Abstract

O receptor de laminina não-integrina, aqui designado o receptor de laminina de 37 kDa /67-kDa (LRP /LR), está envolvida em muitos processos fisiologicamente relevantes, bem como numerosas condições patológicas. A sobre-expressão de PRL /LR em várias linhas de células cancerosas desempenha um papel crítico na angiogénese e metástases tumorais. Este estudo investigou se a PRL /LR está implicada na manutenção da viabilidade celular em linhas de células de pulmão e cancro da cervical. Aqui demonstramos uma redução significativa na viabilidade celular em linhas de células acima mencionadas, como resultado da regulação negativa mediada por siARN da LRP. Esta redução na viabilidade celular é devido ao aumento dos processos apoptóticos, refletida pela perda de integridade nuclear e o aumento significativo na actividade da caspase-3. Estes resultados indicam que a PRL /LR está envolvido na manutenção da viabilidade celular em células de pulmão tumorigénico e colo do útero através do bloqueio da apoptose. Knockdown da LRP /LR por siRNA pode representar uma estratégia terapêutica alternativa para o tratamento de câncer de pulmão e câncer cervical

Citation:. Moodley K, Weiss SFT (2013) regulação negativa do não-integrina laminina Receptor Reduz Viabilidade celular por indução de apoptose em câncer de pulmão e colo do útero Cells. PLoS ONE 8 (3): e57409. doi: 10.1371 /journal.pone.0057409

editor: Elad Katz, AMS Biotechnology, Reino Unido

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Moodley, Weiss. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. NRF, África do Sul. MRC, África do Sul. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

lamininas pertencem a uma grande família de proteínas da matriz extracelular que estão envolvidas numa série de processos biologicamente significativas, incluindo a diferenciação de células, migração, adesão, crescimento e sinalização [1]. Os efeitos de lamininas são muitas vezes mediada através da sua interacção com proteínas de ligação à laminina não integrina e-integrina, que funcionam como receptores e laminina ligação na matriz extracelular de cascatas de sinalização intracelular [1].

se ligar a uma grande laminina parceiro é uma proteína multifuncional, designada aqui como o receptor de laminina de 37 kDa /67-kDa (LRP /LR). O receptor da laminina de 67 kDa é formada a partir do precursor do receptor de laminina de 37 kDa [2], [3]. O mecanismo exato desta conversão é, actualmente, ainda evasivo, no entanto, alguns estudos têm sugerido que a forma não glicosilada de 37 kDa se torna acilado em Ser2 através da ação dos ácidos graxos; e esta acilação é um passo crítico para a conversão da forma de 37 kDa para a forma de 67 kDa [4], [5].

PRL /LR é um receptor da superfície das células não-integrina exibindo um elevado afinidade para laminina-1 [6], e verificou-se localizar no citoplasma [7], [8], [9], na superfície da célula [10], [11], no compartimento perinuclear [7], [12], [13] e no núcleo [12], [13]. Em cada um destes locais, a PRL /LR está envolvido em numerosos processos fisiológicos, incluindo a síntese de proteínas [8], o amadurecimento da subunidade ribossomal 40S [8], que funciona como receptor para componentes da matriz extracelular e.g. hidratos de carbono e elastina [14], as interações com a proteína príon celular [13], [15] e associações com as histonas [12].

Além de suas inúmeras funções fisiológicas, LRP tem sido implicada em uma série de processos patológicos – que serve como um receptor para os priões infecciosos [16], certas bactérias [17], e vários vírus [18], [19], [20]. Mais notavelmente, um número de tipos de cancro, tais como gástrica [21], do cólon [22], colorrectal [23], do colo do útero [24], da mama [25], do pulmão [26], do ovário [27], pancreático [28] e [29] da próstata cancros, revelam uma sobre-expressão do 67-kDa LR na sua superfície celular, a utilização de anticorpos específicos anti-PRL /LR reduziu significativamente a adesão e invasão de células cancerosas in

in vitro

[6 ], [30], os principais componentes de metástase. A forte correlação também foi estabelecida entre LRP /LR e angiogênese câncer, com a expressão desta proteína correlacionando ao aumento da angiogênese do tumor [31]; descobrimos recentemente que o anticorpo específico /LR LRP, W3, bloqueou a angiogénese [32].

Uma vez que o direccionamento da PRL /LR em células cancerosas tem sido provado ser bem sucedida no que diz respeito à redução de metástases de tumores [6], [30], a função deste receptor sobre a viabilidade celular do cancro e sobrevivência tornou-se um assunto de grande interesse. Este estudo, por conseguinte, com o objectivo de avaliar o efeito do knockdown mediada por siARN da LRP na viabilidade e sobrevivência das células do pulmão e cancro do colo do útero e para determinar a possível as abordagens mecanicistas dos efeitos observados. Pulmão e células de câncer cervical foram escolhidos para este estudo, pois representam os dois principais tipos de câncer diagnosticados em homens e mulheres da África Austral, respectivamente. Mostrámos no presente estudo de que o knockdown mediada por siARN da PRL /LR em A549 e células HeLa causou uma redução significativa na viabilidade destas células. Além disso, demonstrou-se que esta redução na viabilidade celular era como consequência das células em apoptose.

Materiais e Métodos

cultura de células e Condições

A549 e HeLa foram obtidas a partir de ATCC, cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro Fetal de vitela (FCS) e 1% de penicilina /estreptomicina e mantido numa incubadora humidificada a 37 ° C com 95% de ar e 5% de CO

2.

Citometria de Fluxo

a citometria de fluxo foi realizada para determinar os níveis de superfície celular da PRL na A549 e células HeLa. Resumidamente, as células foram desprendidas, sedimentadas e fixados em paraformaldeído a 4%. As células foram em seguida incubadas em 30 ug /ml de o primário específico do anticorpo IgG1 LRP-iS18 ​​em Epics ™ bainha de fluido durante 1 h. As células foram então lavadas em Epics ™ bainha de fluidos e incubadas em 30 ug /ml de anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-FITC anúncios humanos anticorpo secundário (Beckman Coulter) na Epics ™ bainha fluido. Subsequentemente, as células foram lavadas em Epics ™ bainha de fluidos e analisados.

Western Blotting

transferência de Western foi utilizada para determinar os níveis totais de proteína e regulados negativamente da PRL (β-actina utilizada como um controlo de carregamento ) pós-transfecção com siRNA-LAMR1. Resumidamente, as células foram lisadas, os níveis de proteína quantificadas e 5 ug de lisado celular bruto resolvidas num gel de poliacrilamida a 12%. As proteínas foram subsequentemente transferidas para uma membrana de nitrocelulose por electro-transferência semi-seca durante 45 min. A membrana foi bloqueada em 3% de BSA, incubadas numa solução de 1:10 000 a PRL-anticorpo primário específico de IgG1-iS18 ​​em BSA a 3% em PBS-Tween durante 1 h a 4 ° C com agitação. A membrana foi subsequentemente lavada em PBS-Tween, foram ainda incubadas em uma solução 1:10 000 de anticorpo secundário POD anti-humano em BSA a 3% em PBS-Tween durante 1 h a 25 ° C com agitação, lavadas como anteriormente e analisados.

Downregulation mediada por siRNA de LRP

células A549 e HeLa foram transfectadas para LRP knockdown com siRNA comprado de Dharmacon, Cat # J-013303-08, de acordo com instruções do fabricante usando DharmaFECT® 1 transfecção reagente. Controle siRNA usado – Cat # D-001810-01-05

MTT Assay

0,6 × 10

4 A549 e 3 × 10

3 células HeLa foram semeadas no. cavidades de uma placa de 96 poços. As células foram então transfectadas com ARNsi-SCR ou siRNA-LAMR1, tal como descrito, e deixado a incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C com 95% de ar e 5% de CO

2 durante 72 h. 10 ug de MTT dissolvida em PBS foi então adicionado a cada poço um deixada a incubar durante 2 h como antes. O meio foi descartado de cada poço e os cristais de formazan púrpura dissolvido em 200 uL de DMSO. A absorvância de cada poço foi medido a 570 nm utilizando um leitor de placas de ELISA.

Microscopia de imunofluorescência

4 × 10

5 A549 e 3,5 × 10

5 células HeLa foram semeadas em lamelas nos poços de uma placa de 6 poços. As células foram transfectadas com ARNsi-SCR e siRNA-LAMR1, tal como descrito, e incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 95% de ar e 5% de CO

2 durante 72 h. As lamelas de cobertura foram removidas e as células fixadas em paraformaldeído a 1%, corados com Hoechst 33342 (1:10 000 em PBS) e analisadas utilizando microscopia de fluorescência.

A activação da caspase-3 Ensaio

4 × 10

5 A549 e 3,5 × 10

5 células HeLa foram semeadas em poços de uma placa de 6 poços. As células foram transfectadas com ARNsi-SCR e siRNA-LAMR1, tal como descrito, e incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 95% de ar e 5% de CO

2 durante 72 h. A actividade da caspase-3 foi analisada utilizando a caspase-3 Assay Kit (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante.

Avaliação Estatística

Os dados foram analisados ​​estatisticamente com o teste de Dunnett utilizando o GraphPad InStat. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o p-valor foi menor que 0,05.

Resultados

Células

do pulmão e cancro do colo do útero apresentam níveis elevados da superfície celular de LRP /LR e os níveis totais de LRP

uma vez que a sobre-expressão de PRL tem sido observado em várias linhas de células cancerígenas, o nível da superfície das células da PRL /LR e os níveis totais de PRL em A549 e células HeLa foi determinada por análise de citometria de fluxo e western blotting, respectivamente (Figura 1). A citometria de fluxo revelou que 83% e 80% da A549 e as células HeLa, respectivamente, expressas a PRL /LR na sua superfície celular (Figura 1A e 1B), estes valores são elevados em comparação com o nível da superfície celular /LR LRP (57%) da linha de células não tumorigénicas, NIH 3T3, (dados não mostrados) e confirma os resultados obtidos em estudos anteriores [30]. A PRL foi encontrado para ser expresso em ambas as linhas celulares por Western blotting, adicionalmente, subsequente análise densitométrica dos sinais obtidos por Western blot revelou que o A549 e células HeLa exibem níveis semelhantes de esta proteína (Figura 1C).

A) 83% da A549 e B) de 80% de células HeLa exibida PRL /LR sobre a sua superfície (picos à esquerda e à direita são representativas de células não marcadas e as células incubadas inicialmente com o anticorpo anti-PRL de IgG1-iS18 ​​e subsequentemente com o anti cabra -rabbit anúncios IgG-FITC humanos anticorpo secundário, respectivamente). C) A549 (pistas 1-3) e HeLa (pistas 4-6) células LRP expressa e análise densitométrica revelou não significativa (p . 0,05) diferenças nos níveis totais LRP entre as duas linhas de células

Determinação da regulação negativa mediada por siARN da LRP expressão no pulmão e do cancro do colo do útero células

o nível de expressão de PRL em A549 e células HeLa após a transfecção com ARNsi-LAMR1 foi determinada utilizando western blotting e quantificado por densitometria (Figura 2). A análise densitométrica dos sinais de transferência de Western obtidos revelaram que A549 (Figura 2A) e HeLa (Figura 2B) células transfectadas com ARNsi-LAMR1 expressa 80% e 60% menos PRL, respectivamente, em comparação com controlos não transf ectadas que foram criadas a 100% .

O nível de expressão de LRP em A549 e as células HeLa foi investigada 72 h pós-transfecção com siRNA-LAMR1. A análise densitométrica de sinais de Western blot revelou um aumento significativo (** p 0,01) 83% e 60% de redução na expressão da proteína LRP em A) A549 e B) células HeLa, respectivamente, em comparação com células de controlo não transfectadas (definido como 100% ).

o Knockdown mediada por siRNA de expressão LRP provoca uma redução significativa na viabilidade do pulmão e células cancerosas do colo do útero

o efeito da regulação negativa mediada por siRNA da expressão da proteína LRP na viabilidade celular em células HeLa e A549 foi determinada utilizando um ensaio MTT. As células foram incubadas com PCA 8 mM (um composto conhecido por diminuir a viabilidade celular através da indução da apoptose [33]) como um controlo positivo e transfectadas com um ARNsi não segmentação (siARN-SCR) como um controlo negativo. 8 valores de PCA mM e siRNA-LAMR1 foram comparados com os valores de siRNA-SCR, que tinham sido definidas como 100%. Os resultados deste ensaio indicam que a significativa (* p 0,05, ** p 0,01) diminuição da viabilidade das células HeLa A549 e (13% e 18%, respectivamente) é, como um resultado da redução da expressão de esta proteína (Figura 3).

A viabilidade da A549 e as células HeLa foram analisadas 72 h após a transfecção utilizando um ensaio MTT. A) A549 e B) células HeLa transfectadas com ARNsi-LAMR1 revelou um aumento significativo (* p 0,05, ** p 0,01) 13% e 18% de diminuição na viabilidade celular, respectivamente, em comparação com ARNsi-SCR que tinha sido ajustado para 100% (PCA 8 mM foi utilizado como controle positivo).

A regulação negativa mediada por siRNA de Expressão LRP provoca uma perda na morfologia nuclear no pulmão e cancro do colo do Cells

Para investigar um mecanismo possível para a morte observada em viabilidade celular em resposta a LRP knockdown em A549 e células HeLa, a morfologia nuclear das células acima mencionadas foi avaliada. As células A549 e HeLa foram transfectadas com ARNsi-LAMR1, incubadas com PCA 8 mM (um indutor de apoptose conhecido [33]) como um controlo positivo e transfectadas com ARNsi-SCR (controlo negativo). As células foram então coradas com o corante fluorescente Hoechst 33324 nuclear e visualizadas num microscópio de imunofluorescência. As imagens nucleares obtidos para siRNA-LAMR1 foram comparados com siRNA-scr – os núcleos aparecem perda de constrição e definitiva da morfologia e integridade nuclear é observado (Figura setas 4-branco). Além disso, a percentagem de células que exibem alterações morfológicas foi determinada por contagem do número de células com e sem alterações morfológicas nucleares em 3 micrografias. 56% de células A549 e 91% de células HeLa exibiram alterações morfológicas nucleares em resposta ao tratamento com siRNA-LAMR1 (7% e 8% de siRNA-SCR tratada células A549 e células HeLa, respectivamente, mostraram alterações morfológicas nucleares).

As células HeLa 72 h pós-transfecção, A549 e foram corados com Hoechst 33342 e visualizadas por microscopia de imunofluorescência. As células transfectadas com siRNA-LAMR1 exposição diminuiu integridade nuclear – indicado por setas brancas (PCA 8 mM foi utilizado como controle positivo)

Knockdown mediada por siRNA de LRP causou um aumento significativo na Caspase-3 Atividade. no pulmão e do cancro do colo do útero células

a actividade da proteína efectora associada a apoptose, caspase-3, em resposta à regulação negativa mediada por siARN da expressão PRL em A549 e células HeLa foi avaliado usando uma activação de caspase-3 ensaio. As células A549 e HeLa foram transfectadas com ARNsi-LAMR1, incubadas com APC mM 8 (um indutor de apoptose [33] – controlo positivo) e transfectadas com ARNsi-SCR (controlo negativo). A actividade da caspase-3 a partir de células transfectadas com ARNsi-LAMR1 foi comparada com as transfectadas com ARNsi-SCR (que tinha sido ajustada para 100%); Estes resultados revelam um aumento significativo (** p 0,01, *** p 0,001). aumento da actividade da caspase-3 em A549 e células HeLa transfectadas com ARNsi-LAMR1 (9% e 83%, respectivamente) (Figura 5)

a actividade da proteína associada a apoptose, foi analisada a caspase-3, em A549 e células HeLa 72 h pós-transfecção. A) A549 e B) células HeLa transfectadas com ARNsi-LAMR1 revelam uma redução significativa (* p 0,05, ** p 0,001) aumento de 9% e 83% na actividade da caspase-3, respectivamente, em comparação com o siRNA-SCR que possui foi definido como 100% (PCA 8 mM foi utilizado como controle positivo).

Discussão

o papel do receptor da laminina na progressão do cancro tem sido um tema de grande interesse para muitos anos e foi, portanto, amplamente investigado. Numerosos estudos têm implicado a superfície celular PRL /LR na progressão do cancro da – este receptor é sobre-expressa sobre a superfície de uma série de linhas de células cancerosas, proporcionando-lhes a capacidade para metastizar e invadir os tecidos circundantes [6], [30]. Dado que a PRL /LR está envolvido num certo número de processos celulares e é encontrado em vários locais celulares (superfície da célula, citoplasma, o compartimento perinuclear e do núcleo), papéis adicionais deste receptor na progressão do cancro têm sido sugeridos.

Para confirmar a expressão da PRL /LR em células A549 e HeLa, a superfície da célula e os níveis totais de proteína esta foi investigada utilizando citometria de fluxo e western blotting, respectivamente (Figura 1). As células do pulmão e cancro do colo do útero tumorigénicas ambos apresentados PRL /LR sobre a sua superfície, e o nível desta proteína na superfície dessas células verificou-se ser maior do que o nível observado na linha celular não tumorigénico NIH 3T3 (fibroblastos de ratinho embrionário ). Esta constatação confirma a investigação anterior, e sugere um papel para este receptor na progressão de células de ser normal a tornar-se cancerosa. Além disso, o pulmão e do colo do útero tumorigênicos células cancerosas tanto expressa LRP internamente, ea diferença no nível interno desta proteína nestas linhas celulares é insignificante.

Para investigar o papel da LRP /LR em câncer relacionado /citotóxico processos, a sua expressão foi significativamente diminuída no pulmão tumorigénico e células de cancro do colo do útero. ARNsi dirigido contra ARNm de PRL foi transfectado para as células acima mencionados e a percentagem de LRP regulação negativa avaliada por análise densitométrica do Western blot sinais obtidos (Figura 2). O nível de expressão PRL foi reduzida em 83% e as células HeLa de 60% na A549 e, respectivamente, o que indica a eficácia do siARN utilizado.

O efeito do knockdown de expressão PRL sobre a viabilidade das células cancerosas , o que é uma característica importante da doença, foi investigada. LRP downregulation correlacionou-se com uma redução significativa da viabilidade de células A549 e HeLa (Figura 3), indicando um papel crucial para a LRP no presente processo. Uma vez que a manutenção da viabilidade celular é imperativo para a propagação de células cancerosas, a sugestão de que a PRL esteja envolvido na manutenção deste processo implica ainda mais esta proteína na doença.

Uma redução na viabilidade celular foi no entanto também notado entre não-transfectadas e amostras de siRNA-SCR em células HeLa (dados não mostrados) e o reagente de transfecção DharmaFECT® 1 mostrou ser o agente causador desta redução (ver dados complementar – Figura S1).

para investigar se a apoptose (uma forma de morte celular programada) foi induzida em pulmão tumorigénico e células de cancro do colo do útero, como consequência da PRL knockdown, e, portanto, sendo responsável pela redução observada na viabilidade celular, foram avaliados possíveis alterações na morfologia nuclear de a célula e o nível de actividade da proteína efectora associada a apoptose – caspase-3 (processos principais indicativos de indução de apoptose [34], [35], [36], [37], [38]). A presença de A549 apoptótica e células HeLa pós-transfecção com ARNsi-LAMR1 foram identificados por perturbações visíveis na sua morfologia nuclear (Figura 4), bem como pelo aumento significativo na actividade da caspase-3 (Figura 5).

o papel da PRL na manutenção da viabilidade celular foi avaliado em estudos anteriores [7], Além disso, a indução de apoptose em células cancerosas em resposta a LRP downregulation também tem sido demonstrada [39]. Este estudo confirmou o papel da PRL na manutenção da viabilidade celular, bem como a indução de apoptose subsequente para o knockdown desta proteína. Além disso, este estudo revelou que a indução de apoptose é mediada por tanto uma perda de integridade nuclear e significativamente o aumento da actividade da caspase-3 nestas células.

Uma vez que o receptor de laminina é fisiologicamente funcional no compartimento perinuclear [ ,,,0],7], [12], [13] e o núcleo [12], [13], que não foi surpreendente que o knockdown deste receptor iria afectar a integridade do núcleo. Tanto o rompimento da morfologia nuclear e o aumento da actividade de proteína associada a apoptose, caspase-3, são indicativas de apoptose, sugerindo um papel crucial para a PRL /LR no bloqueio desta forma de morte celular. No entanto, a quantificação revelou que 91% de siRNA-LAMR1 tratada células HeLa, mas apenas 56% de siRNA-LAMR1 tratada células A549 revelou alterações morfológicas nucleares (7% e 8% de siRNA-SCR tratada células A549 e Hela, respectivamente, revelou nuclear morfológica alterar). Uma vez que o knockdown de PRL em células HeLa (60%) foi inferior em comparação com células A549 (83%) que propomos que a PRL /LR impede a apoptose numa maior extensão em células de cancro do colo do útero, em comparação com células de cancro do pulmão. Uma vez que 83% das células HeLa, mas apenas 9% das células A549 revelou aumento da caspase-3 actividade a seguir ao tratamento de siRNA-LAMR1, que sugerem ainda que a apoptose em células de cancro do pulmão pode ocorrer predominantemente por meio de caspase-3 mecanismos independentes, tais como EndoG e /ou FIA processos mediados

As funções do LRP /LR na propagação do câncer são numerosas:. aumentou invasão [6], [30], metástase [6], [30] e proliferação celular [7], bem como diminuiu celular viabilidade [7] e a apoptose [39] são mediados por esta proteína. Segmentação LRP /LR pode, portanto, ser desenvolvida como uma estratégia para dificultar os processos acima referidos implicados na progressão do cancro. Além disso, tendo como alvo a PRL /LR para o possível tratamento de tais processos têm sido alcançados num certo número de linhas de células cancerosas. Isto sugere portanto que um /LR terapia relacionada LRP pode potencialmente ser utilizada para o tratamento de numerosos cancros distintos. Deve, contudo, ser salientado que este receptor está envolvido em muitos processos fisiológicos em células normais, incluindo o crescimento celular, diferenciação, movimento e de fixação [9], [11], e o knockdown da PRL nestas células iria resultar em alterações homeostáticas indesejáveis. A segmentação da LRP exclusivamente em células cancerosas é, portanto, imperativo para a sua utilização como uma alternativa terapêutica.

Informações de Apoio

Figura S1.

O efeito de siRNA-scr e DharmaFECT® 1 reagente sobre a viabilidade celular. As células foram incubadas com ARNsi-SCR, DharmaFECT® um reagente ou ambos, e 72 h mais tarde, a viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio MTT. As células transfectadas com ARNsi-SCR exibir viabilidade semelhante, enquanto DharmaFECT® 1 e siRNA-SCR + 1 DharmaFECT® células tratadas exibem uma redução de 8% e 9% na viabilidade celular, respectivamente, em comparação com células de controlo (incubadas durante 72 h em DMEM contendo 10% (v /v) FCS)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0057409.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Uwe Reusch, Stefan Knackmuss e Melvyn pequeno por assistência produção de IgG1-iS18. Agradecemos Dr. Clement Penny para assistência com microscopia de imunofluorescência.