA ) foi utilizado como o cromogénio. Os núcleos foram contrastadas com hematoxilina de Harri. Os controlos negativos foram realizados por omitindo o anticorpo primário.

análise de Western-blot

Células de ambas as culturas em monocamada e NS, depois de 0-45 dias de cultura, foram coletadas em um tampão de lise (150 mM de NaCl, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de Triton X-100, 0,5 mM de EDTA, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6), contendo mistura de inibidores de protease (Sigma-Aldrich), e 17,4 ug /ml fluoreto de fenilmetilsulfonilo (Sigma-Aldrich). Os extractos de proteína foram quantificados por Bradford Protein Assay. Para análise de Western-blot, 50 ug de proteínas totais foram resolvidos em desnaturante géis de poliacrilamida (SDS-PAGE): 10% (MSI-1, βIII-tubulina) e 8% (Nestina), e transferido para difluoreto de polivinilideno (PVDF; Immobilon P , Millipore, EUA) por electrotransferência membrana. As membranas foram bloqueadas com PBS-T (solução salina de tampão PBS com 0,1% de Tween-20) contendo 5% de BSA e depois incubadas durante a noite com anticorpos primários. Após lavagem por 3 × 5 min., As membranas foram sondadas 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário (conjugado de peroxidase anti-IgG de rato, Sigma, 1:10,000). A revelação foi feita por quimioluminescência

Os sinais foram quantificados por varrimento de densitometria (sistema de documentação ChemiDoc /software quantificação QuantityOne; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA)..

confocal Ca

2 + imagem

confocal Ca

2 + imagiologia foi realizada como descrito anteriormente [32]. Resumidamente, as células semeadas em lamelas de vidro foram incubadas durante 30 min. a 37 ° C com o Ca

2 + sensíveis ao corante fluorescente Fluo-4 AM (2,5 mM, Invitrogen, San Giuliano Milanese, Itália) em solução de Tyrode contendo: NaCl 150 mM, KCl a 4 mM, MgCl 2 mM de

2, glicose 10 mM, HEPES a 10 mM, e CaCl 2 mM de

2. O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH. As células carregadas com corante foram lavadas e mantidas em lamelas durante 30 min. à temperatura ambiente (23-25 ​​° C) em solução de Tyrode fresco para permitir completa corante de-esterif icação. As lamelas foram então transferidas para uma câmara de perfusão colocada sobre a platina de um microscópio invertido (DM IRE2; Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) ligado a um sistema de varrimento a laser confocal (TCS-SP2; Leica). células de Fluo-4-carregadas foram animado com a linha 488 nm de um laser de Ar /ARKR, e o sinal de emissão foi recolhido por um fotomultiplicador dentro de uma janela compreendida entre 500 e 535 nm. Intracelular de Ca

2+ transientes foram estimuladas pela exposição da célula para o ATP (50 fiM) ou a despolarização da membrana (obtido por células a uma solução modificada de Tyrode contendo KCl a 100 mM, expondo). Intracelular de Ca

2+ transientes induzidas por estes estímulos foram adquiridos a 0,5 Hz e sua amplitude foi medida em termos da relação Af /F, isto é, em que F

max representa a fluorescência registados no pico de Ca

2+ transientes calculados sobre toda a medida registrada (com duração de 60 s) em uma região de interesse traçada em torno de cada corpo celular; F

pre é a intensidade média de fluorescência medido durante o período de pré-estímulo (20 s); e F

bgnd é a fluorescência de fundo medido em uma área do campo falta estruturas cheias de corantes. Em um subconjunto de experiências com vista a avaliar a contribuição de extra-vs. intracelular Ca

2 + Ca intracelular para o medido

2+ transientes, duas estimulações consecutivas de ATP foram realizadas em células em diferenciação dia 5. O primeiro pedido de ATP foi realizada em solução de Tyrode normais. Após 5 min., A aplicação ATP foi repetida em uma solução de Tyrode modificada, na qual Ca

2 + foi removido (ou seja, praticamente Ca

2 + livre de solução). Antes de testar os efeitos do Ca

2 + remoção de Ca induzida por ATP

2 + transientes, a estabilidade do Ca

2 + respostas a duas estimulações ATP consecutivos repetidos em 5 min. intervalo foi avaliada: diferenças menores do que 5% foram encontrados

ensaio de proliferação

LI células foram semeadas em placas com múltiplas cavidades, em meio padrão enquanto os clones NS foram semeadas em NSCM (25.000 células por poço).. As contagens de células foram determinados nos dias 2, 4, 6, 8 e 10 após a semeadura utilizando um contador de células automático (NucleoCounter, ChemoMetec A /S, Allerød, Dinamarca). O meio foi trocado a cada 2 dias.

A curva de crescimento foi gerado de forma que coordenada horizontal datum definido dias e ordenada datum densidades celulares definidos verticais. Celular dobrando vezes durante logarítmica de crescimento foram calculadas de acordo com a fórmula de Hayflick: (T = população tempo de duplicação; t = tempo determinado após a subcultura; N

t = número de células no tempo determinado; N

0 = número de células no início de subcultura).

Um conjunto de experiências de crescimento de células foi realizada para testar o efeito de ATP na proliferação celular. As células (LI, D2, F11, e D2 e ​​F11 recolhidos após 1 dia e 5 dias sob meio de diferenciação) foram semeadas a uma densidade de 50000 células /poço em 1 ml de meio de cultura para placas de 24 poços e tratadas com ATP As concentrações de 0 a 100 ug /ml para 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 7 dias. As contagens celulares foram realizadas com um citómetro. As experiências foram realizadas em triplicado.

In vivo

análise da tumorigenicidade

Ética Declaração.

Todos os animais utilizados foram experimentados em estrita conformidade com a orientações animal Care institucional e Comitê de Uso em vigor na Universidade Católica do Sagrado coração e todo esforço foi feito para minimizar o sofrimento. O trabalho foi realizado sob a autoridade do Comité de Ética Animal, “A. Gemelli “, Faculdade de Medicina da Universidade Católica do Sagrado Coração, Roma, Itália (licença projecto aprovado: prot.pdc.CESA /A /42/2011).

camundongos atímicos (nu /nu; 6 -8 semanas de idade; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EUA) foram anestesiados com IP cetamina e xilazina, e estereotaxicamente implantados com qualquer isolado D2, as células F11 (10.000 ou 1.000 por rato) ou células Li (500.000 ou 10.000 por rato) em 3 mL de PBS no estriado direito. Um grupo de controlo recebeu apenas veículo (PBS). Os camundongos implantados, 4 animais por grupo, foram pesados ​​uma vez por semana, monitorados duas vezes por semana e foram mortos quando eles desenvolveram sintomas neurológicos (ataxia /falta de coordenação /impressionante /desequilibrada). Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical, sob anestesia profunda. secções do cérebro foram analisados ​​quanto à presença de tumores, como descrito abaixo.

hematoxilina-eosina e coloração imuno-histoquímica de secções de cérebro

Os cérebros ratinhos implantados com células do tumor foram fixadas com paraformaldeído a 4% e cortadas com um micrótomo em seções de coral. Para a coloração hematoxilina-eosina, seções do cérebro foram montadas em lâminas coradas com hematoxilina de Harri por 2 min. primeiro, e depois contra-coradas com eosina alcoólica. Para caracterizar o tecido cerebral por imuno-histoquímica, as secções foram coradas com os anticorpos primários para anti-nestina-humano específico (1:200), anti-βIII-tubulina (1:200), e anti-GFAP (1:500), seguindo o mesmo procedimento descrito acima.

a análise estatística

Todos os valores nas figuras e textos são apresentados como médias ± DP. Diferenças significativas entre as médias foram avaliadas pelo teste t de Student ou ANOVA one-way. A frente e verso p 0,05 foi aceito como significante

Resultados

Isolamento de CSC por neurosphere (NS) a formação de ensaio

De acordo com as condições de cultivo para NSCM, esferas assemelhando-se. NS típicas formadas rapidamente no topo de monocamadas de todas as linhas celulares (Figura 1A). Cerca de 3 dias depois, U87 e linhas de células LI cresceu inteiramente esfericamente (10-20 células) sem células unidas (NS primária), enquanto algumas células aderentes persistiu na linha de células U87. Após 1-2 semanas de cultura, a formação de esferas de tumor foi detectada e fotografada sob um microscópio invertido. As esferas podem ser propagados e continuamente cultivadas sob uma forma de livre flutuação (Figura 1A). Portanto, todas as linhas de células formadas esferas auto-renovável em cultura

(A):. Superior, linhas celulares parentais (LI, U87 e U373), células cultivadas em meio padrão sua adicionada de soro a 10%. Oriente, formação de neuroesferas na parte superior das monocamadas de linha celular U373. As imagens foram tiradas depois de 1, 2 e 3 dias em meio neurosphere. Bottom, imagens de NS primárias geradas por LI, U87 e U373 células por dia 8. (B) Clones derivados de LI (D2 e F11) e U87 (C7 e E8) NS primários. ampliação original de 200 × ou 400 ×. Barra de escala = 100 pm.

diluição limitante /Esferas tumor Iniciação (TS-CI) Análise

Para determinar a capacidade de as três linhas de células para formar NS, um TS-IC A análise foi realizada. A frequência de TS-ICs foi de 1,56% para as células U373 (uma célula a cada 64 demonstraram a capacidade para formar NS primário), 1,45%, para as células U87-MG (uma célula a cada 69 demonstraram a capacidade para formar NS primário), e 2,74% para células LI (uma célula a cada 36 exibiram a capacidade para formar NS primária).

formação de colónia única análise

para avaliar a capacidade de auto-renovação de NS primários, um ensaio clonogénico foi realizada. A eficiência de formação de colónias foi de 9,5%, 10,5% e 33,3% para o derivado de NS U373, U87 e IL, respectivamente.

clones em crescimento foram seleccionados, desagregados, e mantidas ao longo de muitos subculturas. Dois clones (D2 e F11) foram obtidos a partir de NS primários derivados de LI e dois (C7 e E8) a partir de U87 que se formaram esferas auto-renovável em cultura (Figura 1B). Nenhum dos clones derivados de U373 foi capaz de persistir em cultura, mesmo quando um meio diferente foi empregue. A morfologia dos clones foi variável. F11, C7 e E8 cresceu totalmente esférico, enquanto D2 tendiam a formar os dois agregados esféricos ou alongados (Figura 1B).

A expressão de marcadores de células estaminais e marcadores de linhagem específica

CD133, nestina, Sox2 e MSI-1 foram avaliados para avaliar a natureza estaminal de clones selecionados. Usando imunocitoquímica, 50% das células LI e 100% do U87 foram nestina-positivas e a coloração estava localizada no nível citoplasmático. Em ambos D2 e ​​clones F11 derivados de NS primárias de células Li, foi observado um aumento na expressão do marcador com células-tronco. Mais de 80% das células a partir de ambos os clones foram positivas para nestina. Nenhum aumento na coloração nestina foi observada em ambos os clones derivados a partir de células U87 com relação à linha celular parental (Figura 2).

As inserções referem-se a controlos negativos. Ampliação original x 400. Barra de escala = 100 mm.

Com base nesta evidência e aspecto morfológico, experimentos subsequentes foram realizados apenas em clones D2 e ​​F11 com o objectivo de verificar se as diferenças observadas poderia corresponder a diferenças nos comportamento.

Analisando expressão CD133 por citometria de fluxo, verificou-0,04, 0,13, e 1,44% de células positivas em CD133 LI, D2, e células F11, respectivamente (Figura 3A). Estes valores persistiu após vários ciclos de criopreservação. Usando imunocitoquímica, verificou-se que 30% de células LI presentes em pequenos grupos na cultura em monocamada foram positivos para Sox-2 que foi tipicamente localizadas nos núcleos; finalmente, 100% de células LI mostrou fraca MSI-1 coloração citoplasmática (Figura 3B). Em ambos os clones D2 e ​​F11, foi observado um aumento de expressão do marcador com células-tronco. Oitenta por cento das células de ambos os clones foram positivas para nestina e 100% para Sox-2. Uma expressão forte de MSI-1 foi detectada em 100% de células (Figura 3B). nestina expressão em ambos os clones foi confirmada por análise de Western blot. Figura 4C refere-se a dados obtidos no clone F11

A:. Citometria de fluxo para medir a expressão de CD133 de células derivadas de culturas em monocamada LI e D2 e ​​clones F11. CaCo

2 células são controlo positivo. expressão CD133 foi avaliada em ambos os clones a 5

th passagem (5

THP) e 16

th passagem (16

THP). B: Os dados de uma experiência representativa de coloração imunocitoquímico de MSI-1 e Sox2 expressão em LI, D2 e ​​células F11. As inserções referem-se a controlos negativos. Ampliação original x 400. Barra de escala = 100 mm

A:. coloração imunocitoquímica para nestina, MSI-1, Sox2 e expressão βIII-Tubulin em D2 e ​​células F11 cultivadas em meio neurosphere (sem soro) ou em meio de diferenciação ( presença de soro) durante 5-45 dias. Ampliação original x 400. Barra de escala = 100 pm. B: Algumas células positivas βIII-tubulina que exibem uma morfologia típica neuronal-like. Ampliação original x 630. Barra de escala = 50 mm. C: análise de Western blot de Nestin, MSI-1 e expressão βIII-Tubulin em células F11 cultivadas em diferentes épocas em meio de diferenciação. os níveis de proteínas foram analisados ​​por análise de imunotransferência e foram quantificadas por densitometria e normalizado em relação aos níveis β-actina como um controlo de carga. Os valores são a média ± desvio padrão de experiências independentes árvore. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de células D2. Immunoblottings de experiências representativas são mostrados. * P 0,05 Student

t

-test vs. linhas celulares parentais, * p . 0,01 vs. células F11

Spheres foram cultivadas sob condições de diferenciação para diferentes tempos e foram analisados para a expressão de marcadores de células estaminais e marcadores de linhagem específica. Após incubação durante a noite em meio de diferenciação, as células de neuroesferas foram aderente à placa de cultura e crescimento em monocamada. A expressão de específico de neurónios βIII-tubulina, GFAP, e GalC foi avaliada por imunocitoquímica. Ambos βIII-tubulina e GFAP foram altamente expresso na linha celular parental e em ambos os clones, enquanto não foi expressa GalC (dados não mostrados). Após a condições de diferenciação, a expressão de específico de neurónios βIII-tubulina diminuiu (Figura 4A), ao mesmo tempo que de GFAP não se alterou de forma significativa (dados não mostrados). Notavelmente, algumas das células que expressam βIII-tubulina tinha uma morfologia neurônio-like (Figura 4B), enquanto outros eram células multinucleadas.

A diminuição na expressão βIII-Tubulin também foi avaliada por análise western blot, tanto D2 ( dados não mostrados) e F11 (Figura 4C). Os clones

D2 e ​​clones F11 uma diminuição tanto nestina e Sox-2 imunopositividade até níveis indetectáveis ​​foi observada após mais duradouro cultura de células NS em meio de diferenciação (Figura 4A ). A redução impressionante dos níveis de nestina foi ainda confirmada por análise de Western blot (Figura 4C refere-se a dados obtidos no clone F11). Nenhuma aparentemente variações na expressão MSI-1, analisados ​​por imunocitoquímica, foi observada, mas a sua localização mudou entre núcleo e no citoplasma, dependendo do tempo de permanência em meio contendo soro (Figura 4A). A análise de transferência de Western demonstrou que as células LI e ambos os clones exibiram uma expressão semelhante de MSI-1, enquanto que as células de ambos os clones sob diferenciação mostrou um nível mais elevado da proteína. Dados Figura 4 mostra obtidas no clone F11.

confocal Ca

2 + imagem

Nas células indiferenciadas (referidas como o dia-0 time-point) Ca, estimulação KCl produzida

2+ transientes em menos de 10% do total de células (

n = 9

de 127), e a amplitude média dessas transientes foi de 0,36 ± 0,02. A baixa capacidade de resposta a estímulos despolarizantes foi também observada em células de diferenciação. De fato, a percentagem de células que respondem à estimulação com KCl Ca

2+ transientes foi menor do que 10% no dia-5, 15-dia e dia-30 também, com amplitudes médias de 0,75 ± 0,25 [

N

= 7 out of 287], 0,42 ± 0,07 [

n

= 10 de 418] e 0,34 ± 0,02 [

n

= 7 out of 418], respectivamente. Estes resultados indicam que LI-derivados de células estaminais humanas, quer indiferenciados ou em diferentes estágios de diferenciação, não apresentam Ca voltagem-

canais funcionais 2+. No entanto, quando estas preparações de células foram expostas a 50? M de ATP, claramente detectável intracelular de Ca

2+ foram observados transientes. Em células indiferenciadas (dia 0), o ATP produzido Ca

2+ sinais em 16,1 ± 9,8% do total de células (39 em 127) com uma amplitude média de 0,79 ± 0,10. Após um dia de cultura no meio de diferenciação, a percentagem de células que respondem aumentou para 89,2 ± 7,2% (

n =

115 de 132) e a amplitude média de transientes foi semelhante aumentada (1,49 ± 1,13). No dia 5, nenhum aumento adicional da percentagem de células que respondem foi observada (86,3 ± 3,5%;

N

= 430 dos 492), mas a amplitude do transiente atingiu um valor máximo de 2,69 ± 0,07. Não ocorreram alterações significativas no Ca

2 + amplitudes de sinal foram observados durante os dias seguintes de diferenciação até 30 dias: os valores Af /F sendo 2,48 ± 0,07 no dia-15 (77,8 ± 7,1% de células de responder;

n

= 334) e 2,55 ± 0,11 no dia-30 (80,5 ± 5,1% de células de responder;

n

= 306).