Abstract
Os tumores são muitas vezes heterogêneo no qual as células tumorais de diferentes fenótipos têm propriedades distintas. Por interesses científicos e clínicos, é de fundamental importância para compreender as suas propriedades e as variações dinâmicas entre diferentes fenótipos, especificamente sob radioterapia e /ou quimio-terapia. Atualmente, existem dois modelos controversos que descrevem a heterogeneidade do tumor, o modelo da célula-tronco cancerosas (CSC) e do modelo estocástico. Para esclarecer a controvérsia, medimos probabilidades de diferentes tipos de divisão e transições de células através de
in situ
imunofluorescência. Com base nos dados de experiências, nós construímos um modelo que combina o CSC com os conceitos estocásticos, mostrando a existência de duas subpopulações CSC distintivas e as transições estocásticos de NSCCs para os CSCs. Os resultados mostraram que as variações dinâmicas entre CCC e células cancerígenas não estaminais (NSCCs) pode ser simulado com o modelo. Estudos adicionais também mostraram que o modelo pode ser usado para descrever a dinâmica das duas subpopulações após tratamento com radiação. Mais importante, a análise demonstrou que o equilíbrio experimental detectável CSC proporção só pode ser alcançado quando ocorrem as transições estocásticos de NSCCs para os CSCs, indicando que a heterogeneidade do tumor podem existir em um modelo de coordenação com o CSC e ambos os conceitos estocásticos. O modelo matemático baseado em parâmetros experimentais podem contribuir para uma melhor compreensão da heterogeneidade do tumor, e fornecer referências sobre a dinâmica da CSC subpopulação durante a radioterapia
Citation:. Wang W, Quan Y, Fu Q, Liu Y, Liang Y, Wu J, et al. (2014) Dynamics entre subpopulações de células Cancer revela um Modelo de Coordenação com os dois conceitos hierárquicos e estocásticos. PLoS ONE 9 (1): e84654. doi: 10.1371 /journal.pone.0084654
editor: Toru Hosoda, Universidade de Tokai, Japão
Recebido: 29 de junho de 2013; Aceito: 18 de novembro de 2013; Publicação: 09 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Projeto chave da National Science Foundation Natural da China (10935009), a Fundação Nacional de Ciência para Jovens Estudiosos da China (31000383) e do Programa de Instrumento Grand National (2012YQ030142). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os tumores são muitas vezes heterogêneo em que existem células tumorais individuais em diferentes fenótipos com propriedades funcionais distintas [1]. Clinicamente, os tumores de diferentes doentes, se leucémicas ou sólido, muitas vezes exibem uma heterogeneidade significativa em termos de morfologia, marcadores de superfície celular, as lesões genéticas, cinética de proliferação celular, e resposta à terapia [2]. Portanto, é de fundamental importância para compreender a base molecular e celular da heterogeneidade. Atualmente, existem dois modelos controversos que descrevem a heterogeneidade no tumor, o modelo de CSC eo modelo estocástico. O modelo de CSC, também conhecido como o modelo de hierarquia, sugere que o crescimento e progressão de muitos cânceres são movidos por pequenos mas distintas subpopulações de CSCs, eo tumor é uma caricatura de desenvolvimento do tecido normal, onde as células-tronco manter hierarquias de tecido normal [3] . Os CSCs no vértice da estrutura hierárquica não só pode manter-se por auto-renovação, mas também se diferenciam em NSCCs. Em contraste, o modelo estocástico, também conhecido como modelo de evolução clonal, prevê que um tumor é biologicamente homogéneos e que o comportamento das células cancerosas é influenciado de forma aleatória por fatores imprevisíveis intrínsecas e /ou extrínsecos [3].
A dois modelos evocado grandes interesses em ambos os estudos experimentais e teóricos. Em estudos experimentais, embora o mecanismo da heterogeneidade do tumor ainda não é claro, há fortes evidências de que o cancro é uma hierarquia celular com CSCs no ápice [2], [4] – [7], indicando que a terapia de cancro pode necessitar de eliminação de CSCs [4], [8]. Estes papéis apoiou o modelo de CSC e evocou novas estratégias na segmentação CSCs para tratar o câncer [2], [4] – [7]. No entanto, vários outros trabalhos mostraram que a plasticidade fenotípica tumores dentro pode produzir, inter-conversão bidireccional entre CCC e NSCCs, resultando em variação dinâmica na abundância relativa de CSCs [1], [9] – [11]. Vesuna
et al, achou que a expressão transitória de
Torção
pode induzir o fenótipo de células-tronco em várias linhas de células de mama e que a diminuição
Torção
expressão reverte parcialmente a assinatura molecular de células-tronco [12]. Morel
et al
informou que CSCs de mama podem ser gerados através EMT cascata [13]. Liang
et al
sugeriu que CSCs são inducible aumentando instabilidade genômica em células de câncer [14]. Curiosamente, Chaffer
et al
relataram que as células não estaminais normais e neoplásicas pode espontaneamente converter para um estado-tronco-like [9]. Mais importante, Iliopoulos
et al
informou que CSCs de mama pode ser induzida a partir NSCCs através da secreção IL6 e as duas populações de células podem alcançar equilíbrio dinâmico [1]. Recentemente, Gupta
et al
descreveu um modelo que o equilíbrio fenotípica em populações de células cancerosas é conseguido através de transições de estado estocásticos [10]. Nossos estudos anteriores também mostraram o
em transições situ
e fenótipo equilíbrio dinâmico entre CSCs e NSCCs, com ou sem tratamento de radiação [11].
Em estudos teóricos, debate quente também foi estimulada entre os diferentes papéis. Beretta
et al
analisou o comportamento assintótico de CSC proporção e o caso quando não há transições de não-tronco para célula estaminal [15], mostrando a estabilidade do percentual CSCs de forma matemática. Gupta
et al
desenvolveu um modelo de Markov para explicar o fenômeno que uma subpopulação fenótipo purificada finalmente retorna ao equilíbrio proporções fenotípicas sob a condição de que as células de trânsito estocasticamente entre os estados diferentes [10]. Este modelo prediz que as células não estaminais como basal e luminal têm uma probabilidade não nula de se tornar estado haste semelhante. Zapperi
et al
analisados os tipos de modelos matemáticos e propôs que a classificação imperfeita poderia ser uma explicação alternativa para a subpopulação “purificado” voltar ao equilíbrio proporções [16].
O modelo de CSC eo estocástico modelo sugerem diferentes estratégias clínicas de terapia tumor. Atualmente, a urgência está em como melhorar os modelos para obter uma melhor compreensão da heterogeneidade do tumor e as variações dinâmicas de diferentes subpopulações, especificamente os CSCs e NSCCs em tumor. Construímos um modelo matemático baseado em parâmetros medidos a partir de experimentos, especificamente os tipos e taxas de divisões e transições. Os resultados mostraram que a dinâmica experimentais entre CSC e NSCC subpopulações podem ser simulados por meio do modelo, com ou sem tratamento de radiação. Outras análises demonstraram que o experimental equilíbrio detectável CSC proporção só pode ser alcançada quando ocorrem, sugerindo heterogeneidade do tumor podem existir as transições estocásticos de NSCCs para CSCs em um modelo de coordenação tanto com a CSC e os conceitos estocásticos.
Equações e suposições
estudos anteriores sugeriram que as células CD133-positivos são o potencial subpopulação CSCs em SW620 células do cólon humanos [11], [17], [18]. Por meio de
in situ
imunofluorescência, os tipos de divisão de CSCs e NSCCs através de mudanças de Marcação de Superfície foram ensaiadas. Para CSCs, ambas as divisões simétricas e assimétricas foram capturados. Isto é, um CSC pode dividir-se em duas CSCs (auto-renovação), dois NSCCs (diferenciação), bem como um CSC e uma NSCC (divisão assimétrica) (Fig. 1A). Para NSCCs, somente o tipo de divisão simétrica (proliferação) foi capturado, isto é, um NSCC divide em duas NSCCs. É importante ressaltar que existem transições fenótipo distintivo de NSCC a CSC independente da mitose celular (Fig.1A).
(A). tipos de divisão típicos de CSCs /NSCCs e transição de NSCC a CSC. A barra de escala é igual a 50 uM. (A-b) típica
in situ
tipo divisão de um NSCC (seta branca) e transição de um NSCC a um CSC (seta amarela); (CD). Típico
in situ
divisões simétricas de CSCs: a auto-renovação (um CSC divide em duas CSCs) e diferenciação (One CSC divide em duas NSCCs); NSCC (seta branca), CSC (seta amarela). (E-F). Típico
in situ
divisão assimétrica de CSC (Uma divisão CSC em um CSC e um NSCC); NSCC (seta branca), CSC (seta amarela). (Eu). equações cinéticas que correspondem aos fenómenos em a e b. (Ii) equações cinéticas que correspondem aos fenómenos em c e d. (Iii) equação cinética que corresponde ao fenómeno em e e f. (B). Esquema do modelo com base nos resultados experimentais
premissas principais:..
Existem CSCs e subpopulações NSCCs em células cancerígenas do cólon humano SW620 [11]
A CSC pode dividir simetricamente em duas CSCs (auto-renovação) ou dois NSCCs (diferenciação) com probabilidade
P
S
ou
P
D
respectivamente (Fig. 1A) . Além disso, a CSC pode dividir assimetricamente em um CSC e uma NSCC com probabilidade
P
A
(
P
A
= 1-
P
S Restaurant –
P
D
) (Fig.1A). Diferentes tipos de divisão CSC tem a mesma velocidade de mitose denotado por
K
C
.
A NSCC pode dividir-se em duas NSCCs (proliferação), com taxa de
K
N
(Fig.1A).
a NSCC pode converter em um CSC com a taxa de
K
T
(Fig. 1A) [11].
NSCC limitou proliferam potencial e poderia passar por senescência com vida útil de
M
geração [19], [20]. O
M
th
geração morre com uma taxa de
d
(Fig. 1B). O valor de
d
e
M
estão simplesmente definido como sendo 1 e 50, como sugerido anteriormente [21].
O esquema do modelo é mostrado na FIG. 1B. De acordo com os pressupostos acima indicados, a dinâmica entre CCC e NSCCs pode ser descrito com as equações diferenciais ordinárias (EDOs) (Equação (1)). Em ODEs, descobrimos que
P
S, P
D Comprar e
P
A
aparecem em determinadas combinações. Assim, estes três parâmetros podem ser incorporados em um parâmetro. (1)
C
denota o número de CSCs e
N
i
denotar o número de NSCCs;
i = 1, 2,
…,
M
.
É bem sabido que o tratamento de radiação pode causar uma série de danos nas células, entre as quais DNA rupturas de filamentos duplos (LAP) são os mais tóxicos [22]. Aqui nós adicionar taxas de mortalidade correlacionadas com LAP dinâmica ao nosso modelo quando as células foram irradiadas. Após a radiação, o número aumentado de LAP e saturado em células irradiadas [23] rapidamente, em seguida, diminuiu, devido à reparação do ADN. Portanto, com base na dinâmica ‘LAP [24], [25], a taxa de mortalidade poderia ser descrito como
k
denota a produção da DSB, em média, por dose unitária.
D
denota dose.
r
é a taxa de reparação de LAP,
r
C Comprar e
r
N
representar a taxa de reparação de CSC e NSCC respectivamente.
m
significa taxa de mis-reparo letal de per DSB par. No modelo atual,
m
C Comprar e
m
N
representam taxas de mis-reparação letais de CSC e NSCC respectivamente (Detalhes podem ser encontrados nas Equações S1 S1 Arquivo) .
resultados
Parâmetros medidos através de experimentos in situ
As probabilidades de tipos de divisão ‘CSCs e percentual de transição de NSCCs foram determinados por meio de
in situ
imunofluorescência (Fig. 1). Para ser consistente com os resultados da experiência da dinâmica populacional, estimou-se
K
T
,
K
N
e
K
C
pelo cálculo do mudança quantidade de CSCs e NSCCs ordenados e percentual de transição NSCCs ‘em um dia. Porque CSCs e NSCCs ‘ciclos celulares são ambos aproximadamente um dia, a divisão do NSCCs recém-nascidos na população CSCs ordenada contribui pouco para mudança de quantidade em um dia e a divisão de novos CSCs em NSCCs ordenados não é significativa (equações usadas na estimativa são mostrado nas Equações S2 em S1 do ficheiro). Os valores destes parâmetros são apresentados no Quadro 1.
Após tratamento por radiação, a média de produção de DSB numa célula é relatado para ser 25-35 /Gy [26]. E
R
é calculado a partir de uma meia-vida de LAP ou focos e a sua ordem de grandeza é ~ 10 /dia [23], [27]. Desde CSC tem maior capacidade de reparar danos no DNA [28], a suposição de que
r
C Art
r
N
é feita. Aqui definimos
r
N
= 10 e
r
C
= 15. As frações de sobrevivência (
S
) de CSCs (
S
C
) e NSCCs (
S
N
) menos de 2 Gy tratamento de radiação são medidos a partir dos experimentos. Portanto, a taxa de mis-reparo letal de CSCs (
m
C
) e NSCCs (
m
N
) pode ser calculada pela seguinte equação (Equação (2)) , (2)
Como se mostra na Tabela 2, o valor de
K
, D,
r
N
,
r
C
,
S
C
,
S
N
,
m
C Comprar e
m
N
são 25, 2, 10, 15, 95,0%, 43,0%, 0,0012 e 0,0092, respectivamente.
Simulação de variações dinâmicas de longo prazo entre CSC e NSCC subpopulações
com base na parâmetros, que, em seguida, analisada a dinâmica da proporção CSC (definir as), sob diferentes condições iniciais por meio do modelo matemático (simulação de variação do número de células é mostrada na Tabela S1 S1 no ficheiro e a Fig. S1).
Teoricamente , mostra-se que a proporção CSC finalmente atinge um valor constante, não importa que a condição inicial é (Fig. 2A). Comparando os resultados da simulação com dados experimentais relatados anteriormente [11], é claro que o valor constante calculado por este modelo é próximo aos resultados experimentais (Fig. 2B), demonstrando parâmetros recebendo a partir do
in situ
imunofluorescência pode prever a tendência de a dinâmica entre CCC e NSCCs subpopulação (dados de experiências são mostrados nas Tabelas S2-S3 em ficheiro S1). Além disso, NSCCs purificadas e CSCs ordenados a partir da linha celular SW620 por FACS foram cultivadas, e as proporções CSC no dia 26 após a inoculação foram testados. Como mostrado na Fig. 2C, proporções CSC de diferentes culturas iniciais atingir o mesmo valor constante que é igual à proporção CSC em células SW620 indiferenciados.
(A). Diagrama de procedimentos experimentais; (B). Comparação entre os resultados da simulação e os resultados experimentais; (C). Os resultados experimentais de longo prazo de equilíbrio proporções CSC de CSCs purificados iniciais e NSCCs.
análise de sensibilidade de parâmetros
As respostas do CSC proporção para a alteração de parâmetros no equilíbrio são analisados (parâmetros são apresentados na Tabela 1). Regularmente, cada parâmetro é aumentado ou diminuído por um por cento e a alteração da proporção de CSC no equilíbrio é calculado como relatado anteriormente [29].
H
é um número inteiro, de modo que a mudança de
H
é mais ou menos 1. Como mostrado na Fig. S2, quando
K
T
,
K
N
,
K
C Comprar e
e
são aumentados em 1 por cento, a proporção de CSC no equilíbrio aumentaria 0,3%, 0,5% diminuir, aumento de 0,2% e 1,1%, respectivamente, aumentar. Entre os parâmetros,
H
é um parâmetro insensível, que é ajustado para ser de 50, tal como sugerido anteriormente [21]. De acordo com o cálculo,
M
é um parâmetro insensível em uma grande variedade. Assim, a escolha do valor de M coloca pouca influência na simulação de equilíbrio. Outros parâmetros sensíveis, incluindo
e
(
e
=
P
S Restaurant –
P
D
),
K
N
,
K
T
e
K
C
são todos medidos em experiências
testar os parâmetros e as dinâmicas entre CSC e subpopulações NSCC através do método autômato celular
Para validar ainda mais os parâmetros e as dinâmicas entre CSCs e NSCCs, que, em seguida, estudou a dinâmica entre CSC e NSCC subpopulações com os parâmetros através do método autômato celular. autómato celular é baseado no comportamento da célula individual e a interacção entre os indivíduos. É amplamente utilizado para modelar sistemas biológicos multi-celulares, incluindo tumores. Pode reflectir a propriedade discreta de tumor que é negligenciado no método ODE [30]. Ao utilizar o método de células autómato, uma melhor compreensão de como tumor cresce em escala microscópica pode ser obtido [31]. Conforme o conceito de CSC sai, método autómato celular é utilizada para a simulação de CSCs [32] – [36]
O esquema de cálculo pode ser encontrado na Fig.3.. Em cada passo de tempo, A NSCC decide se a morrer ou se transformar em um CSC. NSCCs e CSCs avançar um passo em seus ciclos celulares respectivamente. Uma célula vai dividir em duas células quando termina um ciclo celular. Se não houver nenhum local vago pela célula para se dividir, que iria tornar quiescente. Se houver espaço para a célula para dividir, por um CSC, seria decidir Tipo de divisão por acaso; para uma NSCC, seria dividir e gerações ambas as células filhas ‘aumentar em 1.
(A). esquema de cálculo para o método de autômato celular. (B). resultado típico de simulação com o método de autômato celular (condição inicial é que todas as células são NSCCs). Vermelho: CSC; Azul: NSCC; Preto: Estrutura vago. (C). Comparação entre os resultados da simulação com o método de autômato celular e resultados experimentais.
Como mostrado na Fig.3C, com os parâmetros, a simulação mostra coerência com os dados da experiência e a proporção CSC de cada grupo também alcançou o valor estável, indicando ainda os parâmetros coletados a partir dos experimentos são confiáveis. Além disso, os resultados do método autómato celular fornecer informação mais detalhada da dinâmica. Durante a proliferação, CSCs e NSCCs pode em primeiro lugar colônias de formulário e, em seguida, expandir em torno (Video S1-2). Finalmente, CSCs e NSCCs espalhados uniformemente por toda a área. É possível que todos os off-molas de um CSC ou NSCC são CSCs e NSCCs para várias gerações. Se estes CSCs ou NSCCs conectar com outros CSCs ou NSCCs respectivamente, tornam-se agregações em determinadas áreas (Fig.3b).
Simulação de variações dinâmicas de longo prazo entre CSC e NSCC subpopulações após tratamento com radiação
As variações dinâmicas entre CCC e NSCCs após tratamento com radiação são simuladas com vários parâmetros adicionais foram então realizada (Tabela 2) (simulação de variação do número de células é mostrada na Tabela S4 no ficheiro S1 e Fig. S3). Os resultados mostraram que a simulação do modelo dá uma predição aceitável em resultados experimentais como anteriormente relatado [11]. Como mostrado na Fig. 4B, proporções CSC de todos os grupos de diferentes proporções iniciais podem finalmente chegar ao mesmo valor constante como os casos sem radiação, indicando radiação curto prazo não pode perturbar o equilíbrio dinâmico de longo prazo entre as CSCs e NSCCs. Curiosamente, na mistura de 70% e 30% CSCs grupo NSCCs, simulação mostra que a CSC proporção sobe rapidamente no início e cai para baixo em dois dias (Fig. 4C). Esta é também, de acordo com os resultados experimentais como já relatado anteriormente [11].
(A). Diagrama de procedimentos experimentais com tratamento de radiação; (B). Comparação entre simulação e experimentais resultado em 0-24 dias (radiação é aplicada quando t é 0 dia); (C). imagem amplificada dos resultados irradiado 70% do grupo CSC (0-2d) (radiação é aplicada quando t é 0 dia).
Separação Imperfect não pode explicar o equilíbrio dinâmico entre NSCCs e CSCs
O equilíbrio dinâmico entre CSCs e NSCCs é um fenômeno interessante [1], [9] – [11]. Este fenômeno, que foi recentemente relatado por vários papéis, podem ter impactos profundos sobre a compreensão da heterogeneidade do tumor, bem como estratégias de terapia clínicos [10]. Análise do fenómeno também mostrou que, de um equilíbrio estável CSC proporção entre 0 e 1 é fácil de conseguir, se existirem transições de NSCCs para os CSCs (). Se
K
T
é igual a 0, existe o equilíbrio CSC proporção não-zero apenas sob a condição de que, isto é, a taxa de proliferação das CSCs líquido é maior do que a de NSCCs (detalhes podem ser encontrados nas discussão S1 no arquivo S1 e Fig. S4), o que também não é o caso em nossos experimentos e outros relatórios [2], [37].
Uma explicação alternativa para o equilíbrio dinâmico sugerido por Zapperi
et al
é que este fenómeno pode, devido à separação imperfeita das células através de citometria de fluxo, em vez de as transições de NSCCs para CSCs. A triagem imperfeita é inevitável nas experiências, resultando em algumas células para o grupo errado, como uma minoria (Fig.5a). Como mostrado na Discussão S1 S1 no ficheiro de viajantes
(A). Diagrama de triagem de erro nas experiências; (B). Comparação entre simulação (
K
T
= 0) e os resultados da experiência.
R
é a proporção CSC em toda a população.
Se
K
T
é 0,. Sob a situação da triagem imperfeito,
R
é muito baixa em NSCCs ordenados no início. Então, quase igual a zero. Assim, o aumento de
R
será insignificante nos primeiros vários dias. De acordo com os nossos dados da experiência, é maior do que 0,1 nos primeiros dois dias. Se
R
é de 0,02 no início, deve ser maior que 5. Isto é contra registros de experiências sobre a proliferação celular. No entanto, se
K
T
não é 0, é aproximadamente igual a
K
T
no início. O aumento da
R
será mais perto de nossos dados da experiência.
Para ilustrar melhor essa probabilidade, analisamos teoricamente em nosso modelo com a classificação de erro de CSCs e NSCCs como
θ
por cento (normalmente
θ
≤2 de acordo com as instruções da citometria de fluxo). Se não houver transições de NSCCs para CSCs (
K
T
= 0), o modelo não pode ajustar os dados experimentais da dinâmica proporção CSC adquirida a partir de experimentos com
θ
. algoritmo de recozimento simulado é usado para ajustar nossos dados experimentais cuja condição inicial é CSCs “purificado”, porque este processo poderia ser alcançado com
K
T
= 0. Então, temos 50 parâmetros combinações de
K
C
,
K
N
e
e
. Como mostrado na Fig.5B, os resultados mostraram que, embora CSCs minoritários levará a população a equilíbrio estável CSC proporção e esses parâmetros ajustar os dados experimentais de CSCs purificados precisamente, nenhuma destas combinações de parâmetros poderia caber os dados da experiência de NSCCs purificados bem. Tal como mostrado na Fig.5B, as diferenças entre a simulação e os resultados da experiência encontram-se no intervalo de tempo para atingir o equilíbrio. Este valor é em grande parte dependente de
M
. Assim, para obter a curva que é semelhante com os dados da experiência,
H
deve ser de cerca de 5 ou menos. Isto é, obviamente, com os dados experimentais [21], [38]. Portanto, a classificação imperfeita não pode explicar o equilíbrio dinâmico entre CSCs e NSCCs.
Discussão
Tumor heterogeneidade indica implicações importantes para terapias contra o câncer de sucesso [2]. Atualmente, existem dois modelos que descrevem a heterogeneidade do tumor, o estocástico e modelos CSC. A diferença essencial entre elas é que todas as células ou apenas um subconjunto distintas células tumorais têm o potencial para se comportarem como um CSC [2]. Para esclarecer os dois conceitos, partimos do conceito de CSC com a classificação das subpopulações CSC e NSCC e cultivando-los separadamente. Então medimos as probabilidades de tipos de divisão e transições de NSCCs ‘CSCs via
in situ
imunofluorescência como descrito anteriormente [11], [39], [40]. Com base nos parâmetros medidos a partir das experiências (Fig. 1 e Tabela 1), construiu-se um modelo matemático de coordenação com ambos CSC e conceitos estocásticos. Os resultados mostraram que o modelo pode simular a tendência da dinâmica experimentais de NSCC e CSC subpopulações, com ou sem tratamento de radiação (Figura 2 e na Fig. 4).
O modelo estocástico prevê que um tumor é biologicamente homogéneos e que o comportamento das células cancerosas é influenciado de forma aleatória por fatores intrínsecos e /ou extrínsecos imprevisíveis [3]. No entanto, há evidências crescentes foram suportados a existência de CSCs nas últimas duas décadas [4]. Tradicionalmente, os modelos estocásticos geralmente definem vários fenótipos mutação no tumor e as taxas de transição entre esses fenótipos. Estas transições são normalmente unidireccional, a partir dos tipos benignos de tipos invasivos [41], [42]. No entanto, o nosso
in situ
resultados experimentais mostraram que as transições entre as CSCs e NSCCs definitivamente não são unidirecional (Fig.1A), Em contraste, NSCCs podem transitar em CSCs independentes da mitose celular e, CSCs pode gerar NSCCs via diferenciação, bem como dependente da mitose celular (Fig.1A) assimétrica divisão. Além disso, a instabilidade genética é uma das mais importantes regras em modelo estocástico. Através de alterações genéticas ou epigenéticas acumulados, fenótipo suscetível poderia tornar-se fenótipo de resistência. Na perspectiva de colónia, tumor evolui para se tornar mais resistente à terapia [42].
Contudo, o advento de CCC CCC revela que é o motor de crescimento do tumor e a resistência à quimioterapia e radioterapia padrão [5] – [7], [43], que mostra uma estrutura hierárquica mais organizada do que o indicado pelo modelo estocástico. O modelo de CSC sugere que o crescimento e a progressão de tumores são accionados por pequenos mas distintas subpopulações de CSCs [3]. No entanto, vários trabalhos recentes e experiências atuais mostram claramente a existência do
de novo
geração de CSCs de NSCCs (Fig.1) [1], [9] – [11]. As transições de NSCCs para CSCs indicou que o modelo de CSC não é suficiente para explicar a heterogeneidade do tumor e, essencialmente, apoiou o conceito de modelo estocástico. Teoricamente, se não há transições de NSCCs para CSCs (
K
T
= 0), o nosso modelo é apenas o caso do modelo de CSC. No entanto, sob a condição inicial de NSCCs purificado, se as transições não existia, a proporção de CSC na cultura será sempre zero. Isso é óbvio, não é o caso observado em nossos experimentos, bem como vários outros relatórios (Fig.2B e Fig.3C) [1], [9] – [11]. Portanto, o modelo de CSC não podia explicar os fenômenos observados em experimentos. Como mostrado na parte de resultados (Fig. 5), a classificação imperfeita não pode compensar essa falha do modelo de CSC.
É interessante que nós começamos a partir do modelo de CSC, mas tenho os resultados com características tanto da CSC e conceitos estocásticos (Fig.1A), mostrando a existência de ambas as subpopulações CSC /NSCC distintivos e as transições estocásticos de NSCCs para CSCs.
Materiais e Métodos
cultura celular
células cancerígenas do cólon humano SW620 foram adquiridos de celular Resource Center (IBMS, webcams /PUMC, Beijing, China) caracterizada pela STR Profiling. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO
2.
coloração celular e citometria de fluxo
subpopulações correspondentes foram separados como descrito anteriormente [39], [40]. Em resumo, as células foram coradas com uma concentração de 10
7 células por 100 uL de tampão. (AC133) -PE (MiltenyiBiotec) O anticorpo anti-CD133 /1 foi usada para triagem de citometria de fluxo /ensaio. Para todos os experimentos, as amostras foram classificadas em um BD FACS Aria II e analisada em um fluxo BD LSR II citômetro usando BD FACS Diva Software (BD Bioscience). dispersão lateral e perfis de dispersão para a frente foram usadas para eliminar detritos e células dobletes.
In situ imunofluorescência
Detalhes de
in situ
imunofluorescência de e chip projeto são mostrados em nosso trabalho anterior [11]. Em breve, NSCCs e CSCs purificadas foram coradas com o anticorpo monoclonal de ratinho contra o antigénio de CD133 humano acoplado com R-ficoeritrina (CD133 /1 (AC133) -PE de Miltenyi Biotec) em conjunto com o corante de ligação de ADN Hoechst 33342, respectivamente. Após desgaseificação do chip, 25 ml de células (CSCs ou NSCCs) suspensão foram pipetados para dentro do reservatório. A suspensão de células foi aspirado para as salas de cultura de células, devido à pressão negativa. Após o carregamento da amostra, as células do reservatório foram removidos e adicionou-se 35 ml de meio e cultivadas normalmente. Após 2 h de incubação, as células foram fotografadas, pela primeira vez, como descrito abaixo. Para a coloração immunofluroscence de células em pontos de tempo definidos, tais como 12 h ou 24 h, meios no reservatório foi removido e 20 ml de meio com a concentração apropriada de CD133 /1 (AC133) -PE (Miltenyi Biotec) foi adicionado. Após a incubação, o meio com CD133 /1 (AC133) -PE no reservatório foi removido e foi adicionado 35 ml de meio fresco e incubadas em obscuridade por lavagem das células. As células foram lavadas duas vezes e foram imediatamente fotografados.
algoritmo de recozimento simulado
algoritmo de recozimento simulado é um algoritmo de Monte-Carlo que muitas vezes é usado para problemas de otimização. Os parâmetros iniciais são gerados aleatoriamente e os parâmetros candidatos também são gerados aleatoriamente por certas regras. Estes parâmetros foram depois utilizados para resolver a equação (1). Em recozimento simulado, aceitamos temporariamente uma combinação pior de parâmetros com chance de diminuir o risco de otimização local. Medida que a temperatura cai para baixo, próximo de soluções óptimas globais seria derivado [44]. No processo de adaptação, uma combinação de parâmetros é aceito em última análise, se
Σ (-dados de simulação)
2
é menor do que o valor limiar.
Simulação
denota resultados calculados pela combinação de parâmetros e
Dados
denota resultados da experiência. O código computacional pode ser encontrada no Código em S1 Arquivo.
autômato celular método
No método autômato celular, as células são definidos como agentes com propriedades incluindo a divisão, transição e morte. Existem dois tipos de agentes: CSC e NSCC. NSCC pode executar os comportamentos incluindo a divisão, transição e morte. CSC pode executar divisões de simetria e assimetria. Os agentes comportamentos “são quantificados pelos parâmetros que têm sido utilizados na Equação (1). Cada agente de célula ocupa uma rede regular, com dimensão de 10 um x 10 um. Neste modelo, foram definidas 200 × 200 reticulados. Uma rede é ajustado para acomodar uma célula, no máximo, ao mesmo tempo. Portanto, uma célula pode se dividir em duas células a menos que haja pelo menos um local vago na sua vizinhança (bairro von Neumann) [45].
Informações de Apoio
Figura S1.
Cálculo do número de células de diferentes condições iniciais (t-log 10 (número de células))
doi:. 10.1371 /journal.pone.0084654.s001
(TIF)
Figura S2.
Parâmetros sensibilidades de CSC proporção em equilíbrio. barras azuis representam mudanças de CSC proporção no equilíbrio quando os parâmetros correspondentes são aumentadas.