Abstract

criptas colônicas são estruturas estereotipadas com células-tronco distinta, proliferando e os compartimentos de diferenciação. cancros colorretais derivam de epitélios cripta do cólon, mas, em contraste, formam glândulas morfologicamente desordenadas. Neste estudo, foram investigados em que medida os cancros colo-rectal fenocópia arquitectura da cripta do cólon e, portanto, preservar a organização estrutural do epitélio intestinal normal. Um subconjunto de cancros do cólon mostraram compartimentos cripta como com elevada actividade WNT e nuclear β-catenina no bordo de ataque do tumor, proliferação adjacente, e reforçada citoqueratina 20 expressão em epitélios tumor mais diferenciada do centro do tumor. Esta arquitetura dependia fortemente das condições de crescimento, e foi totalmente reprodutível em xenoenxertos rato de células cancerígenas do cólon cultivadas e primário. organização completa cripta-like foi associada com baixo grau do tumor e foi um marcador prognóstico independente de melhor sobrevida em uma coleção de 221 cancros colo-rectais. Nossas descobertas sugerem que a ativação completa de programas morfogenéticos intestinais preservados em câncer de cólon requer

In vivo

ambientes de crescimento. Além disso, a arquitetura crypt-like foi ligado com a biologia do tumor menos agressivo, e pode ser útil para melhorar os regimes atuais de classificação de cancro do cólon

Citation:. Cernat L, Blaj C, Jackstadt R, Brandl L, Engel J, Hermeking H, et ai. (2014) cânceres colorretais Mimic organização estrutural do normal do cólon criptas. PLoS ONE 9 (8): e104284. doi: 10.1371 /journal.pone.0104284

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de abril de 2014; Aceito: 07 de julho de 2014; Publicação: 11 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cernat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Apoiado por uma bolsa da Wilhelm Sander-Stiftung (para DH) e Social Fund-Projecto Europeu 107 /1,5 /S /78702 (para LC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) deriva da mucosa do cólon normal, por um bem caracterizado acumulação, por passos de mutações que transformar células epiteliais normais em células tumorais com comportamento maligno [1]. mucosa do cólon normal é simplesmente organizada, basicamente, como uma folha de células epiteliais com invaginações formando criptas estereotipadas [2]. Cada cripta contém compartimentos funcionais distintas com células-tronco na base da cripta, responsáveis ​​pela renovação contínua de células epiteliais idosos, uma zona proliferando trânsito de amplificação que se estende até meados da cripta, e as células epiteliais mais maduros em direção ao ápice cripta [3]. Os dados experimentais, derivadas principalmente de pequenas criptas intestinais murino, sugerem atividade de sinalização WNT canônica alta dentro do compartimento de células-tronco na base da cripta [4], [5], enquanto que células maduras no ápice da cripta são caracterizadas pela expressão de marcadores de diferenciação, tais como Cytokeratin 20 (CK20) [6].

Em contraste com a mucosa do cólon normal, a organização estrutural do CRC é muito menos bem compreendidos. Os CRCs formam massas tumorais, em vez de folhas de células, com diferentes graus de glândulas epiteliais morfologicamente desordenadas [7]. No entanto, estes tumores não parecem ser completamente desorganizadas. Um gradiente entre células tumorais menos diferenciadas no bordo de ataque do tumor, e as células diferenciadas mais glandulares no centro do tumor pode ser observada na maioria dos CRCs [8], [9]. Além disso, as células tumorais na vanguarda tumor expressam tipicamente forte nuclear β-catenina, indicando atividade de sinalização WNT alta, e foram contestados para representar uma população de células progenitoras de células-tronco de câncer de cólon operacionalmente definidos [10], [11]. Pelo contrário, a expressão de CK20 foi sugerido para rotular células cancerígenas do cólon mais diferenciados, desde a sua expressão era mutuamente exclusivos com marcadores putativos do cancro do cólon com células-tronco [11], [12]. Colectivamente, estes dados sugerem algum grau de organização estrutural no CRC, com células-tronco cancerosas na borda do tumor líder e diferenciação em direcção ao centro do tumor.

Considerando esses achados e compartimentos conhecidos dentro de criptas intestinais, nós aqui investigado, a que medida os CRCs fenocópia criptas colônicas normais. Nós categorizar o grau de arquitetura crypt-like em uma coleção de casos de câncer colorretal com os dados de acompanhamento a longo prazo e demonstrar que

in vitro

e

in vivo

condições de crescimento influenciam fortemente sobre esta organização estrutural .

Materiais e Métodos

Histologia e imunohistoquímica

fixados em formalina, embebidos em parafina mucosa do cólon humano normal, tecidos CRC primário, tumores do xenoenxerto, e esferóides de células tumorais incorporado Matrigel foram cortadas com 5 mm de, desparafinados, e antigénios foram recuperados em TRS6 (Dako Cytomation) durante 20 min num forno de microondas. culturas aderentes de células Caco2 e SW1222 foram cultivadas em lamelas foram fixadas em formalina, e permeabilizadas em 2% Triton X-100. Diapositivos ou a tampa desliza em seguida, foram incubados sequencialmente com rato anti-β-catenina (BD Transduction Laboratories; 1:200), coelho-Ki67 anti (Cell Signaling; 1:200) e de cabra anti-CK20 (Santa Cruz Biotechnology; 01:50 ) durante 1 h cada, à temperatura ambiente, lavou-se com PBS, e depois com FITC conjugada de burro anti-cabra (Jackson ImmunoResearch; 1:200), AlexaFluor 555 de cabra anti-ratinho conjugada, e AlexaFluor 405 de cabra anti-coelho conjugado (Invitrogen; 1:500). Para a visualização de β-catenina nuclear em criptas do cólon normais, os núcleos foram contrastadas com DAPI (Vector Laboratories). imagens de fluorescência confocal foram tiradas num microscópio de varrimento laser LSM 700 usando o software ZEN (Carl Zeiss). Para imunocoloração convencional e de casal, rato pré-diluído anti-β-catenina (Ventana Medical Systems) e /ou rato anti-CK20 (Progen; 1:200) foram utilizados, e coloração foi realizada em uma referência Autostainer XT Ventana com UltraView Universal DAB e kits de detecção de fosfatase alcalina (Ventana Medical Systems). foram incluídos isotipo-controles para todos os antígenos.

cultura de células e xenotransplantes rato

células Caco2 foram comprados na American Type Culture Collection e as células SW1222 foram obtidos do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (Nova Iorque, EUA). culturas de células aderentes foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Biochrom), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de glutamina, e penicilina-estreptomicina 1x. esferóides culturas foram cultivadas em meio StemPro células estaminais embrionárias humanas SFM na presença de 20 ng /ml de EGF e 10 ng /ml de bFGF (Life Technologies) em frascos de ultra-baixas de fixação (Corning). tecido vital de um adenocarcinoma de cólon primário esporádica foi adquirida através do tecido Stiftung Humano Cell Research (HTCR, Munique, Alemanha), desagregadas em suspensões de células individuais utilizando colagenase IV (Worthington Biomedical) e DNase I (Sigma-Aldrich), como descrito anteriormente [10], e expandido em culturas de esferóides. Para análises adicionais, esferóides de linhas de células e células de tumor primário foram colhidas por centrifugação a 200 g, ressuspenso em Matrigel, fixadas em paraformaldeído, e, em seguida, ensanduichada entre as camadas (HistoGel ThermoScientific) para inclusão em parafina. Para o crescimento do xenoenxerto, 10

6 células a partir de culturas de células aderentes ou 10

5 células cancerígenas do cólon primários derivados de esferóides foram suspensos em 100 ul de uma mistura 1:01 de PBS e o crescimento de Matrigel empobrecido-fator (BD Bioscience) antes da injeção subcutânea em 6-8 semanas de idade NOD /SCID (NOD.CB17-Prkdc

scid, The Jackson Laboratory) camundongos. Os animais foram alojados em gaiolas micro Pathogen Free-isolador e sacrificados quando xenoenxertos atingiram um diâmetro de 1 cm. tumores de xenoenxerto em seguida foram removidas, fixadas com formalina e embebidas em parafina. Três xenoenxertos independentes foram submetidas a investigação adicional para cada linha de células de tumor primário ou. procedimentos experimentais utilizando animais foram revistos e aprovados pela Regierung von Oberbayern.

coleta da amostra CRC e estatísticas

espécimes CRC de pacientes que foram submetidos à ressecção cirúrgica com intenção curativa entre 1994 e 2006 na LMU foram atraídos a partir dos arquivos do Instituto de patologia. dados de seguimento foram registrados pelo Registro de Câncer de Munique. As amostras e os dados foram tornados anónimos, ea necessidade de consentimento foi dispensada pelo comitê de ética institucionais da Faculdade de Medicina da LMU. Os critérios de inclusão foram localizados adenocarcinomas colorretais com ausência de nodal (N0) ou metástases à distância (M0) no momento do diagnóstico (UICC fase I e II). Os tecidos tumorais foram reunidos em microarrays de tecido (TMAs) com 6 representativa 1 núcleos mm, incluindo bordas tumorais e centros de tumor de cada caso. A coleção final foi composta por 221 casos de CRC dos quais em 41 casos (19%) pacientes tinham morrido do tumor dentro do período de acompanhamento. dados de sobrevivência foram censurados quando caso follow-up foi interrompido ou pacientes morreram de produtos que não CRC razões. Caso características estão resumidas na Tabela 1. TMA lâminas foram então submetidos a colorações simples e duplas para β-catenina e CK20, como descrito acima. secções de tecido inteiras de casos individuais com distribuição β-catenina e CK20 heterogênea foram utilizados para análises de fluorescência imune triplo. sobrevida específica do câncer foi analisada pelo método de Kaplan-Meier e os grupos foram comparados com o teste de log-rank. As estatísticas foram calculadas usando SPSS (IBM).

Resultados

Crypt-como compartimentos funcionais e formação do eixo no cancro colorectal

Para visualizar diferentes compartimentos funcionais dentro de cólon normal criptas e CRCs, estabelecemos triplos colorações de imunofluorescência para a β-catenina, proliferation- relacionados Ki-67 antigénio (Ki67) e Cytokeratin 20 (CK20). Como esperado, de imagem confocal de criptas do cólon normais indicado compartimentos WNT activos com expressão nuclear de β-catenina na base das criptas, um trânsito zona de amplificação Ki67 expressando de proliferação de progenitores epiteliais, e as células epiteliais mais diferenciadas que expressam CK20 em direcção ápices das criptas (Figura 1A). Notavelmente, visualização de fraca mas distinto nuclear β-catenina na base da cripta necessário grandes ampliações e contracoloração nuclear ligeira (Figura 1A, figura S1). Nós, então, submetido CRCs primárias para o mesmo protocolo de coloração tripla. Semelhante a descobertas anteriores [8], [9] expressão, forte nuclear de β-catenina foi confinada às células tumorais no bordo de ataque do tumor e células cancerígenas do cólon incluídos morfologicamente indiferenciadas que se infiltram o tecido envolvente do estroma (Figura 1B). Curiosamente, e, pelo contrário, nuclear β-catenina, CK20 coloração foi mais intensa em epitélios tumoral diferenciado mais central e glandular, vizinha de necrose tumoral (Figura 1B). Ki67 foi encontrada entre estas zonas e foi reduzida em células de tumor com forte expressão CK20 (Figura 1B). Estes resultados indicaram que, apesar de a formação da glândula disarrayed, cancros do cólon preservar algum grau de organização estrutural e formação do eixo encontrados em criptas colônicas normais.

coloração imunológica triplo para β-catenina (βCat), Ki67 e CK20. (A) criptas colônicas mostrar expressão β-catenina nuclear em sua base, Ki67 estendendo-se até meados da cripta, e CK20 no ápice. Visualização de nuclear β-catenina necessária contracoloração com DAPI e ampliação elevada (

esquerdo do painel de inserção

). As barras vermelhas e azuis delinear partes cripta com e sem nuclear β-catenina, respectivamente. (B) cânceres colorretais exibir uma organização semelhante com nuclear β-catenina na borda tumoral (

setas

), expressão CK20 no centro do tumor (

setas

) e Ki67 no meio.

Barras de escala

, 100 mm.

modelos de xenotransplante de cancro do cólon reproduzir o espectro completo de organização cripta-like

Em seguida, analisamos um câncer de cólon primário e linhas celulares de cancro do cólon, sob diferentes condições de crescimento

in vitro

e

in vivo

. Aderente

in vitro

culturas de células de linhas de células de cancro do cólon SW1222 e Caco2 revelaram algum grau de heterogeneidade da célula tumoral para nuclear β-catenina, Ki67 e CK20 que foi mais proeminente em baixa densidade do que em culturas confluentes (Figuras 2A- D). culturas de baixa densidade SW1222 também exibiram alguma formação de eixo centrípeta rudimentar com expressão aumentada ligeiramente CK20 e proliferação Ki67 reduzida dentro dos centros de colónias, e mais forte coloração nuclear β-catenina na borda de colónias (Figura 2A). Em células Caco2, a expressão diferencial de CK20 e β-catenina nuclear apareceu mais distribuída aleatoriamente (Figura 2C). Para avaliar se três crescimento dimensional renderia graus mais elevados de organização estrutural e heterogeneidade da célula tumoral

in vitro

, nós cultivadas ambas as linhagens celulares e células de câncer de cólon primário como esferóides não aderentes. Similar aos nossos achados em culturas aderentes, observamos alguma heterogeneidade de células tumorais para todos os três marcadores (Figuras 2E-G). No entanto, embora as esferas de câncer de cólon primário mostrou ligeira formação do eixo centrípeta com reforçada coloração centro de CK20 (Figura 2G), nenhuma organização estrutural completo, como tínhamos encontrado no tecido do cancro do cólon primário, observou. Em seguida, injetada ambas as linhagens celulares e células de câncer de cólon primário em ratinhos imunocomprometidos para a formação de tumor subcutâneo

in vivo

. Ao contrário do nosso

in vitro

resultados, estes tumores formados estruturas glandulares com graus completos de heterogeneidade da célula tumoral e nucleares β-catenina, KI67 e CK20 compartimentos positivos distintos (Figuras 2H-J), imitando aquelas encontradas em CRCs primário, e uma reminiscência da arquitetura cripta do cólon normal. Colectivamente, estes resultados indicaram que três crescimento dimensional e tecido do estroma circundante são necessários para expor heterogeneidade da célula tumoral completa e formação do eixo em CRCs.

coloração imunológica Triplo revela falta de organização estrutural completo em culturas de tecidos aderentes de (a) baixa densidade e (B) confluentes SW1222, e (C) de baixa densidade e (d) confluentes Caco2 células cancerígenas do cólon, bem como em culturas de esferóides de (e) SW1222, (F) Caco2, e (g) as células cancerosas do cólon primário . Pelo contrário, os xenoenxertos subcutâneos de (H) SW1222, (I), Caco2, e (J), as células de cancro do cólon primário formar glândulas com expressão organizada de β-catenina nuclear na borda do tumor (

pontas de seta) e CK20 expressão no centro do tumor (

setas

).

Barras de escala

, 100 mm.

Classificação e relevância clínica da organização cripta, como em cancros colo

Para determinar a frequência da organização cripta, como em CRCs , foi utilizado um caso coleção de 221 tumores primários e aplicado coloração imunológica duplo para β-catenina e CK20, marcando os dois extremos de compartimentos da cripta do cólon normais. A análise desses casos revelou 5 diferentes tipos de cancros do cólon: O maior grupo (tipo A) mostraram expressão organizada nuclear β-catenina na vanguarda do tumor e aprimorados CK20 dentro do centro de tumor (Figura 3). De notar no entanto, ao examinar casos deste tipo em cortes seriados, observamos expressão CK20 reforçada adicional em células tumorais mais infiltrativas na vanguarda do tumor, a sobreposição com nuclear β-catenina na maioria destes casos (Figura S2). Os outros tumores não tinham esta organização a algum grau (Figura 3), quer pela ausência de nuclear β-catenina (tipo B), ausência de reforçada CK20 no centro do tumor (tipo C), ausência de diminuição nuclear β-catenina no tumor centro (tipo D), ou ausência de ambos nuclear β-catenina e expressão CK20 (tipo e). Em seguida, examinaram esses tipos de associações com sobrevida específica do tumor. Curiosamente, gráficos de Kaplan-Meier mostrou melhor resultado para CRCs com organização estrutural da cripta do tipo completo, com base nuclear β-catenina e expressão CK20 (tipo A) que foi significativamente melhor, quando estatisticamente testadas contra todos os outros tipos combinadas (Figura 4). Em seguida, examinou tumores do tipo A para as associações com outras variáveis ​​clínicas e encontrou uma correlação significativa com baixo grau do tumor, enquanto não houve associação significativa com outras variáveis, como idade, sexo e categoria T (Tabela 1). Finalmente, ao testar tumores do tipo A contra os outros para a previsão de sobrevida em análise multivariada, organização estrutural completa provou ser um marcador prognóstico independente para sobrevida específica melhor câncer (Tabela 2). Estes resultados demonstram que os CRCs imitar compartimentos cripta semelhante e formação do eixo em diferentes graus e implicam que a elevada semelhança estrutural com criptas do cólon normal pode ser associado com o comportamento do tumor menos agressivo.

coloração imunológica duplo de β-catenina (

marrom

) e CK20 (

vermelho e). (Tipo A) organização estrutural completa com nuclear β-catenina na borda tumoral (

seta

) e CK20 dentro do centro de tumor (

arrow

). (Tipo B) Ausência de nuclear β-catenina. (Tipo C) Ausência do centro de CK20. (Tipo D) Ausência de diminuição nuclear β-catenina no centro do tumor. (Type E) Ausência de ambos nuclear β-catenina e CK20. Frequências desses tipos são dadas na tabela.

(A) de Kaplan-Meier para os diferentes tipos de cancros colo-rectais, como indicado por letras em curvas. (B) do tipo A pacientes com câncer colorretal (

superior curva

) mostram significativamente (-log rank test) melhor sobrevida quando comparado a outros tipos (

curva inferior

). Rácios de curvas indicam o número de eventos sobre o número de pacientes por grupo.

Discussão

Aqui, demonstramos que CRCs fenocópia arquitetura cripta do cólon normal. Em contraste com criptas normais, estes tumores crescem de forma invasiva e formar glândulas morfologicamente desordenadas [7]. No entanto, compartimentos distintos com actividade elevada WNT na vanguarda do tumor, proliferação adjacente, e expressão aumentada CK20 em direcção ao centro do tumor pode ser identificado. Desde criptas colônicas normais têm um compartimento de células-tronco impulsionado WNT conhecido em sua base, com vencimento em células epiteliais com expressão CK20 forte no ápice [4] – [6], os nossos resultados apoiam a ideia de cancros do cólon que imitam estes compartimentos funcionais, com dois pontos células-tronco cancerosas na borda do tumor líder, e diferenciação de células tumorais centrípeta, como foi previamente hipótese [13]. No entanto, nossos dados também indicam diferenças significativas para a arquitetura da cripta do cólon normal, uma vez que nem todos os CRCs mostrou toda a gama de compartimentalização cripta-like. Além disso, CRCs com compartimentos discerníveis frequentemente mostrou CK20 reforçada não apenas em áreas tumorais centrais mas também na vanguarda do tumor, coincidindo com forte nuclear β-catenina e alta atividade WNT. Embora estes resultados implicam que os programas morfogenéticas de células epiteliais do intestino ainda estão ativos no câncer colorretal, em certa medida, marcadores de diferenciação terminal no intestino normal pode não necessariamente ser limitada a células tumorais totalmente diferenciados de neoplasias intestinais.

Comparando diferentes condições de cultivo e crescimento de células cancerígenas do cólon, observou-estruturas glandulares totalmente desenvolvido e compartimentadas em

in vivo

única tumores de xenoenxerto. Recapitulação das estruturas, imitando arquitectura cripta do cólon normal e formação de gradiente total de células menos e mais diferenciadas de câncer de cólon, podem por conseguinte exigir sinalização de um microambiente do tumor [8], [14], faltando em sistemas de cultura padrão. Estes resultados têm implicações importantes para os estudos que se concentram em subpopulações de células tumorais específicas, uma vez que a composição das células tumorais em culturas regulares ou esferóides podem não refletir adequadamente a situação em tumores primários. Curiosamente no entanto, quando cultivada como tumores de xenoenxerto, linhas de células de cancro do cólon, mesmo estabelecidas formadas estruturas cripta-like totalmente desenvolvidos e compartimentalização, semelhantes aos cancros do cólon primários. Isto sugere que, apesar de algumas alterações genéticas esperados em linhas passadas células [15], utilizando xenoenxertos de linhas celulares do cancro do cólon não pode ser inferior à utilização dos cancros do cólon primários para os estudos sobre as subpopulações de células tumorais, tais como células estaminais do cancro do cólon [12] , [16]. Neste contexto, as condições de crescimento

in vivo

pode ser mais relevante do que a fonte da célula de câncer de cólon, seja derivado de culturas estabelecidas ou tumores primários.

Ao olhar para as associações com parâmetros clínicos, ligámos organização estrutural cripta-like das CRCs à melhoria da sobrevivência e de baixo grau do tumor. Enquanto prognóstico destes tumores pode ser melhor avaliado pela encenação, descrevendo extensão da doença [17], classificação histopatológica do tumor tem sido associada independentemente com a evolução da doença e reflecte o grau global de diferenciação de células de tumor [18]. Vários sistemas de classificação com base em diferentes aspectos da morfologia do tumor foram propostas, no entanto, devido à má reprodutibilidade, um sistema de duas camadas simplificado, considerando apenas a formação da glândula, é actualmente favorecido, e classifica estes tumores em neoplasias baixo e alto grau [19] . Embora este sistema de classificação é amplamente aceito e considerado como um fator prognóstico consistente pelo College of American Pathologists, que não integra a existência e distribuição de subpopulações de células tumorais distintos que podem ter impacto no prognóstico. Por outro lado, as abordagens recentemente emergente para avaliar CRC prognóstico, tal como a expressão dos marcadores de células estaminais [20], [21] ou Profiling MicroRNA [22], até agora, quer a falta de aceitação geral ou ter a ressalva de ser dispendioso e tecnicamente exigentes. Uma vez que em nosso estudo, a organização cripta-like servido bem em predizer a evolução da doença, propomos que esta abordagem pode integrar os aspectos morfológicos de formação de glândula com marcadores que indicam compartimentos tumorais funcionais. expressão p-catenina e CK20 pode ser robustamente avaliada em amostras de câncer de cólon e integração destes parâmetros para diagnóstico de rotina pode, portanto, melhorar histopatológico de classificação câncer de cólon. Em adição a estas considerações, os nossos resultados podem também explicar dados inconsistentes anteriores sobre correlações clínicas da nuclear β-catenina [23], [24], a proliferação de células de tumor [25], [26], e a expressão CK20 no cancro do cólon [27] , [28]. Se estes marcadores indicam compartimentos funcionais e estruturais dentro destes tumores, é possível que a organização do compartimento é mais relevante para a biologia do tumor e refletido na evolução clínica do que o tamanho simples compartimento.

Informações de Apoio

Figura S1.

Aumento Wnt-actividade na base das criptas do cólon normais. Enquanto β-catenina etiquetas membranas de células epiteliais, como parte de junções aderentes, grandes ampliações indicam expressão nuclear adicional β-catenina na base crypt (

setas pretas

). Falta de expressão nuclear com dominância de contracoloração azul é visto em células epiteliais acima da base crypt (

setas azuis

). .

Painel

mostra maior ampliação da área de box no

direito painel

Esquerda

doi: 10.1371 /journal.pone.0104284.s001

(TIF)

Figura S2. expressão

CK20 não estão limitados ao centro do tumor do tipo A cancros colo-rectais. As secções seriadas demonstraram, em adição à coloração CK20 reforçada no centro do tumor (

setas), a coloração aumentada para o CK20 na borda do tumor, com sobreposição nuclear β-catenina (

pontas de seta). Este padrão foi encontrado em 61% dos do tipo A cancros colo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104284.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Somos gratos a A. Sendelhofert, A. Schäfer e M. Melz de assistência experimental, e agradecer o Tissue Stiftung Pesquisa Humana e celular (HTCR) para a prestação de tecido de câncer de cólon.