Abstract
A disfunção de Paneth e células caliciformes no intestino contribui para a doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal associado a colite (CAC). Aqui, nós relatamos um papel para o NAD
+ – SIRT1 histona deacetilase dependente no controle da defesa anti-bacteriana. Ratos com uma específica intestinal
Sirt1
deficiência (
Sirt1
int – /-
) têm mais Paneth e cálice células com o consequente rearranjo da microbiota intestinal. De um ponto de vista mecanicista, os efeitos no rato maturação celular intestinal são mediados por alterações dependentes do SIRT1 no estado acetilação da SPDEF, um regulador mestre da Paneth e células caliciformes. Nossos resultados sugerem que a segmentação SIRT1 pode ser de interesse na gestão do IBD e CAC
Citation:. Lo Sasso G, Ryu D, Mouchiroud L, Fernando SC, Anderson CL, Katsyuba E, et al. (2014) Perda de Sirt1 função melhora Intestinal anti-bacteriana Defesa e protege de câncer colorretal colite induzida. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10.1371 /journal.pone.0102495
editor: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck, University of London, Reino Unido
Recebido: 20 de maio de 2014; Aceito: 19 de junho de 2014; Publicação: 11 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Lo Sasso et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. GLS é apoiado por uma associação de saída italiana para Pesquisa do Câncer (AIRC) /Marie Curie Fellowship. laboratório JA KS é apoiada por doações da École Polytechnique Fédérale de Lausanne, o programa Ideias da UE (GMD-231138), o Swiss National Science Foundation (31003A-140780 e 310.030-143.748), o Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 e KFS-2809-08-2011) e NIH (R01AG043930). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Paneth e células caliciformes do intestino delgado são células altamente especializadas epiteliais que sintetizam e secretam peptídeos e muco anti-microbianos. Esses fatores representam a primeira linha de defesa contra patógenos e são essenciais para manter o equilíbrio sutil entre as diferentes espécies de bactérias que colonizam o intestino dos mamíferos [1]. impacto microbiota Dysbiotic sobre a saúde do hospedeiro e contribuir para a patogênese de diversas doenças intestinais, como a doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal associado a colite (CAC) [2].
A diferenciação e maturação de Paneth e células caliciformes é controlada pelas cascatas de sinalização Wnt e Notch que cooperam para promover a especificação das diferentes linhagens de células [3]. Além disso, o SAM apontou domínio contendo o factor de transcrição ETS (SPDEF), um efector a jusante de ambas as vias de Wnt e Notch, é conhecido para melhorar a diferenciação de ambos Paneth e células goblet do seu progenitor comum [4]. SPDEF foi inicialmente identificada como um regulador do antigénio específico da próstata [5], mas também mais tarde associada a mama, pulmão, e epitélio do intestino, com possível envolvimento na progressão do cancro nesses tecidos [6], [7].
Sirtuin 1 (SIRT1), uma NAD
+ – desacetilase dependente [8], está envolvida numa grande variedade de processos celulares, incluindo metabolismo, a proliferação celular e apoptose, e a resposta imune [9]. O papel da SIRT1 na regulação da homeostase intestinal está apenas começando a ser elucidado. Recentemente, um envolvimento de SIRT1 intestinal no metabolismo de ácidos biliares e colesterol sistémica tem sido proposto [10]. Além disso, estudos sobre o papel da SIRT1 no desenvolvimento do cancro colorectal usando Apc
mínimo de ratos /+ como modelo, mostraram resultados conflitantes apoiando tanto tumor promover [11] e supressores de tumor [12], [13] funções.
Usando ratos com um específico-intestinal
Sirt1
exclusão (
Sirt1
int – /-
), mostramos aqui que SIRT1 regula Paneth e cálice maturação celular e produção de proteínas anti-bacterianas. Estes efeitos dependem de alterações mediadas por SIRT1 no estado de acetilação SPDEF. Além disso, intestinal
Sirt1
exclusão tem um grande impacto sobre o microbioma intestinal e protege ratos de IBD e CAC. Notavelmente, os efeitos do
Sirt1
deficiência na produção de proteínas anti-bacterianas são evolutivas conservada em
C.elegans
destacando a natureza antiga desta função de SIRT1. Tomados em conjunto os nossos resultados sugerem que a segmentação SIRT1 podem ser de interesse para a gestão do IBD e CAC
Materiais e Métodos
Geração de Sirt1
int -. /- E Sirt1
int – /- LGR5
camundongos EGFP-IRES-CRE-ert2
Para a geração de
Sirt1
floxed (
Sirt1
L2 /L2
) ratos, DNA genômico que cobre o
Sirt1
lócus foi amplificado a partir da estirpe 129Sv pela fidelidade de alta PCR. Os fragmentos de ADN resultantes foram reunidos para o vector de direccionamento do Institut de la Clinique Ratos (Estrasburgo, França). O construto em que os exons 5, 6 e 7 foram flanqueados por sítios loxP foi então electroporado em células estaminais embrionárias 129Sv (ES) (Figura S1B). colónias resistentes a G418 foram seleccionadas e analisadas quanto a recombinação homóloga por PCR e os clones positivos foram verificados por hibridação de mancha de Southern. Os clones de células ES corretamente alvejados foram injectados em blastocistos e transferidos para fêmeas pseudográvidas, resultando em uma descendência quimérica que foi acoplado a fêmea C57BL /6J que expressam a recombinase Flp sob o controlo do promotor de citomegalovírus ubíqua [14]. Offspring que transmitiu o alelo mutante e que perdeu o transgene Flp (
Sirt1
L2 /WT
ratos) foram selecionados, e retrocruzado de camundongos C57BL /6J durante dez gerações. Para a análise gut microbiota Sirt1
int – /- e Sirt1
L2 /L2 foram co-alojados em condições livres de patógenos específicos dentro da mesma sala. Ratos tratados com AOM /DSS foram alojados individualmente após o desmame para evitar diferenças na ingestão DSS. No entanto, Sirt1
int – /- e Sirt1
L2 /L2 foram tratados em condições livres de patógenos específicos dentro da mesma sala. Notavelmente, Sirt1
int – /- e SIRT1
L2 /L2 ratos vêm dos mesmos pais. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e suíços e aprovado pelas autoridades cantonais do cantão de Vaud. Além disso, todas as experiências com animais foram conformes à legislação suíça Animal Welfare e revisado pelo Conselho de Ética Estado do Cantão de Vaud (Animal Welfare Act de 2005; Projeto Licença N ° 2463-2463.1-2605 licença para Prof. Johan Auwerx). Finalmente, toda experiência com animais foram aprovados pelo Estado independente de Vaud Veterinário placa de ética, que age em conformidade com o Animal Welfare Act, as diretrizes internacionais AAALAC, a legislação suíça e da UE. Os ratos foram submetidos à eutanásia com uma breve exposição ao CO
2. Este método leva à asfixia rápido e indolor em camundongos. Todos os experimentos foram realizados a partir de outubro de 2011 a abril de 2014.
Os plasmídeos
Mammalian vetor de expressão Puse-SIRT1 foi comprado de Upstate. A sequência de codificação SPDEF pertence ao rato Factor de Transcrição de Recursos [15]. Foi amplificado e ligado a pcDNA3-FLAG ou pGEX-GST. pCruzHA SIRT1G261A (plasmídeo 10963) [16] e pGL2Basic-EcadK1 (plasmídeo 19290) [17] foram compradas por Addgene. pGEX-GST SPDEFK294Q foi gerado utilizando mutagénese dirigida.
C.elegans
ensaios
C.elegans
estirpes foram cultivadas a 20 ° C no crescimento nematóide placas de agar mídia (NGM) semeado com
E. coli
estirpe OP50 salvo indicação contrária. Estirpes utilizadas eram do tipo selvagem Bristol N2, VC199
sir-2.1 (ok434)
IV, SAL129 [
pha-1