Abstract

Fundo

O cancro do pulmão é a principal causa de morte entre as doenças malignas em todo o mundo. Conhecimento da sua biologia é, portanto, de importância fundamental para melhorar o prognóstico do paciente. Em contraste com os tecidos não-neoplásicas, as células cancerosas utilizar a glicose principalmente para a produção de módulos básicos celulares ‘(isto é, nucleótidos, aminoácidos, ácidos gordos). No cancro, málico enzima (ME) e ATP-citrato-liase (ACLY) são enzimas que ligam síntese glicólise aeróbica e de ácido gordo e podem ser, por conseguinte, de significado biológico e prognóstico no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).

material e Métodos

ME e expressão ACLY foi analisada em 258 NSCLC em correlação com os parâmetros clínico-patológicas, incluindo a sobrevivência do paciente.

resultados

no entanto, a expressão global de ambos enzimas relacionadas positivamente, ACLY foi associada com o estágio do tumor local, enquanto ME correlacionada com a ocorrência de metástases em linfonodos do mediastino. pacientes jovens superexpressão ACLY e /ou ME tiveram uma sobrevida significativamente mais longa em geral. Isto provou ser um fator prognóstico independente. Isto contrasta pacientes com NSCLC velhos, nos quais superexpressão de ACLY e /ou ME parece prever o oposto.

Conclusão

Em NSCLC, ME e ACLY mostrar expressões diferentes de enzimas relacionadas com a disseminação local e do mediastino . Mais importante, nós detectamos um impacto prognóstico inverso da ACLY e /ou ME superexpressão em pacientes jovens e idosos. Portanto, pode-se esperar, que o tratamento do NSCLC especialmente, se alvo vias metabólicas, requer estratégias diferentes em diferentes grupos etários

Citation:. Csanadi A, Kayser C, Donauer M, Gumpp V, Aumann K, J Rawluk , et ai. (2015) Valor prognóstico de Malic enzima e ATP-citrato liase em Non-Small Cell Lung Cancer do jovens e os idosos. PLoS ONE 10 (5): e0126357. doi: 10.1371 /journal.pone.0126357

Editor do Academic: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recebido: 26 de dezembro de 2014; Aceito: 01 de abril de 2015; Publicado: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Csanadi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis no papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. os autores agradecem o apoio deste estudo pela Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao tumor maligno em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços tremendos em terapias médicas, o prognóstico de pacientes com câncer de pulmão permanece pobre, com uma taxa de sobrevida de 5 anos que varia entre 7,9% e 16,5% [1, 2].

Ao mostrar que os pacientes se beneficiam de diferentes regimes de quimioterapia dependente no subtipo histológico, Scagliottti aboliu o dogma para tratar o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) como um grupo oncologicamente homogénea [3]. Assim, os principais subgrupos NSCLC, adenocarcinoma (ALC), carcinoma de células escamosas (SCC) e carcinoma de grandes células (LCC) não só mostram diferentes padrões histológicos, mas apresentam características biológicas e moleculares específicos também. A melhor visão sobre estas características distintas ajudará a direcionar terapias personalizadas. Neste contexto, as alterações metabólicas associadas com a transformação celular maligna são de uma importância crucial.

Durante décadas, sabe-se que os tumores malignos produzir lactato excessiva, mesmo na presença de oxigénio suficiente (efeito Warburg) [4]. No entanto, os mecanismos por trás deste fenômeno não são totalmente compreendidos. As células malignas funcionar com autonomia metabólica, e a glucose, os seus metabolitos, bem como glutamina são não apenas as fontes de energia. Eles também servem como unidades básicas de construção através da geração de moléculas-chave necessários para o crescimento tumoral celular e, assim, maligna [5, 6].

Como enzimas do metabolismo da glicose representam um ponto de extremidade de jusante comum para várias mutações motorista tumor, eles poderiam ser alvos promissores para novos agentes quimioterapêuticos, muito [7]. Entre estas enzimas, liase ATP-citrato (ACLY) e enzima málico (ME) são dois jogadores-chave: ME serve como fonte de equivalentes redutores em células malignas altamente cataplerotic. ACLY constrói uma derivação fisiológica entre o metabolismo da glucose e a síntese de ácidos gordos [6].

Por isso, analisaram os padrões de expressão destes dois enzimas para elucidar a sua associação com características clínico-patológicos e o seu impacto na sobrevivência biológica do paciente em NSCLC . Nossos resultados mostram claramente que as alterações metabólicas funcionais em NSCLC são complexas, diferem em subtipos histológicos e prever diferentes resultados, dependendo da idade do paciente.

declaração Materiais e Métodos

Ética

A estudo foi aprovado pelo Centro Médico da Universidade de Freiburg (University comissão de Ética médica Centro de Freiburg, EK 10/12). dados relacionados paciente tem sido apresentados sob pseudónimo e os resultados obtidos por este estudo não influenciou o tratamento do paciente. material arquivado tinha sido usado pelo menos três anos após o diagnóstico inicial. Ao assinar o contrato de tratamento com o Centro Médico da Universidade de Freiburg, cada paciente concorda que sua /seu tecido (s) sob pseudónimo pode ser suspeito para ensaios de investigação retrospectiva não interferir ou influenciar as opções de tratamento atuais. O comitê de ética do Centro Médico da Universidade de Freiburg, assim, aprovado que nenhum consentimento específico estudo individual de cada paciente teve de ser obtida.

Cohort

258 pacientes que sofrem de NSCLC foram incluídos neste estudo. Os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico entre 1990 e 2007 (Departamento de Cirurgia Torácica, Centro Médico da Universidade de Freiburg; S1 Dataset) e não receberam a terapia neoadjuvante. Fixação, bilheteria e inclusão em parafina foram realizados de acordo com protocolos de rotina. Todos os casos de câncer foram reclassificados de acordo com a classificação atual da OMS [8], o estadiamento foi reavaliado em concordância com a mais recente classificação UICC [9]. Absorvente de multi matrizes (TMA) foram construídos com um diâmetro do núcleo de 2 mm. De todas as amostras três TMA-núcleos foram tomadas a partir de diferentes sites para evitar viés de heterogeneidade intratumoral. A TMA de 36 correspondentes tecidos pulmonares não neoplásicas serviram como conjunto de controle. (S1 Table: resumo de dados clínico-patológico)

A imuno-histoquímica e pontuação

recuperação antigênica induzida por calor foi realizada a pH 9.0 para ACLY e em pH 6,0 para mim.. tempo de incubação do anticorpo primário foi de 30 minutos (ACLY: 1: 400, Cell Signaling Technologies 4331S; ME: diluição 1: 2000, Clone 3H5, Abnova Biozol). A visualização foi realizada pela fosfatase alcalina com Fast-tipo Red cromogénio (DAKO REAIS K5005) e peroxidase de rábano com cromógeno diaminobenzidina base (DAKO EnVision FLEX) para mim e ACLY, respectivamente. contracoloração nuclear foi realizada com hematoxilina (haemalaun ácida de Mayer, Waldeck, catálogo n °. 1A-552). A plataforma Autostainer Dako foi utilizado para procedimentos de coloração.

Para ambas as manchas de imuno-histoquímica, ACLY e ME, protocolos foram validados para a coloração específica pela omissão dos anticorpos primários. Esses procedimentos de validação não mostraram reações inespecíficas cromogénio.

Expressão

A enzima foi considerado positivo, se foi detectada coloração citoplasmática específica. Para ACLY, positividade nuclear específica foi também avaliada. pontuação imunohistoquímica seguidos protocolos previamente descritos [10, 11] e foi avaliada em analogia ao aceites internacionalmente pontuação de marcadores preditivos [12, 13]. intensidade da coloração foi avaliada semi-quantitativamente utilizando um sistema de pontuação de 4 cansado (Fig 1). Percentagem de células tumorais positivas foi determinada considerando-se todas as células tumorais positivas em relação ao seu número absoluto. percentagens foram arredondadas para a próxima decimal. expressões citoplasmáticos de ACLY nuclear e foram avaliadas separadamente

(A) – (D). específica ACLY-expressão era detectável no núcleo ou no citoplasma. (UMA); tecido tumoral sem ACLY coloração de intensidade pontuação específica = 0; (B) fraco citoplasmática pontuação ACLY coloração de intensidade específica = 1; (C) moderada pontuação nuclear ACLY coloração de intensidade = 2 e citoplasmática pontuação ACLY coloração de intensidade moderada = 2; (D) forte citoplasmática pontuação ACLY coloração de intensidade = 3, coloração nuclear adicionalmente moderada está presente; (E) – (H) expressão citoplasmática específica do ME, (E) tecido tumoral sem citoplasmática pontuação específica ME coloração de intensidade = 0 (F); fraco citoplasmática pontuação específica ME coloração de intensidade = 1 (G); moderada citoplasmática pontuação ME coloração de intensidade = 2 (H) e com forte pontuação citoplasmática específica ME coloração de intensidade = 3 (E). (Ampliação; 20x)

Estatísticas

Para todas as análises estatísticas os valores médios dos três TMA-núcleos de cada caso foram utilizados. As diferenças na expressão da enzima foram avaliados por testes não paramétricos.

A análise de sobrevivência incluído curvas de Kaplan-Meier e testes de log-rank. Para análise multivariada, foram utilizados modelos de Cox-regressão. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS 21.0. Nível de significância foi fixado a 5% (ou seja,

p Art 0,05). O nível global de significância foi ajustado para testes de múltipla utilizando o método Benjamini-Hochberg [14] (S2 Tabela).

Resultados

ACLY e ME são upregulated em NSCLC

ACLY expressão em tecido de tumor foi detectado em ambos, citoplasma e núcleo (Fig 1), enquanto que ME foi detectável apenas no citoplasma (Fig 1). imunohistoquímica da expressão da enzima foi significativamente mais elevada em células de tumor (ACLY Nucl .: 19,92 +/- 21,57; ACLY cytopl .: 22,23 +/- 21,57; ME: 52,49 +/- 37,86) do que nos correspondentes tecidos pulmonares não neoplásicas (ACLY Nucl. : 16,57 +/- 16,75; ACLY cytpl .: 11,43 +/- 20,97; ME: 9,53 +/- 10,50;

p Art 0,001)

ME, mas não ACLY é diferencialmente expressos em subtipos histológicos NSCLC

Como a diferenciação entre a ALC e SCC do pulmão é de importância terapêutica, foram analisados ​​os padrões de expressão em relação a esses dois subtipos histológicos NSCLC. ME expressão foi maior em SCC em comparação com LAC (

p Art 0,001). ACLY não mostrou uma correlação significativa com o subtipo histológico. Além disso, uma expressão significativamente maior apenas de ME foi encontrado em fumantes comparados aos não-fumantes (

p

= 0,012).

ACLY mas não ME expressão está associada a fase local do tumor

Analisando os padrões de imuno-histológicos de ACLY e ME em correlação com os estágios tumorais locais, ou seja, pT, observou-se que a expressão ACLY foi significativamente menor nos avançados pT-estágios. Embora uma correlação global positiva significativa dos ME e ACLY foi encontrado (ACLY-ME nuclear: coeficiente de correlação = 0,179,

p Art 0,001; citoplasmática ACLY-ME: coeficiente de correlação = 0,155,

p

= 0,001), ME expressão não mostrou uma correlação com os estágios tumorais locais. Foram observados resultados analógicos para a expressão ACLY em correlação com o tamanho do tumor métrica (ACLY citoplasmática: coeficiente de correlação de -0,135,

p

= 0,003; ACLY nuclear: coeficiente de correlação: -0,144,

p = 0,001

; ME: coeficiente de correlação = 0,006,

p

= 0,887). Enquanto infiltração da pleura visceral também contribui para o estágio do tumor local, foi observada correlação estatisticamente significativa em relação à invasão pleural (ACLY citoplasmática:

p

= 0,186; ACLY nuclear:

p

= 0,532; ME :

p

= 0,971)

ME, mas não a expressão ACLY está associada com eventos metastáticos mediastino

Para investigar a relação entre ME e expressão ACLY à expansão tumoral sistémica, nós. analisados ​​separadamente NSCLC de pacientes positivos nodais em correlação com a localização das metástases linfáticas. A presença de metástases linfonodais do mediastino foi significativamente correlacionada com maior expressão de ME no tecido do tumor primário (

p

= 0,041), mas não da ACLY (citoplasmática:

p

= 0,511; nuclear:

p

= 0,446). Esta associação foi particularmente forte na LAC (ME:

p

= 0,030)

A superexpressão de qualquer ME, ACLY ou ambos é um fator prognóstico

independente

Para evitar viés estatístico. , foram utilizados valores médios de ME e expressão ACLY para dicotomização. Na análise geral foi encontrada nenhuma correlação significativa dos ME e superexpressão ACLY com a sobrevivência do paciente. Resultados semelhantes foram obtidos em análises de subgrupo de acordo com o hábito de fumar, sexo, classificação histológica, pT- ou PN-estágios. estratificação por idade foi realizada utilizando a média de idade (65 anos) no momento do diagnóstico NSCLC. foi detectada nenhuma correlação significativa entre a idade e pT, pN ou estágio geral UICC. Em pacientes jovens, nuclear superexpressão ACLY mostrou-se associada com uma sobrevida global favorável (

p

= 0,029), enquanto que este não era o caso em pacientes com mais de 65 anos (

p

= 0,626 ). ME superexpressão nestes dois subgrupos de idade só mostrou uma tendência estatística em pacientes mais velhos (

p

= 0,093). Pacientes jovens com superexpressão de ME ou ACLY nuclear ou ambos, em seus tumores, tiveram uma sobrevida significativamente mais longa global em comparação com aqueles sem sobre-expressão destas enzimas (

p

= 0,007; Fig 2). A análise multivariada, que incluiu estágio UICC, a única prognosticator adicional neste grupo de doentes, mostrou-se que este seja um fator prognóstico independente (

p

= 0,002; Tabela 1). Por outro lado, a sobre-expressão de um ou ambos os dois enzimas resultou na sobrevivência global mais curto em pacientes mais idosos (Figura 2,

P

= 0,058).

A) A sobre-expressão de ACLY está associada com um melhor resultado em pacientes jovens, mas não em pacientes mais velhos. B) ME superexpressão mostra uma tendência estatística para uma sobrevivência geral mais pobre em pacientes mais velhos. C) Pacientes jovens cujos tumores revelado quer ACLY e /ou ME superexpressão tiveram uma sobrevida significativamente mais longa global em comparação com aqueles sem a sobre-expressão de qualquer enzima. Mas, em pacientes mais velhos superexpressão de qualquer ACLY e /ou ME pode ser associado com a sobrevida global mais pobres.

Discussão

Devido à sua alta incidência e mortalidade, o câncer de pulmão ainda continua sendo um dos principais problemas de saúde, em todo o mundo. Por conseguinte, é de importância fundamental para melhor compreender sua biologia, a fim de desenvolver novas opções de tratamento adequadas.

O interruptor metabólica das células tumorais de glicólise aeróbica é um evento bem conhecido. Por um lado, serve para facilitar a absorção e incorporação de nutrientes para os blocos de construção básicos celular. Por outro lado, resulta na produção de lactato, o que facilita a formação de metástases e resistência à terapia [15, 16].

Em vários tumores malignos que tem sido demonstrado que ACLY não só é fundamental para a de-novo síntese de ácidos graxos [17], mas também a sua taxa de limitar passo [18-21]. Como uma das enzimas chave da síntese de-novo de ácidos gordos, ACLY gera citosólica acetil-coenzima A (acetil-CoA) [22, 23] e oxaloacetato. Este último é reduzido a malato desidrogenase de malato. A isoforma citosólica da enzima converte málico malato em piruvato [24]. Piruvato que não é transportado para a mitocôndria para gerar oxaloacetato, é ainda convertido em lactato [6]. ACLY expressão e ME pode, por conseguinte, ser alterado de células de tumores malignos em comparação com os tecidos não neoplásicos. Comparando pulmão não-neoplásica e tecido NSCLC, encontramos um aumento estatisticamente significativo de ambos, expressão ACLY e ME dentro das células neoplásicas. Isto está em concordância com outras conclusões relativas ao metabolismo de carboidratos alterada no cancro [10, 11, 25-27]. Em nossa coorte, ME e expressão ACLY, nuclear, bem como citoplasmática, mostrou uma correlação positiva. O fato de que os coeficientes de correlação são bastante pequenas podem refletir inter-relações complexas entre várias enzimas metabólicas, bem como elevada heterogeneidade histomorfológica das NSCLC. Comparação de padrões de expressão imuno-histoquímica de mim e ACLY apoia ainda mais esta declaração como única ME-expressão diferiram significativamente entre ALC e SCC. Este tipo de padrões de expressão diferenciais em subtipos de NSCLC também foi mostrado para outras enzimas relacionadas ao metabolismo alterado celular câncer [10, 11, 28].

Desde SCC é frequentemente encontrada em fumantes pesados ​​e LAC são assim chamados típica carcinomas não-fumante, expressão significativamente maior de ME em tumores de pacientes com história de tabagismo não é surpreendente. Isto pode ser devido a diferentes estados de hipoxia de tumores e /ou pacientes que levam a diferentes estados metabólicos em NSCLC e mais provavelmente em CEC em comparação com LAC, também. A maioria do NSCLC associada fumar possuem mutações de p53 e, assim, a frequência de mutações de p53 em comparação SCC é superior a ALC [29]. Recentemente, Jiang poderia verificar se ME expressão é regulada por p53. De acordo com suas descobertas, p53 é responsável por baixo regulação ME expressão [30]. Estas descobertas estão em boa concordância com a nossa, que me não só é sobre-expresso em NSCLC em comparação com o tecido pulmonar livre de tumor, mas também, que ME expressão é maior no SCC comparação com LAC e em fumantes comparados aos não-fumantes.

Striking para nós era que ACLY e ME revelaram diferentes padrões de expressão dependentes de disseminação do tumor local ou mediastinal. Enquanto ACLY foi negativamente correlacionada com a extensão local do tumor medido pelo pT-stage, bem como o tamanho do tumor métrica, ME só mostrou uma correlação significativa com eventos metastáticos mediastino em comparação com metástases em linfonodos hilares (pN1 vs pN2 /PN3). Alterações no metabolismo do tumor, portanto, parecem ser complexo e pode ser diferente, não só em subtipos histológicos, mas também de acordo com a disseminação do tumor local ou sistêmica.

Além disso, nos resultados de pesquisas recentes, as funções adicionais de ACLY ao lado de envolvimento em metabolismo de glicose foram detectados: ACLY também é uma chave-jogador na acetilação das histonas. Estes resultados sugerem uma relação entre as alterações do factor de crescimento no metabolismo do cancro e que a expressão do gene é realizada por ACLY [31]. Em analogia com Wellen, Londono Gentile publicada apenas recentemente que ACLY pelo menos em parte regula metiltransferase-1 DNA (DNMT1) [32]. localização diferente de ACLY pode, portanto, refletem diferentes atividades dentro da célula, ou seja, citoplasmática ACLY é predominantemente envolvida no metabolismo da célula cancerosa, enquanto ACLY nuclear é predominantemente envolvida na regulação da expressão gênica [31, 33]. Por esta razão, foram avaliados diferentes localizações de ACLY, isto é, nuclear e citoplasmática, separadamente. Em concordância com os nossos resultados, Migita mostrou que ACLY foi significativamente maior expresso na ALC em relação ao tecido pulmonar não-neoplásica [22]. Em sua publicação, ACLY também foi um fator prognóstico, enquanto eles mostraram que altos níveis de ACLY foram associados a um pior resultado [22]. Nós não poderíamos reproduzir esse achado de Migita. Mas em contraste com os seus resultados, nuclear superexpressão ACLY foi um benefício significativo em pacientes jovens do nosso grupo. Em comparação com Migita, incluímos não só LAC mas também SCC, bem como LCC e análise imuno-histoquímica de expressão foi avaliada ACLY não só para a intensidade de coloração mas também de acordo com a fracção de células positivas e no que diz respeito a localização subcelular de ACLY. Além destas diferenças analíticos, Migita investigada a expressão de ACLY fosforilado, ao passo que o nosso anticorpo é dirigido contra ACLY independentemente seu estado de fosforilação.

Além disso, na nossa análise detalhada subgrupo, podemos mostrar que a idade do paciente também podem influenciar biologia NSCLC. Embora altos níveis de ambos os ACLY e /ou ME foram um bom fator prognóstico em pacientes com menos de 65 anos, uma tendência estatística para o oposto foi detectado em pacientes idosos. Isto pode indicar diferentes alterações no metabolismo do tumor e função da enzima. Várias alterações metabólicas estão implicados com a idade avançada, tais como aumento da hipoxia e maior incidência de diabetes mellitus tipo 2. Num grande estudo, diabetes mellitus tipo 2 foi associada a um risco mais elevado de desenvolver vários tipos de cancro, incluindo o carcinoma do pulmão [34 ]. Neste contexto, tanto, ACLY e ME foram mostrado ser importante para a secreção de insulina relacionada glucose [24]. Pelo fato, que a incidência de diabetes tipo 2, bem como hipóxia generalizada devido ao comprometimento da função pulmonar é maior em pacientes mais velhos, os nossos resultados de mudança de impacto da ACLY e ME montagem enzimática em NSCLC pode ser funcionalmente compatíveis. Diversidade das NSCLC em diferentes faixas etárias da população é conhecida por aberrações genéticas e as incidências de mutações motorista [35, 36]. Assim, as nossas descobertas, que as alterações de enzimas metabólicas podem ser de diferente influência sobre a biologia do cancro em NSCLC, suporta ainda que o cancro do pulmão resultantes em pacientes jovens podem ser biologicamente e geneticamente diferentes das de doentes mais velhos.

in vitro e estudos in vivo indicam que os novos agentes farmacológicos que inibem ACLY pode levar à redução significativa no crescimento celular tumoral e [22, 33, 37, 38]. Desde que os nossos resultados mostram que a sobre-expressão de ACLY e /ou ME em pacientes com mais de 65 anos de idade tendem a ter um pior prognóstico, eles supõem que os pacientes mais velhos podem lucrar mais com estes inibidores ACLY.

Em conclusão, os padrões de expressão das enzimas metabólicas ACLY e ME são de diferente impacto biológico sobre a sobrevivência em pacientes com NSCLC. Enquanto em pacientes jovens sobre-expressão de ambos os ACLY ou ME é indicativa para uma sobrevivência global favorável, tende a ter o efeito contrário em pacientes mais idosos. Com o desenvolvimento de novos fármacos inibidores dirigidos contra ACLY, nossos resultados apoiar novas opções de tratamento com foco especial em pacientes com NSCLC idosos.

Informações de Apoio

Tabela S1. Resumo dos dados clínico-patológicos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0126357.s001

(DOCX)

S2 Table. Resumo dos resultados dos testes estatísticos relevantes apresentados ajustados para testes múltiplos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0126357.s002

(DOCX)

S1 Dataset. conjunto de dados completo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0126357.s003

(XLS)

Reconhecimentos

Agradecemos Nicola Bittermann pelo apoio técnico e aconselhar. Agradecemos o apoio deste estudo pela Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850 e pelo banco de tumores do Comprehensive Cancer Center Freiburg (CCCF).