Abstract
O receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGFR) é um importante alvo terapêutico em pacientes com cancro colorrectal metastático e anticorpos anti-EGFR cetuximab e panitumumab ter sido aprovado para o tratamento de tais pacientes. Apesar destes avanços, a duração da resposta, em alguns pacientes pode ser limitada. Uma vez que, EGFR é capaz de formar heterodímeros com os outros membros da HER (receptor epidérmico humano) família, é importante investigar a co-expressão e significado prognóstico de todos os membros da sua família em pacientes com câncer colorretal. A expressão dos membros da sua família foram determinados em amostras de tumores de 86 pacientes com Dukes C e D (metastático) cancro do cólon usando imuno-histoquímica. As secções foram marcados pela percentagem de células de tumor positivas e a intensidade de coloração. Suas associações com os parâmetros clínico e sobrevida global ea sobrevida livre de doença foram avaliados por meio de análise uni e multivariada. Em geral, 43%, 77%, 52% e 92% dos casos eram EGFR, HER-2, HER 3 e HER-4-positiva, respectivamente. Curiosamente, 35%, 24%, 43% e 18% dos casos tinham co-expressão de EGFR /HER-2, EGFR /HER-3, EGFR /HER-4 e todos os quatro membros da família HER respectivamente. Destes, apenas a expressão de EGFR e co-expressão de EGFR /HER-4 foram associados com sobrevida livre de doença mais pobres em ambas as análises uni e multivariada. Co-expressão de todos os membros da sua família em câncer de cólon apoia a necessidade de novas investigações sobre o seu valor preditivo para resposta ao tratamento com mAbs anti-EGFR e se essa sub-população de pacientes podem se beneficiar da terapia com a nova geração de pan inibidores -Seu
Citation:. Khelwatty SA, Essapen S, Bagwan I, verde M, Seddon AM, Modjtahedi H (2014) Co-expressão de sua membros da família em pacientes com Câncer C e D Colon Dukes ‘e seus impactos sobre o prognóstico do paciente e sobrevivência. PLoS ONE 9 (3): e91139. doi: 10.1371 /journal.pone.0091139
editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão
Recebido: 11 de dezembro de 2013; Aceito: 07 de fevereiro de 2014; Publicação: 07 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Khelwatty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado por uma bolsa da caridade do cancro BRIGHT (UK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal continua sendo uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. Em 2013, o cancro colorectal é estimada para ser o quarto câncer mais comumente diagnosticado (142.820), mas a segunda principal causa de mortes por câncer (50.830) depois do câncer de pulmão nos EUA [1]. Actualmente, um dos vários medicamentos desenvolvidos para a terapia específica de tumores humanos, o receptor do factor de crescimento anti-epidérmico (EGFR), anticorpos monoclonais (mAbs), cetuximab e panitumumab, e o factor anti-crescimento endotelial vascular (VEGF) mAb bevacizumab tenham sido incorporados em paradigmas de tratamento para a maioria dos pacientes com cancro colorrectal metastático [2] – [5]. Embora a inclusão destes agentes melhorou a sobrevida de pacientes com câncer colorretal metastático, a duração da resposta pode ser limitado. Além disso, tem havido nenhum marcador preditivo de confiança para a resposta a estas terapias anti-EGFR alvo [6] – [10]. O desenvolvimento e a identificação de tais marcadores não só poderia auxiliar na selecção de uma sub-população mais específico de pacientes com cancro colo-rectal que são mais susceptíveis de beneficiar de tais terapias, mas também pode reduzir a tratamentos desnecessários e, assim, o custo elevado para os cuidados de saúde sistema [11].
nas últimas quatro décadas, a expressão aberrante de diferentes membros da sua família e seus ligantes têm sido relatados em uma variedade de cancros humanos. Em alguns estudos, estes têm sido associados com resistência a formas convencionais de terapia e um prognóstico pobre [6], [12], [13]. No entanto, há uma grande variação na expressão relatada dos membros da sua família em pacientes com cancro colo-rectal [6], [14] – [16]. Além da formação de homodímeros, os membros da sua família, tais como o EGFR são capazes de serem activados através da formação de heterodímeros com outros membros da família HER [17] – [19]
Enquanto um número limitado de. estudos investigaram a expressão e significado prognóstico de membros individuais da sua família em pacientes com câncer colorretal [20] – [23], no entanto, a nosso conhecimento, não houve estudos completos sobre a co-expressão e significado prognóstico da membros completos de sua família em pacientes com câncer colorretal, até à data [6]. Portanto, neste estudo nós investigamos os níveis de expressão de todos os membros da sua família, individualmente, bem como a sua co-expressão em amostras de tumor de 86 pacientes com C e D do cancro do cólon Dukes ‘. Também investigamos qualquer associação entre a expressão dos membros da sua família e os parâmetros clínico, sobrevida livre de doença e sobrevida global.
Materiais e Métodos
Informações do Paciente
A aprovação ética foi obtido a partir do Comité de Investigação e Desenvolvimento da Royal Surrey County Hospital para exame de amostras tumorais de pacientes com câncer de cólon para uso neste estudo retrospectivo. Como amostras tumorais única arquivados foram incluídos neste estudo, a comissão de ética dispensou a necessidade de consentimento e paciente registros /informações foram analisadas de forma anónima. Oitenta e seis pacientes com C e D do cancro do cólon Dukes ‘, que passou por uma cirurgia radical no Royal Surrey County Hospital (Guildford, Reino Unido) entre abril de 2002 e novembro de 2007, foram incluídos neste estudo retrospectivo. Aqueles com nenhuma informação de acompanhamento, mis-diagnóstico, e histologia incompleta foram excluídos. Casos de mortes peri e pós-operatório também foram excluídos deste estudo, assim como aqueles com blocos de tumor em uma condição muito pobre para uso imuno-histoquímica. informações clínico-patológico detalhado, incluindo a idade e sexo do paciente estava disponível para cada paciente.
Imunohistoquímica
(FFPE) secções embebidas em parafina fixadas em formalina de espécimes de tumor (3 uM) foram cortados em cortes seriados e foram coradas utilizando o seguinte rato anticorpos primários anti-EGFR (1:10, Novacastra, UK), rato anti-HER-2 (1:150, o Insight biotecnologia, UK), rato anti-HER-3 (1:20, Novacastra , Reino Unido) e de coelho anti-HER-4 (1:20, Fisher Scientific, UK). A seguir à recuperação do antígeno, secções de tumor foram incubadas com anticorpos primários anti EGFR, HER-3 e HER-4 durante 60 minutos e HER-2 para 32 minutos. optimização protocolo foi realizado utilizando a estabeleceu peletes linha celular de cancro positivos, ou seja, o EGFR sobre-expressam linha celular de cancro colorrectal humano DiFi, que foi gentilmente cedido pelo Dr. Z Ventilador (Cancer Centre MD Anderson, EUA), HER-2 que sobre-expressam o carcinoma da mama humano a linha celular SKBR3 (HER-2), e HER-3 e HER-4 linha celular humana de carcinoma da mama positivo MCF-7 tal como descrito anteriormente [24]. A coloração foi levada a cabo numa Autostainer Referência XT Venatana com o kit UltraView DAB (Roche, Reino Unido). Finalmente, todas as lâminas foram reidratadas e contrastadas com hematoxilina, montadas ea tampa escorregou.
Scoring System
Na literatura atual, os valores de corte para a pontuação positiva HER imunocoramento secções de tumor é variável . Neste estudo, a imunocoloração das secções de tumor foram avaliadas com base na percentagem de células de tumor que teve seu imunocoloração (ou seja, 5%, 10% e 50%) e a intensidade da imunocoloração (isto é negativo 0, 1+ fraco positiva, moderadamente positiva 2+ e 3+ fortemente positiva) e se a coloração era predominantemente presente na membrana, citoplasma ou no núcleo das células [15]. Do HER imunocoloração, HER-4 teve os mais altos níveis de coloração de fundo e, portanto, imunocoloração acima do nível de fundo só foi considerada [22]. Dois observadores independentes (incluindo uma histopathologist consultor), sem o conhecimento prévio dos parâmetros clínico, realizado o placar e qualquer disparidade na pontuação foi resolvido por reavaliação simultânea da coloração por ambos os observadores.
Análise Estatística
A associação entre os escores de imunohistoquímica e dados clínico-patológicos do paciente foi avaliada por meio do teste qui-quadrado (Pearson Chi-Square) e exato de Fisher. parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram usadas para realizar a análise uni e as diferenças entre os grupos foi avaliada através da realização de log rank-teste. Para a análise multivariada, foi utilizado o modelo de regressão de Cox de multi e P ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando as estatísticas SPSS 21 (SPPS Inc.).
Resultados
Características clínicopatológicos
características clinicopatológicas dos pacientes são resumidos na tabela 1. O paciente médio tempo de seguimento foi de 6 anos. Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. Cinquenta e dois pacientes receberam quimioterapia adjuvante pós-operatório, que era predominantemente 5-fluorouracil base com alguns pacientes que receberam oxaliplatina e irinotecano terapias baseadas. A sobrevida global mais pobres foi observada em pacientes com Dukes ‘D comparação com Dukes C (3,2 ± 0,6 contra 6,2 ± 0,4 anos, a
P = 0,005
), e aqueles com mais de 3 linfonodos positivos (4,3 ± 0,4 contra 6,7 ± 0,5
P = 0,008
). Nenhuma associação significativa foi encontrada entre o resultado do paciente e os outros parâmetros clínico (Tabela 1).
Expressão imuno-histoquímica dos seus membros da família
No cut off valor de ≥5%, tumor espécimes de 43%, 77%, 52% e 92% dos casos eram EGFR, HER-2, HER-3 e HER-4 positiva respectivamente (Tabela 2). Em contraste com o EGFR, que tinha coloração predominantemente membranosa, o local predominante de HER-2, HER 3 e HER-4-imunocoloração citoplásmica foi (Tabela 2 Figura 1). Neste estudo, investigou-se a co-expressão de todos os membros da sua família em pacientes com cancro do cólon e os resultados são apresentados na Tabela 3. A co-expressão do EGFR com HER-2, HER-3, HER-4, e HER-2 /HER-4 estavam presentes em 35%, 24%, 43% e 76% dos casos examinados (Tabela 3). Curiosamente, foram encontrados 18% dos pacientes neste estudo para co-expressar todos os quatro membros da família HER (Tabela 3 Figura 2).
A imunocoloração de EGFR 3+, HER-2 3+, HER-3 2+ e HER-4 3+ nas secções de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina coradas imuno-histoquímica, como descrito na secção de métodos e pacientes. Ampliação:. × 200
Co-expressão de EGFR, HER-2, HER-3, e HER-4 em formalina fixo secções de tumores embebidos em parafina coradas imuno-histoquímica, como descrito na secção de métodos e pacientes. Ampliação:. × 200
A porcentagem de seus casos de câncer de cólon positiva também foi avaliada quando imunocoloração estava presente em mais do que 10% e 50% das células tumorais (Tabela 2). Usando os valores de corte de acima de 10% e 50%, a percentagem de casos com tumores EGFR positivas foram de 30% e 4%, HER-2 positivo tumores were12% e 8% e HER-3 tumores positivos foram de 45% e 22 %, respectivamente (Tabela 2). O número de seus 4-tumores positivos permaneceu o mesmo, independentemente dos valores de corte da percentagem de células tumorais positivas, como todos os pacientes tiveram HER-4 imunocoloração em mais de 50% das células tumorais neste estudo (Tabela 2) .
expressão e Co-expressão dos seus membros da família está associada com clinico-patológica Parâmetros
a associação entre características clínicas e a expressão de membros da sua família foi determinada pelo teste do qui-quadrado. Todas as sub-categorias (células positivas ou seja percentuais, intensidade e localização da imunocoloração), que foram encontrados para ter uma associação estatisticamente significativa com os parâmetros clínico estão resumidos na Tabela 4.
Quando imunocoloração estava presente em superior a 5% das células tumorais, uma associação significativa foi encontrada entre a expressão de EGFR e idade (
P = 0,022
) e local do tumor (
P = 0,022
), com um significativamente maior número de pacientes acima de 70 anos com tumores positivos para EGFR em cólon esquerdo (Tabela 4). Além disso, um número significativamente maior de tumores Dukes C foram encontrados para expressar HER-4 (
P = 0,011
) (Tabela 4). Como expressão do EGFR, a co-expressão de EGFR /HER-4 também foi significativamente associada a pacientes com mais de 70 anos de idade (
P = 0,031
) e tumores que apresentam no cólon esquerdo (
P = 0,039
) neste estudo. Além disso, um número significativamente maior de tumores no cólon esquerdo foram encontrados para EGFR co-express /HER-2 /HER-4 (
P = 0,036
) (Tabela 4).
no valor de corte acima de 10%, a expressão do HER-2 foi associado com o envolvimento de mais de 3 linfonodos positivos (
P = 0,047
) (Tabela 4). Além disso, um número significativamente maior de tumores expressando HER-3 (
P = 0,037
), ou co-expressando EGFR /HER-3 (
P = 0,035
), ou HER-3 /HER-4 (
P = 0,026
) foram encontrados em tumores estágio pT4 neste estudo (Tabela 4). Quando analisados com base na intensidade de sua coloração, uma associação significativa foi encontrada entre HER-4 intensidade de imunomarcação de 1+ e 2+ e um número maior de tumores G3 (Tabela 4).
Sobrevivência livre de doença é significativamente associada com a expressão e Co-expressão de seus membros da família
a associação entre a expressão de individuais, dois, três ou todos os quatro membros da sobrevivência de sua família e livre de doença foi investigado usando Kaplan-Meier curvas e log rank-teste. sobrevida livre de doença foi encontrado para ser significativamente mais pobres em pacientes com expressão de EGFR em valores de corte de ambos acima de 5% (
P = 0,019
) e 50% (
P = 0,005
), expressão membranosa do EGFR (P = 0,004) e EGFR imunocoloração intensidade de 1+ (
P = 0,041
) (Figura 3 Tabela 5). Além disso, houve uma associação significativa entre a co-expressão do EGFR e HER-4 superior a 5% ou superior a 10% de células tumorais e sobrevivência livre de doença mais pobre (
P = 0,019
) (Tabela 5 ). A co-expressão de HER-2 /HER-3 também foi encontrado para ser significativamente associada à sobrevida livre de doença mais pobre (
P = 0,031
) (Tabela 5).
Kaplan-Meier curvas de sobrevivência que mostram o impacto na sobrevida livre de doença dos pacientes com expressão de EGFR (a), expressão EGFR membranoso (B), EGFR 1+ imunocoloração (C) e EGFR /HER-4 a co-expressão (D). Um valor de log-rank teste do
P ≤ 0,05
foi considerada significância estatística.
Finalmente, na análise multivariada, a expressão de EGFR em valores de corte de ambos above5 % (
P = 0,027
) e 50% (
P = 0,015
), a expressão membranoso de EGFR (
P = 0,007
) e EGFR 1+ imunocoloração (
P = 0,048
) foram encontrados para permanecer fatores prognósticos independentes para sobrevida livre de doença pobres. Olhando para o co-expressão de receptores, apenas a EGFR /HER-4 imunocoloração na acima de 5% de células tumorais permaneceu como um fator prognóstico independente para pior sobrevida livre de doença neste estudo (Tabela 5). Nenhuma associação significativa foi encontrada entre a expressão dela e sobrevida global neste estudo.
Discussão
A expressão aberrante dos membros de sua família e, em particular, EGFR tem sido relatada em uma ampla gama de cancros humanos e tem sido associado com a metástase e mau prognóstico [6], [25], [26]. Como resultado, tem havido um desenvolvimento substancial de terapias moleculares alvo EGFR e subsequente aprovação de mAbs anti-EGFR, tal como cetuximab e panitumumab, para o tratamento de pacientes com cancro colorrectal metastático [2], [27]. No entanto, apesar de estudos extensivos, não existem actualmente marcadores fiável para prever a resposta a terapia com estes inibidores de EGFR [6], [28]. Em vários estudos,
KRAS
mutações em pacientes com câncer colorretal estão associados com resistência à terapia com anticorpos anti-EGFR e é o único biomarcador para prever o resultado dos pacientes quando tratados com direcionados anti-HER terapias no cancro colorectal [ ,,,0],29]. No entanto, apesar destes avanços, é evidente que nem todos os pacientes com câncer colorretal com KRAS tipo selvagem iria ganhar o benefício de mAbs anti-EGFR e respostas objetivas também foram relatados em pacientes com tumores KRAS mutado [30]. Uma razão para isso poderia ser que KRAS tem qualquer interacção directa com a ligação do anticorpo no local de antigénio e, portanto, é prudente para investigar a expressão de outros membros da sua família, que foram mostrados para activar as vias de jusante, através de heterodimerização e transversal -Fale, e conduzir o tumorigénese de câncer colorretal nestes doentes [17] – [19]
Vários outros estudos investigaram a expressão dos membros individuais da sua família como um indicador de prognóstico, mas claro não. foram encontradas associações entre a expressão de seu proteínas e prognóstico em pacientes com câncer colorretal [31] – [37]. A expressão relatada de EGFR varia de 8 a 100%, HER-2 a partir de 1% a 89%, HER-3 16-89%, e HER-4 11-81% em pacientes com cancro colo-rectal [6], [14 ] – [16], [20] – [22], [38]. A grande variação na expressão relatado dos SEUS proteínas da família por imuno-histoquímica em câncer colorretal pode ter contribuído para os dados conflitantes sobre o seu significado prognóstico no câncer [6] colorectal. De fato, fatores como o uso de anticorpos diferentes, diferenças nas técnicas de recuperação antigênica, sistemas de pontuação, diferentes populações de pacientes, tamanhos de amostra [por exemplo, microarrays de tecido (TMA)], e números de amostra diferentes poderiam contribuir para a grande variação na expressão relatado dos membros de sua família na literatura [6], [28].
Neste estudo, foi investigada a expressão de todos os membros da sua família em 86 pacientes com C e D do cancro do cólon Dukes ‘. Desde inconsistências no sistema de pontuação, tais como o uso de diferentes valores de corte para HER imunocoloração é um fator importante que contribui para a grande variação na sua expressão relatados na literatura, neste imunocoloração estudo foram marcados e avaliados por meio de três valores de corte off diferentes 5%, 10% e 50% (Tabela 2). Dos 86 casos examinados, verificou-se 43%, 77%, 52% e 92% dos casos de ter EGFR, HER-2, HER-3, e HER-4 imunocoloração presente em 5% de células de tumor, respectivamente ( Figura 1). Aqui, enquanto nós não encontramos nenhuma associação entre a expressão dos membros da sua família e sobrevida global, isto é, em concordância com outros estudos na literatura [6]. Ao contrário de sobrevida global, neste estudo a expressão do EGFR e co-expressão de EGFR /HER-4 foram associados com sobrevida livre de doença em ambas as análises uni e multivariada (Figura 3 Tabela 5). A expressão do EGFR foi significativamente associada com pior sobrevida livre de doença e recidiva da doença em dois outros estudos. Num estudo, Galizia et ai. [34] investigaram a expressão de EGFR em amostras tumorais de 154 pacientes com câncer colorretal A-D Dukes ‘e encontrou expressão membranosa do EGFR ser significativamente associada à sobrevida livre de doença pobres, tanto em análise univariada e multivariada. Em outro estudo envolvendo 102 pacientes com câncer colorretal avançado, foram encontrados 75,5% dos casos para expressar EGFR, que foi significativamente associada com recidiva da doença [39]. Em contraste, Leung et al. [23] em seu estudo de 127 pacientes com câncer de cólon usando seções TMA, não encontrou qualquer associação significativa entre a expressão de EGFR, e o resultado do paciente, mas encontrou-a-3 expressão a ser um preditor significativo do resultado sobrevivência. Como explicado acima, as diferenças, tais como o uso de seções TMA em vez de blocos de tecido inteiro, a heterogeneidade dos tumores e o uso de diferentes valores de corte poderia ser alguns dos fatores que contribuem para os dados conflitantes sobre a expressão e significado prognóstico da SEUS proteínas no câncer colorretal. Além disso, como nós investigamos o significado prognóstico dos membros de sua família em apenas 86 pacientes neste estudo, isso exigiria uma validação adicional no grupo maior de pacientes com câncer colorretal.
Vários estudos sugerem que a heterodimerização de sua família membros desempenha um papel crucial na tumorigénese, e em particular elas também podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de resistência à terapia em pacientes com cancro colorrectal [17] – [19]. No entanto, até à data apenas quatro estudos determinou-se a expressão de todos os membros individuais da família HER, mas os níveis de todos os membros da família HER co-expressão não foi previamente relatada em cancro colorrectal [20] – [23]. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a relatar tanto a expressão individual e co-expressão de todos os membros da sua família em amostras de tumores de pacientes com C e D do cancro do cólon Dukes ‘. Curiosamente, considerando-se os valores de corte de 5 células tumorais positiva 10%% e, encontramos a co-expressão de EGFR /HER-4 para ser significativamente associada à sobrevida livre de doença em pacientes com Dukes C e câncer de cólon D em neste estudo (Tabela 5). Enquanto alguns estudos relatam a associação entre a co-expressão de HER-2 /HER-4 ou HER-3 /HER-4 e tumorais tarde fases [21], [22], a nosso conhecimento a co-expressão significativa de EGFR /HER-4 com sobrevida livre de doença mais pobre em pacientes com câncer de cólon não foi previamente relatado. Os nossos resultados sugerem que a formação de heterodímeros de EGFR e HER-4, podem desempenhar um importante papel na tumorigénese do cancro do cólon e contribuir para recidiva mais rápida da doença nestes pacientes. Curiosamente, encontramos a co-expressão de todos os quatro membros da sua família em 18% dos casos examinados e 35%, 24% e 43% dos casos tinham co-expressão de EGFR com HER-2, HER-3 e HER-4, respectivamente. Por conseguinte, é essencial para investigar se a co-expressão de outros membros da sua família na cancros EGFR positivas podem contribuir para a resistência, ou uma resposta fraca a terapia com o cetuximab anti-EGFR mAb e panitumumab em pacientes com cancro colo-rectal [ ,,,0],6].
em conclusão, a co-expressão de todos os membros da sua família em uma porcentagem considerável de pacientes com pacientes com câncer de cólon metastático aqui relatada, juntamente com a importância de heterodimerização entre os membros da sua família no ativação de seu vias de sinalização, apoia a necessidade de mais estudos sobre a sua co-expressão, significado prognóstico e valor preditivo para a resposta à terapia com seus inibidores, em uma população maior de pacientes com câncer colorretal. Em particular, tais estudos devem desvendar se essa sub-população de pacientes podem se beneficiar da terapia com a nova geração de pan HER-inibidores [40], [41].