Abstract

Aim

Evidências recentes sugerem que vários polifenóis na dieta pode exercer o seu efeito quimiopreventivo através de modificações epigenéticas. A curcumina é um dos agentes quimiopreventivos alimentares mais amplamente estudado para a prevenção do cancro do cólon, no entanto, os seus efeitos sobre alterações epigenética, particularmente a metilação do DNA, permanecem obscuros. Usando abordagens sistemáticas do genoma, que teve como objetivo elucidar o efeito da curcumina em alterações de metilação do DNA em células de câncer colorretal

Materiais e Métodos

Para avaliar o efeito da curcumina na metilação do DNA, três. linhas celulares de CRC, HCT116, HT29 e RKO, foram tratados com curcumina. 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-CdR) e tricostatina A células tratadas foram usadas como controlos positivos e negativos para mudanças de metilação do DNA, respectivamente. estado de metilação de LINE-1 elementos repetidos, microarrays metilação do promotor DNA e arrays de expressão gênica foram utilizados para avaliar metilação e de expressão gênica mudanças globais. A validação foi realizada utilizando microarrays independentes, pyrosequencing bisulfite quantitativa e qPCR.

Resultados

Como esperado, microarrays de metilação do genoma revelou hipometilação do DNA significativa no 5-CdR tratados aza células (média p-valores de 0,12), no entanto, as alterações não significativas na média β valores foram observados nas células tratadas com curcumina. Em comparação com células falsamente tratados, alterações da metilação do DNA induzida por curcumina ocorreu de um modo dependente do tempo. Em contraste com a hipometilação mundial generalizada, não específica observada com 5-aza-CdR, curcumina tratamento resultou em alterações na metilação seleccionado, loci parcialmente metilado, em vez de locais CpG metilados totalmente. alterações de metilação do DNA foram apoiados por mudanças na expressão de gene correspondente em ambos os genes cima e para baixo-regulado em várias linhas celulares de CRC.

Conclusões

Nossos dados fornecem evidências previamente não reconhecido para o DNA mediada por curcumina alterações de metilação como um mecanismo potencial de quimioprevenção do câncer de cólon. Em contraste com a hipometilação global de não específica induzida pelo 5-aza-CdR, mudanças de metilação induzida por curcumina ocorreu apenas num subconjunto de genes parcialmente metilados, que dá uma visão mecanicistas adicionais sobre o efeito quimiopreventivo potente deste nutracêutico dietético.

Citation: Ligação A, Balaguer F, Shen Y, Lozano JJ, Leung H-CE, Boland CR, et al. (2013) curcumina modula DNA metilação em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10.1371 /journal.pone.0057709

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 22 de agosto de 2012; Aceito: 25 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fazer a ligação et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente trabalho foi apoiado por subsídios R01 CA72851 e CA129286 do National Cancer Institute, National Institutes of Health, e os fundos do Instituto de Investigação Baylor. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Ajay Goel atualmente atua como membro do conselho editorial para PLOS ONE, no entanto, isso faz não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 10% da mortalidade total relacionada ao câncer [1]. Cerca de 3-5% de todos os CRCs são devidos a defeitos genéticos herdados e até 25% dos pacientes podem apresentar algum grau do família para esta doença, mas a maioria dos CRCs ocorrer de uma forma esporádica, na ausência de uma história familiar documentada. O aumento da evidência indica que, além de fenótipos instabilidade genética, tais como cromossómico e microssatélite instabilidade, alterações epigenética que incluem alterações da metilação do DNA, histonas modificações e alterações na expressão de miARN, podem desempenhar um papel importante na iniciação e progressão da CRC [2] – [ ,,,0],4].

em contraste com defeitos genéticos, alterações epigenética são mais dinâmico e podem ser influenciadas pelo envelhecimento, ambiental, de estilo de vida e factores dietéticos, que se crê desempenhar um papel importante no desenvolvimento de mais de dois terços de todos os cânceres humanos [5] – [7]. metilação aberrante de DNA que consiste de tanto focal

hipermetilação do promotor de ilhas de CpG que resulta no silenciamento transcricional de genes, e global

hipometilação de ADN que facilita a instabilidade cromossómica e aneuploidia, e é um dos mais mais extensivamente estudados eventos epigenéticos no câncer [8] – [11]. Além disso, dado que as alterações de metilação do DNA são potencialmente reversíveis, e muitas vezes precedem os eventos genéticos durante a carcinogênese colorretal várias etapas, proporcionar uma oportunidade emocionante e promissor para a prevenção e tratamento [12] câncer – [17].

Com base neste conceito , terapia epigenética está actualmente a ser explorado, com o objetivo de impedir que células cancerosas de aquisição de metilação do DNA aberrante e ajudando a restaurar os padrões “normais” de metilação do DNA e expressão gênica de genes cruciais relacionadas com o cancro. Por conseguinte, os análogos de nucleósidos, tais como 5-azacitidina e 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-CdR) foram identificados como potentes inibidores da ADN-metiltransferase (DNMT). A incorporação destes análogos de nucleósidos directamente no ADN durante a replicação, bem como proteossomal degradação da enzima que catalisa DNMT1

de novo

hipermetilação constitui dois mecanismos principais que são responsáveis ​​pela sua actividade demetilantes [18] – [20]. Há uma percepção crescente de que a reversão de padrões de metilação de DNA aberrante em células cancerosas podem ser eficazes para o seu tratamento e prevenção [21]. Vários destes análogos de nucleósidos estão actualmente a ser explorado para o tratamento de malignidades hematológicas e estão em ensaios clínicos de fase inicial para outras doenças malignas sólidas; Infelizmente, a grande utilidade destes agentes tem sido dificultada pela toxicidade e efeitos colaterais adversos. Além disso, a não especificidade que permite a hipometilação de genes mundial mesmo totalmente metilado e resulta em instabilidade cromossómica limita o uso destes compostos como potenciais agentes quimiopreventivos [8], [10]. Em uma missão para buscar estratégias quimiopreventivos alternativas, vários fitoquímicos têm surgido opções como potencialmente potentes em virtude da falta de perfis de toxicidade significativos [22]. Além disso, os dados sugerem que as perturbações em nutrientes alimentares, tais como ácido fólico e selênio pode afetar a metilação do DNA, tanto

in vitro

e

in vivo

, como resultado de uma inibição da expressão da proteína DNMT1 e enzimática actividade [23]. polifenóis, tais como (-) – epigalocatequina-3-galato (EGCG) a partir de chá verde e de genisteína a partir de soja, também têm sido mostrados para inibir a actividade DNMT em linhas celulares de cancro [24], [25]. atividade inibitória DNMT está associada com desmetilação e reativação de vários genes silenciados-metilação tais como

p16, RARp, MGMT, MLH1, BTG3

e

GSTP1

em células cancerosas humanas, sugerindo um possível efeito quimiopreventivo devido à modificação epigenética induzida por estes vegetais alimentares [25], [26]. No entanto, a eficácia de desmetilação variável de polifenóis permanece pouco compreendida, porque a maioria dos estudos publicados relataram dados para apenas um punhado de genes, e muitos destes efeitos epigenética não foram reprodutíveis em estudos independentes [27], [28].

a curcumina (diferuloylmethane), um composto natural derivado do açafrão tempero (

Curcuma longa

), tem sido utilizado para o tratamento de várias doenças inflamatórias em sistemas indianos e chineses tradicionais da medicina. Nas últimas décadas, um extenso corpo e em profundidade da literatura científica publicada revelou que os efeitos quimiopreventivos de curcumina são mediados por uma variedade de mecanismos moleculares, incluindo a sua interacção directa ou indirecta com vários factores de transcrição, enzimas e proteínas reguladoras que desempenham um papel central em processos relacionados com o cancro chave, tais como a inflamação, proliferação, sobrevivência, migração, angiogénese, invasão e metástase [22]. Evidência para a eficácia da curcumina como um agente anticancerígeno ou quimiopreventivo foi elaborado a partir de centenas de estudos realizados em sistemas de cultura de células, modelos animais e seres humanos [29]. Estudos mais recentes começaram a reconhecer o efeito da curcumina na modulação de processos epigenética em células cancerosas, em que a curcumina foi mostrado ser uma acetiltransferase de histona (HAT) de inibidor [30], [31], bem como um inibidor DNMT1 potencial, o que resulta em hipometilação de vários genes, incluindo RARβ2 em células de cancro do colo do útero [32] – [34]. No entanto, o papel da curcumina como um composto de hipometilação de DNA não foi sistematicamente avaliada como ainda, e o seu potencial de desmetilação não foi reproduzida com sucesso na sua totalidade em outros estudos [32], [33].

Assim , no presente estudo, foi realizada uma análise abrangente e sistemática para investigar o efeito da curcumina na metilação do DNA em células de câncer de cólon. A metilação do DNA Genome-wide analisa e estudos de expressão do gene simultânea de perfis foram realizadas em linhas celulares de CRC tratados com tratamento a curto e a longo prazo a curcumina. Aqui, nós demonstramos que a curcumina modula alterações de metilação do DNA em células cancerosas; Adicionalmente, tais alterações são frequentemente corroborada com correspondentes alterações na expressão de genes. Finalmente, proporcionar novas provas, que em contraste com a hipometilação global induzido por 5-aza-CdR, alterações da metilação do DNA associados com o tratamento de curcumina ocorrer apenas num subconjunto de genes principalmente parcialmente metilados, e de um modo dependente do tempo.

Materiais e Métodos

Cultura celular

Três linhas celulares de CRC humanos, HCT116 (microssatélite instável ou MSI), RKO (CPG Ilha fenótipo metilação ou CIMP) e HT29 (microsatélites estáveis ​​ou MSS ), foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio IMDM (Invitrogen, Rockville MD), sob condições padrão com 10% de soro fetal bovino e 5% de CO

2 a 37 ° C. A autenticidade linha celular foi frequentemente confirmada por análise de vários marcadores genéticos e epigenéticos a cada 6-8 meses.

Tratamento curcumina

A curcumina (Sigma-Aldrich, MO, EUA) stocks foram preparados por dissolução em dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 mM, e pequenas alíquotas foram armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. Para determinar o efeito da curcumina na metilação do DNA, todas as três linhas celulares de CRC foram expostas a 7,5-10 uM curcumina para a curto prazo (6 dias; STC) ou longo prazo (240 dias; LTC) de tratamento. meio de cultura fresco contendo curcumina foi substituído a cada segundo dia, durante o curso do tratamento. linhas celulares de controle sem tratamento curcumina foram cultivadas com cada conjunto de tratamentos para a mesma duração.

5-aza-CdR e Tratamento TSA

tratamento de 5-aza-CdR foi realizada como descrito anteriormente [ ,,,0],35]. Resumidamente, 5-aza-CdR foi dissolvido em PBS (pH 7,5) a 5 mM e pequenas alíquotas foram mantidas congeladas a -20 ° C. Vinte e quatro horas após a sementeira, as células de CRC foram tratadas com 2,5 uM de 5-aza-CdR (Sigma-Aldrich, MO, EUA) durante 24 h, e as células foram colhidas após 48 h. Tricostatina A (TSA) foi dissolvido em etanol a 0,3 uM. As células foram semeadas de forma igual e após crescimento durante a noite foram tratados com TSA, durante 24 h. As células foram sedimentadas e armazenado a -80 ° C até à análise.

MTT Assay Viabilidade

foram determinados os efeitos da curcumina na viabilidade celular num ensaio de MTT, que se baseia na 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) absorção -2,5-. As células (2 x 10

3 /poço) foram semeadas em placas de 96 poços 24 h antes do tratamento curcumina. Depois de 72 h de tratamento curcumina, solução de MTT foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 2 h a 37 ° C. As células foram incubadas com tampão de SDS (10%) com HCl 0,01 M durante a noite e a absorvância foi medida a 570 nm utilizando um espectrofotómetro. experimentos independentes foram realizadas três vezes em triplicado.

Bromodeoxyuridine (BrdU) Ensaio de Proliferação

análises de proliferação celular foram realizadas utilizando a proliferação celular colorimétrico ELISA, kit BrdU (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) seguinte as instruções do fabricante. Resumidamente, 2 × 10

3 células foram cultivadas em placas de 96 poços e tratadas com curcumina durante 72 h. índice de proliferação foi medida por incorporação de BrdU, seguindo as instruções do fabricante. As experiências foram realizadas em triplicado em 3 experiências independentes.

chapeamento Eficiência

Para testar a eficiência do plaqueamento, as células foram plaqueadas a uma densidade baixa, em placas de 6 poços e tratadas com o protocolo de tratamento acima descrito durante 12-16 dias até que as células individuais formado colónias distintamente visíveis. Em seguida as células foram fixadas com formalina a 10% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. Após a lavagem, as placas foram e imagens digitais foram tomadas seco ao ar. experimentos independentes foram realizadas três vezes em triplicado

Extração de DNA, bissulfito de Modificação e metilação Profiling (Infinium metilação Assay)

A extração do DNA foi realizada com o DNeasy Blood Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA genômico foi bisulfite modificado (Kit de Ouro EZ de metilação do DNA, Zymo Research, por favor, adicione cidade /estado), como descrito anteriormente [35]. Para analisar o efeito da curcumina na metilação do DNA, foi realizada de metilação do DNA profiling utilizando o ensaio de metilação Infinium com microarrays HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), que são capazes de analisar simultaneamente o estado de metilação de 27,578 sites individuais CpG cobrindo mais de 14.000 os genes [36]. amplificação do genoma inteiro, rotulagem, hibridação e de varredura foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante na instalação genômica núcleo no Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine, em Houston, TX. estado de metilação foi medida como a razão de sinal a partir de uma sonda metilado em relação a ambos os sinais da sonda metilados e não metilados. rácios de metilação foram extraídos utilizando o Módulos de metilação na Ilumina grânulo Estúdio seguinte normalização média, e o valor quantitativo β-variou de 0 (0% metilação) de 1 (100% de metilação). O valor-p de corte para sinais da sonda detectáveis ​​foi de 0,05. Para as análises de metilação, uma Δβ valor de ≥0.1 (metilação 10%) foi considerada significativa [37].

As análises de metilação quantitativos

Nós validados os dados de metilação de microarranjos por um único gene independente /promotoras ensaios quantitativos de metilação. Dependendo das características de design do ensaio de metilação, foram utilizados quer pyrosequencing bissulfito (sistema pyrosequencing PSQ HS 96A, Qiagen, Valencia, CA) ou em tempo real qMSP base para a metilação de análises quantitativas, como descrito anteriormente [37], [38]. As sequências dos iniciadores utilizados para ambos os métodos são fornecidos na Tabela Suplementar S1.

Gene Expression Análises Microarray

Em paralelo com perfis de metilação, foi realizada a expressão do gene microarray analisa seguindo as instruções do fabricante e um protocolo previamente estabelecido [39]. O ARN total foi isolado utilizando o RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) e amplificado utilizando o kit de amplificação de ARN TotalPrep Ilumina. integridade do RNA foi avaliada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer. Rotulados cRNA foi hibridizada durante a noite para fichas Humano HT12 V3, lavado e digitalizado em um Illumina BeadStation-500. Ilumina BeadStudio da versão 3.1 foi usada para gerar os valores de intensidade de sinal a partir dos exames, subtrair o fundo, e dimensionar cada micromatriz com a intensidade média média para todas as amostras (normalização per-chip). A normalização foi feito usando quantiles com o R-pacote Lumi. Dobrável mudanças foram calculados em relação aos seus respectivos controles, como descrito em outros lugares [35]. análise de caminho Ingenuity (IPA, Ingenuity Systems, Inc. CA, EUA) foi realizada para avaliar und categorização genes diferencialmente expressos em várias vias funcionais.

Análises Estatísticas

Todos os dados foram analisados ​​usando Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, EUA) software estatístico. As diferenças entre os dois grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student. Diferenças entre mais de dois grupos foram analisados ​​por meio de medidas repetidas análise de variância e as comparações múltiplas de Bonferroni como um

pós

hoc teste. Dois valores de p lados de 0,05 foram considerados significativos

Resultados

A curcumina inibe a viabilidade e proliferação celular em linhas celulares de CRC

Estudos anteriores têm fornecido vários níveis de evidência. para os efeitos anti-cancro de curcumina por influenciar a proliferação celular, apoptose, migração e invasão. Para determinar as concentrações eficazes e não tóxicos em curcumina nosso painel de linhas celulares de CRC (Figura 1A) foi realizado primeiro proliferação e viabilidade celular em ensaios de linhas celulares de CRC expostas a várias concentrações de polifenóis presente na dieta. Três linhas de células humanas de CRC que representam epigenotipos distintos de cancros do cólon humanos foram utilizados: HCT116 (microssatélite instável – MSI – linha de células de câncer devido à mutação germinativa no

MLH1, gene de reparo

incompatibilidade), RKO (célula cancerosa MSI linha associado

MLH1

hipermetilação do promotor no contexto do fenótipo CpG ilha metilação do promotor ou CIMP) e HT29 (microsatélites estáveis ​​ou MSS, linha celular com mutante

KRAS-

e

p53

genes) [40]. Os ensaios de MTT e BrdU foram realizadas após o tratamento com quer a curcumina (0-20 | iM) ou DMSO durante 72 h (Figura 1B 1C, respectivamente). Proliferação de linhas de células de CRC foi exponencialmente afectada de uma forma dependente da dose. Enquanto as concentrações de ≥15 uM foram associados com a toxicidade, as meias aproximada máximas concentrações inibidoras (IC

50) de 7,5 uM para HCT116 e 10 uM para HT29 e RKO foram determinadas com base em índices de proliferação celular. Além disso, os ensaios de formação de colónias foram também realizadas ao longo de um período de 12-14 dias (Figura 1D), o que confirmou ainda mais a dose óptima de 7,5 uM para HCT116 e 10 uM para linhas celulares HT29 e RKO, para experiências de metilação de ADN subsequentes.

(A) estrutura química da curcumina: (1

E

, 6

E

) -1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1 , 6-heptadieno-3,5-diona. Os ensaios de BrdU (B) MTT e (C) foram realizadas para determinar a melhor concentração eficaz sub-tóxicos de curcumina. CRC células foram tratadas com a curcumina a várias concentrações durante 72 h (dados representam a média de experiências independentes realizadas em triplicado). (D) Os efeitos anti-proliferativos de longo prazo foram avaliados num ensaio de formação de colónias. As células foram tratadas com a curcumina, durante 12 a 16 dias até as colónias eram visíveis distintos. Imagens representativas de de uma experiência que ilustram os resultados de formação de colónias nos controles (DMSO tratado) e HCT116, RKO e HT29 células cancerosas tratados com curcumina.

A curcumina induz desmetilação do Específico CpG Loci em células CRC

Para analisar as alterações de metilação do genoma associadas ao tratamento com curcumina, usamos microarrays Infinium com mais de 27.000 CpG loci. Em primeiro lugar, nós tratamos RKO (uma linha celular positiva CIMP e altamente metilada CRC) com 5-aza-CdR (um inibidor DNMT) e TSA (um potente inibidor de HDAC) como controlos positivos e negativos, respectivamente. Como mostrado na Figura 2A, um único dia de tratamento com 2,5 ^ M de 5-aza-CdR resultou em desmetilação generalizada de milhares de CpG em loci de células RKO. Em contraste, o tratamento com TSA teve um efeito mínimo sobre a desmetilação de quaisquer locais de CpG. As médias p-valores em células RKO diminuiu 0,39-0,26 após o tratamento com 5-aza-CdR, enquanto nenhuma alteração em valores de p foram vistos com o tratamento de TSA, confirmando assim a especificidade de desmetilação do genoma de vários locais CpG seguintes tratamento com um inibidor DNMT nesta condição experimental.

(a) para o controlo positivo de hipometilação, que trataram células RKO com 2,5 ^ M de 5-aza-CdR. Para o controlo negativo, as células RKO foram tratadas com 0,3 uM de tricostatina A (TSA). (B) três linhas de células de CRC de diferentes fenótipos epigenética foram tratados com concentrações eficazes anti-proliferativas de curcumina (HCT116 7,5 uM, RKO e HT29 10 uM) de 6 e 240 dias. A terapia de curta foi associada com algumas mudanças na metilação do DNA, enquanto que o tratamento de longo prazo com a curcumina resultou em alterações extensivas na metilação de CpG. Para comparar o efeito direto do tratamento sobre o estado de metilação valores Δβ

(βcontrol-βtreatment) foram calculados em conformidade para cada locus CpG. A linha branca representa a ordem ascendente de metilação de CpG loci em /linhas celulares de controlo parental. Os pontos representam a comparação direta dos correspondentes CpG loci ( 27.500) em células tratadas

Para avaliar o efeito da curcumina na metilação do DNA foram utilizados dois modelos de tratamento diferentes:. Primeiro, adotamos uma comumente usado tratamento a curto prazo de células de CRC com a curcumina ao longo de um período de 6 dias [24]. Em segundo lugar, utilizou-se o tratamento de curcumina longo prazo durante 240 dias, um modelo que provavelmente melhor imita o uso de curcumina numa configuração quimiopreventivo em seres humanos, e que foi assumido para melhor representar alterações epigenética induzida por curcumina, em clones de células que sofreram e mantido CpG desmetilação, dada menor atividade da curcumina em comparação com inibidores DNMT disponíveis comercialmente. Para examinar os efeitos da curcumina na metilação de CpG (Figura 2B), foi realizada comparações paralelas entre a curto e longo prazo curcumina tratada linhas celulares de CRC. Em primeiro lugar, nós ordenamos tudo 27.000 CpG loci, a fim de metilação com base no estado de metilação em linhas celulares parentais (pontos brancos que cumulativamente aparecem como uma linha na Figura 2) ascendente, enquanto o correspondente alterações de metilação do DNA, tanto após a curcumina curto e longo prazo tratamentos são representados como pontos vermelhos e azuis, respectivamente. As distâncias verticais de cada ponto da “linha que descreve os resultados a partir das células de controlo” representa o nível de qualquer das hiper- (acima da linha branca) ou hipo-metilação (abaixo da linha branca). Tal como mostrado na Figura 2B, a curcumina tratamento de curto prazo foi associada com alterações relativamente pequenas de metilação em todas as linhas de células de 3, com as correspondentes variações médias de valor β como se segue; 0,389 vs 0,393 para HCT116, 0,388 vs 0,396 para RKO e 0,294 vs 0,291 para HT29. Em contraste, o tratamento curcumina longo prazo foi associado a alterações de metilação mais acentuadas em comparação com células de controlo (Figura 2B), embora a mudança β-valor líquido não foi significativamente diferente (0,399 para HCT116, 0,398 para a RKO e 0,275 para HT29).

a curcumina não induziu global DNA metilação alterações

Para avaliar o efeito da curcumina em alterações globais de metilação do DNA, que implantou duas abordagens independentes. Em primeiro lugar, analisamos o estado de metilação de elementos LINE-1, que servem como marcadores substitutos de metilação global, usando bisulfite quantitativa pyrosequencing [41]. Descobrimos que, após tratamento de curto e longo prazo com curcumina LINHA-1 níveis de metilação eram comparáveis ​​com os controlos não tratados, ao passo que aqueles na 5-aza-CdR tratada linhas celulares apresentaram uma diminuição significativa na metilação LINHA-1 (Figura 3A). Em segundo lugar, usando os dados de matriz metilação Infinium, visualizamos padrões de densidade loci globais CpG usando as parcelas densidade. Como esperado, 5-aza-CdR tratamento foi associada com uma clara mudança da linha de densidade de metilação para o estado não metilado, enquanto não há alterações óbvias nos padrões de densidade de metilação global, foram encontrados em linhas de células de CRC tratados com curcumina – uma observação que é consistente com nossa linha-1 resultados de metilação mostrando uma ausência de mudanças de metilação global induzido por curcumina (Figura 3B).

(A) HCT116, RKO e HT29 foram tratados com 5-aza-CdR e curcumina e lINE-1 metilação estatuto foi determinada utilizando pyrosequencing bissulfito. (B) Para avaliar as mudanças nos padrões de metilação globais, plotagens de densidade foram calculados para os controles, as linhas celulares 5-aza-CdR e tratados com curcumina usando Infinium microarrays de metilação global. Enquanto 5-aza-CdR foi responsável por uma mudança na metilação de CpG em direcção hipometilação, padrão de metilação das células após o tratamento permaneceram inalteradas curcumina. Abreviaturas: 5-aza-desoxicitidina (5-aza-CdR), de curto prazo tratamento curcumina (STC), o tratamento a longo com curcumina (LTC)

Validação de induzida por curcumina de metilação do DNA Alterações no. CRC linhas celulares

Como descrito acima, a exposição a longo prazo a curcumina foi associada a alterações de metilação mais significativas em comparação com linhas celulares de CRC tratados de curto prazo. Assim, para fins de validação, reduzimos o nosso foco sobre os efeitos do tratamento de curcumina longo prazo, utilizando duas estratégias diferentes. Primeiro, foi realizada uma análise independente do genoma metilação microarray (Infinium®), utilizando amostras de DNA modificadas bissulfito independente combinados de linhas celulares de curcumina e controle. Como descrito acima, um Δβ-valor de 0,1 (equivalente a 10% de metilação) foi utilizado como ponto de corte para loci diferencialmente metilada. A Figura 4A ilustra o número de loci diferencialmente metiladas após o tratamento curcumina a longo prazo que foram partilhados entre os dois conjuntos de microarranjos de metilação. No geral, achamos um alto grau de correlação entre as duas experiências (HCT116-LTC: R

2 = 0,9669, p 0,0001; RKO-LTC: R

2 = 0,9508, p 0,0001; HT29-LTC: R

2 = 0,9089; p 0,0001; RKO 5-aza-CdR: R

2 = 0,9569; p 0,0001; RKO-TSA: R

2 = 0,9484; p 0,0001). Assim, confirmou-se que o tratamento curcumina longo prazo foi associada a alterações de metilação do DNA em 1436 loci para HCT116, 814 para a RKO e 3051 para HT29 (Figura 4A). Em segundo lugar, validada com êxito as alterações de metilação em vários loci seleccionado aleatoriamente incluindo

KM-HN-1, PTPRO, WT1

e

GATA4,

utilizando um ensaio qMSP em ambos curcumina e 5-aza-CdR linhas celulares de cancro de cólon tratadas (Figura 4B). Com a excepção de UCHL-1 (β-valor de 0-9), todos os loci validado tinha β-valor entre 0,3-0,8.

(A) Para validar as alterações na metilação do DNA, as amostras foram re -analyzed com um microarray de ADN genómico utilizando Infinium independentemente bissulfito modificado. O número representa o número de CpG loci que apresentaram alterações de metilação CpG com uma Δβ valor de ≥0.1 em ambos os experimentos. 5-Aza-CdR e TSA células tratadas foram usadas como controlos positivos e negativos de validação. (B) quantitativa MSP (qMSP) foi realizada para validar as mudanças de metilação em HCT116. metilação relativa foi calculada por normalização do estado de metilação de curcumina e 5-aza-CdR células tratadas com os controlos. (C) O diagrama de Venn mostra que as mudanças de metilação CpG sobreposição entre HCT116, RKO e HT29 após o tratamento com curcumina.

induzida por curcumina metilação Alterações ocorram de maneira Line-Specific gene- e celular

a seguir, questionou se alterações de metilação de ADN induzida por curcumina observados em nossas experiências são gene- ou célula-line específico. Levando-se em conta as diferenças genéticas e epigenéticas entre várias linhas celulares de CRC analisados ​​neste estudo, foi encontrado em comparações de um-para-um que todos os 3 linhas celulares compartilhados em até 30% CpG loci algum grau de alterações de metilação após o tratamento curcumina. No entanto, observou-se que apenas 68 loci CpG foram hypomethylated em todas as linhas de células 3, sugerindo diferenças específicas de cada linha de células na metilação do DNA induzido por curcumina (Figura 4C). Em seguida, queríamos ver se as alterações de metilação induzida por curcumina são aleatórias, ou se existe um padrão específico para esta modificação epigenética. Para responder a esta questão, uma vez mais dispostos resultados de metilação de todos os 27.000 locais de CpG em ordem crescente, e os cobriu estes resultados com a mudança Δβ valor médio nas células curcumina tratado (Figura 5). Além tanto hipo e hiper-metilação de vários locais CpG associados com o tratamento de curcumina, observou-se um padrão único de mudanças de metilação induzida por curcumina que claramente diferiu da 5-aza-CdR um em todas as linhas de células 3. Como mostrado na Figura 5, enquanto a 5-aza-CdR induzida por hipometilação foi detectada em todos os loci de CpG, o tratamento de curcumina foi associado predominantemente com alterações de metilação em locais de CpG que foram parcialmente metilado, uma observação que suporta uma desmetilação específica para o gene de forma dinâmica metilado loci CpG que são alvos de modificação epigenética induzida por curcumina.

O loci CpG validado das linhas celulares foram ordenados em ordem crescente. A figura representa a magnitude ea localização do afectadas pela curcumina CpG loci em relação ao controle linhas celulares. A curva cinzenta representa a distribuição dos loci de CpG em ordem ascendente. As linhas pretas representam os valores Δβ

(βcontrol-βtreatment) correspondentes as células controle. O tratamento com curcumina foi associada com as duas alterações hiper e hipometilação, predominantemente em parcialmente metilado loci CpG, enquanto 5-azaCdR tratamento foi responsável por hipometilação não selectivo.

induzida por curcumina DNA metilação Alterações associado com alterações correspondentes em Gene Expression

Para entender melhor o significado biológico de mudanças de metilação de DNA induzidos por curcumina, foram analisados ​​os perfis de expressão genética em linhas celulares de CRC, antes e após o tratamento curcumina longo prazo. Para esta análise, foi realizada a análise de correlação entre os resultados de metilação do genoma e os dados de expressão de genes. Nisto, foram selecionados todos CpG loci que teve uma variação metilação de pelo menos 10% (ou um valor Δβ-± 0,1) e uma alteração de pelo menos 1,5 vezes entre o controlo e as células tratadas curcumina expressão. Usando esses critérios, foram identificados 235 genes em HCT116, 108 genes em RKO e 543 em HT29 células (Figura 6). Ingenuity Pathway Análises (IPA) revelou que os genes com alterações de expressão de metilação de DNA de genes simultânea e são frequentemente envolvidos em vários processos regulatórios celulares importantes incluindo drogas ou metabolismo lipídico, o transporte molecular, biologia do câncer, sinalização celular, resposta inflamatória e ciclo celular. Categorias detalhadas de tais genes em células HCT116 são apresentados na Tabela 1. Por conseguinte, os nossos dados sugerem que as alterações induzidas por metilação curcumina tem um impacto directo sobre a transcrição de diversos genes que participam em processos biológicos importantes que podem ser instrumentais no anticancerígeno mediada por curcumina