Sumário

Atualmente, o tratamento para o câncer de ovário implica cytoreductive cirurgia seguida por quimioterapia, principalmente, carboplatina combinado com paclitaxel. Embora este regime é inicialmente eficaz numa percentagem elevada de casos, infelizmente, dentro de alguns meses de tratamento inicial, a recidiva de tumor ocorre por causa da resistência de platina. Isto é atribuído à quimio-resistência das células-tronco cancerosas (CSCs). Aqui demonstramos pela primeira vez que withaferin A (FPA), um composto bioactivo isolado a partir da planta somnifera Withania, quando utilizado isoladamente ou em combinação com cisplatina (CIS) como alvo CSCs putativos. O tratamento de ratinhos nus portadores de tumores de ovário ortotópicos geradas por injecção de linha celular de cancro epitelial de ovário humano (A2780) com FPA e cisplatina (FPA), isoladamente ou em combinação resultou numa redução de 70 a 80% no crescimento tumoral e a inibição completa de metástase para outros órgãos em comparação com controlos não tratados. Histoquímica e análise Western blot dos tumores revelou que a inclusão de FPA (2 mg /kg) resultou numa eliminação altamente significativo de células que expressam marcadores CSC – CD44, CD24, CD34, CD117 e Oct4 e infra-regulação de genes de Notch1, HES1 e Hey1. Em contraste o tratamento de ratinhos com CIS sozinho (6 mg /kg) teve um efeito contrário sobre essas células. Aumento das células que expressam marcadores de CSC e a via de sinalização de Notch1 em tumores expostos ao CIS pode explicar a recorrência de cancro em pacientes tratados com carboplatina e paclitaxel. Uma vez que, WFA sozinho ou em combinação com CIS elimina CSCs putativos, concluímos que WFA em combinação com CIS pode apresentar uma terapia mais eficaz para o câncer de ovário

Citation:. Kakar SS, Ratajczak MZ, Powell KS, Moghadamfalahi M, Miller DM, Batra SK, et al. (2014) Withaferin Uma combinação Sozinho e com Cisplatina suprime o crescimento ea metástase do cancro do ovário por Segmentação Cancer putativo Stem Cells. PLoS ONE 9 (9): e107596. doi: 10.1371 /journal.pone.0107596

editor: Deodutta Roy, da Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de julho de 2014; Aceito: 05 de agosto de 2014; Publicação: 29 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kakar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Confirmo que todos os dados subjacentes aos resultados do meu estudo estão disponíveis gratuitamente no manuscrito

Financiamento:. NIH /NCI CA124630, James Graham Cancer fundos de pesquisa Brown Center, Escola de programa de Pesquisa de Medicina Básico Research Grant. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Surinder Batra é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) continua a ser a principal causa de morte em mulheres entre os cânceres ginecológicos e é a quinta maior causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres nos Estados Unidos [1], [2]. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado devido aos sintomas não específicos, principalmente. Atualmente, o tratamento para o câncer de ovário implica cytoreductive cirurgia seguida por quimioterapia, empregando principalmente combinação de platina /taxano [3]. Embora este regime é inicialmente eficaz numa percentagem elevada de casos (70 a 80%), infelizmente, 70% das mulheres desenvolvem cancro recorrente dentro de poucos meses após o tratamento inicial, como resultado de platina-resistência [4], [5]. Além disso, a cisplatina (CIS) está associada com vários efeitos secundários graves, tais como náusea, vómitos, mielossupressão, hepatotoxicidade, neurotoxicidade, a ototoxicidade e a nefrotoxicidade [4], [6] – [9]. Portanto, a necessidade de novas opções de tratamento que visam células cancerosas e em particular de células-tronco do câncer putativos é obrigatória, quer no cenário de primeira linha ou ainda mais na gestão da primeira e segunda linha do câncer de ovário recorrente.

os nossos estudos anteriores [10], que mostrou uma primeira vez que withaferin a (FPA), um composto bioactivo isolado a partir da planta somnifera Withania, quando utilizado isoladamente ou em combinação com CIS teve um efeito sinérgico tempo e dependente da dose de inibição da proliferação celular e na indução de morte celular, reduzindo assim a dose necessária de cisplatina. Também mostrou que enquanto FPA atinge o seu efeito anti-tumor, através da geração de ROS que conduz a danos no ADN, CIS atinge os seus efeitos, embora a ligação directa com o ADN causando a formação de aductos de ADN. O tratamento combinado também resultou em um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) produção e DNA danos.

WFA tem sido uma parte da medicina tradicional indiana há séculos. Ele está disponível em US over-the-counter como um suplemento dietético e é conhecido o tratamento de vários distúrbios devido à sua actividade anti-inflamatória [11], [12], as propriedades de protecção anti-bacterianos [13], e cardio [14]. Nos últimos anos, FPA tem sido sugerido como um potencial composto anti-cancro mostrado para impedir o crescimento do tumor, angiogénese, metástase e [15], [16], em vários tipos de cancro [17] – [26]. Os mecanismos pelos quais FMA atinge a sua actividade anti-cancro incluem inactivação de Akt e NF-kB [27], para alcançar a apoptose, diminuição da pró-sobrevivência da proteína Bcl-2 [28], G2 /paragem do ciclo celular M [29], [30], geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) [31], [32], a indução de Par-4 [17], a activação de caspase 3 e 9 actividades, danos no DNA [10], a inibição da HSP90 [20], a regulação do FOXO3a e Bim [15] inibição da Notch-1 [33] e regulação para baixo da expressão de HPV E6 e E7 oncoproteínas [19].

O desenvolvimento de resistência aos medicamentos e recorrência de câncer de ovário tem sido um grande problema clínico. Um número de mecanismos de resistência a drogas que induzem têm sido propostos. Ao longo dos últimos anos, tem sido cada vez mais provas de que “células-tronco cancerosas (CSCs)”, são a causa mais importante da progressão do tumor, quimio-resistência e recaída após o tratamento inicial [34], [35]. Primeira evidência para a existência de cancro de células estaminais veio no ano de 1997, com a identificação de células estaminais leucemia [36], [37]. No ano de 2003, Al-Hajj et al. [38] demonstrou experimentalmente a origem de células-tronco hierárquica no cancro da mama. No entanto, até recentemente a existência de células-tronco cancerosas putativos dentro de tumores sólidos havia permanecido controversa [39]. Em estudos recentes utilizando modelos murinos para o cérebro, pele e tumores intestinais, três grupos independentes forneceram evidências convincentes para a existência de CSCs em tumores e seu papel na expansão do tumor [40] – [42]. Assim, CSCs dentro massa tumoral submeter a auto-renovação e dar origem a linhagens de câncer heterogêneos que compõem o tecido do tumor. CSCs purificados de acordo com alguns marcadores de superfície são capazes de formar tumores quando injectadas em ratinhos nus [36], [43], [44]. Uma vez que, de cancro do ovário é muito heterogênea; diferentes marcadores de superfície celular têm sido relatados para os CSCs ovarianos putativos. Mais comumente relatados incluem CD24, CD34, CD44, CD133, CD117, ALDH1, Oct4, MyD88 e EpCAM [45] – [53]. Uma vez que, CSCs são consideradas como principais jogadores responsáveis ​​pelo desenvolvimento de resistência aos medicamentos e, portanto, levando a recorrência do câncer [52], [53], visando CSCs e inibindo a sua auto-renovação vai levar a redução do crescimento do câncer [33].

no nosso estudo, mostramos pela primeira vez que FPA sozinho ou em combinação com CIS, se utilizados para tratar os ratinhos portadores de tumores ovarianos ortotópicos humanos não só suprime o crescimento de tumores, mas tem como alvo as células expressam marcadores de CSC, bem como inibe Notch1 e os seus genes a jusante de sinalização (HES1 e Hey1) que foram relatados a desempenhar um papel crucial na auto-renovação e manutenção de CSCs (33).

material e Métodos

cultura

linha celular ea célula

a linha de células de cancro epitelial do ovário A2780 foi inicialmente obtida a partir de Denise Connolly (Fox Chase Cancer Center) e foi mantida em meio RPMI 1640 contendo insulina e suplementado com penicilina /estreptomicina (100 IU /mL e 100 ug /ml) e soro fetal bovino a 10% (FCS) (Hyclone, Atlanta, GA), tal como descrito anteriormente [10].

migração de células os ensaios de câmara de Boyden

migração celular in vitro foi testada por determinação da capacidade de células para migrar através de uma membrana basal sintético. O procedimento utilizado foi conforme descrito anteriormente [54]. Resumidamente, filtros de policarbonato (8 uM) foram colocados na câmara de Boyden modificada. células A2780 em fase log foram tripsinizadas e semeadas em 6 poços placas. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas com FPA e CIS tanto isoladamente como em combinação, tal como descrito anteriormente [10]. Após 24 h de tratamento, as células foram tripsinizadas e suspensas em meio livre de soro. Um total de 2 x 10

5 as células foram transferidas para a câmara de topo. O meio contendo FBS a 5% foi adicionada à câmara inferior. As células foram incubadas a 37 ° C durante 24 h e deixadas migrar através da membrana. As células que não migraram foram removidos com um cotonete de algodão limpo. As células migradas no outro lado da membrana foram coradas com violeta de cristal e contadas três campos diferentes sob microscópio Olympus. As experiências foram repetidas três vezes. Os valores representados são a média ± SEM de três experiências independentes.

A geração de tumores ovarianos ortotópico em murganhos nus e tratamento com FPA e CIS tanto sozinho e em combinação

tumores ovarianos foram gerados por ortotópico injetando ovário linha A2780 célula cancerosa diretamente no ovário como descrito por Nunez Cruz et al. [55]. Resumidamente, células A2780 (1 × 10

6) As células foram directamente injectado no ovário esquerdo de 5 a 6 semanas de idade nu /nu fêmea (Jackson Laboratory), sob condições assépticas e sob anestesia leve. Depois de 10 dias de pós-injecção de células, os murganhos foram tratados com 1) controlo de veículo (DMSO a 10% e 90% trioctanoato de glicerilo), 2) FMA 2 mg /kg, 3), CIS 6 mg /kg, e 4) FMA 2 mg /kg mais CEI 6 mg /kg. Cinco animais foram aleatoriamente incluídos em cada grupo. CIS em salina foi injectado i.p. uma vez por semana, i.p. enquanto WFA foi injectado qualquer outro dia. Após 4 semanas de tratamento, os animais foram sacrificados; tumor e outros tecidos tais como o do ovário injectados-un, pulmão, rim, fígado, supra-renal e coração foram recolhidos a partir de cada ratinho. Os tumores foram ponderadas no momento da coleta. Os tumores e outros tecidos foram divididos em duas partes, uma parte foi congelado rapidamente, e a segunda parte foi fixada em formalina a 10% tamponada. experimentos dos animais foram aprovados pela Universidade de Louisville, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) (protocolo nº 12063).

formalina tumor fixo e tecidos foram processados ​​e embebidos em parafina utilizando protocolos padrão, como descrito anteriormente [56]. Cinco secções de um de espessura dos tumores e tecidos embebidos foram preparadas e coradas com hematoxilina e eosina (H E). Seções em triplicado foram examinadas ao microscópio e fotografados. A análise de secções Histopatholoigcal foi realizada por um patologista treinado Dr. Mana Moghadamfalahi.

A imuno-histoquímica

formalina parafina e fixado tecidos embebidos foram desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série gradual diminuição de etanol como descrito previamente [ ,,,0],56]. Os cortes foram aquecidos a 95 ° C em citrato de sódio 10 mM (pH 6,0) durante 20 min, arrefecida até à temperatura ambiente e depois lavadas em PBS. As secções foram incubadas com 0,3% de peróxido de hidrogénio em metanol durante 10 minutos à temperatura ambiente para matar a peroxidase endógena seguido de duas lavagens em PBS (5 min cada), e foram bloqueadas com soro de cabra normal, utilizando reagentes de kit ABC da Vector Laboratories durante 60 min à temperatura ambiente, seguindo as instruções do fornecedor. A solução de bloqueio foi removida por drenagem e as secções foram incubadas com um anticorpo específico, com diluição adequada de acordo com as instruções dos fornecedores, a 4 ° C durante a noite numa câmara humidificada. Os anticorpos para CD24 (Cat # SAB14202713), CD44 (Cat # SAB1405590), CD117 (Cat # SAB4300489) e Oct4 (Cat # P0873) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich, e anticorpo para CD34 foi obtido (Cat # SC-19587) de Santa Cruz Biotechnology. Após lavagem as secções três vezes (5 minutos cada) com PBS, as secções foram incubadas com biotinilado anti-coelho (para anticorpos policlonais) ou anti-rato (para anticorpos monoclonais) a partir dos kits de ABC (Vector Laboratories) à temperatura ambiente durante 45 min seguida por incubação com estreptavidina. Após três lavagens (5 min cada) com PBS, as secções foram incubadas com 3,3′-diaminobenzidina (DAB, Sigma), para desenvolver cor. As secções foram examinadas sob Nikon Elipse E400 microscópio e fotografados.

isolamento de proteínas e análise western blot

células A2780 foram semeadas em placas de 6 poços. Após 24 h de cultivo, as células foram tratadas com FPA e CIS tanto isoladamente como em combinação, tal como descrito anteriormente (10). Depois de 48 h de tratamento, as células foram lisadas em tampão de lise arrefecido [Tris-HCl 50 (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de NP-40, de Na 1 mM de

3VO

4, e NaF 1 mM ) suplementado com Mini completa do comprimido inibidor de protease (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Para preparar um extracto a partir de tecidos normais e tumorais, tecidos foram suspensos em tampão de lise e homogeneizados em gelo utilizando um homogeneizador Polytron seguido por centrifugação a 10.000 rpm durante 5 min. Os sobrenadantes foram recolhidos e a concentração de proteína em cada amostra foi determinada usando o método de Bradford (BioRad Laboratories) de acordo com as instruções do fornecedor. Quarenta ug de proteína de cada amostra foi fraccionado em géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose como anteriormente descrito [56]. O bloqueio de proteínas não específica foi realizada por incubação das membranas com 5% de leite em pó magro em solução salina tamponada com Tris Tween-20 (TBST) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com um anticorpo específico, com a diluição adequada, tal como sugerido pelos fornecedores. Anticorpo para Notch 1 (Cat # N6786), Hey1 (Cat # SAB1404975) e β-actina (cat # A3854) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich, e o anticorpo para HES1 (Cat # SC-165996) foi obtida a partir de Santa Cruz Biotechnology. As membranas foram lavadas três vezes (5 min cada) com TBST, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1:5,000) em TBST. As membranas foram lavadas três vezes (5 minutos cada) com TBST e as bandas imuno-reactivas foram visualizadas por quimioluminescência aumentada. As membranas foram despojado fora por 10 min com metanol contendo 3% H

2O

2 e sondado com anticorpos β-actina, a fim de servir como um controlo interno.

A análise estatística

a comparação estatística dos dados foi realizada pelo teste t de Student (para comparação single). Probabilidade de p 0,05 determinadas a partir do teste de dois lados foi considerado significativo. A análise estatística foi realizada usando o software SPSS 10.0.

Resultados

WFA /combinação CIS inibe a migração celular in vitro

Vários passos estão envolvidos na progressão tumoral e metástase, incluindo destacamento das células de tumor a partir do local do tumor primário, transmigração em vasos sanguíneos ou lymph-, anexo ao endotélio em locais distantes de metástase, seguido de sementeira em nova localização e a expansão subsequente. Para examinar o efeito da WFA e CIS sobre a migração de células A2780, nós tratamos as células A2780 com WFA e CIS sozinho e em combinação para 48 h. Como mostrado na Fig. 1, pelo emprego de Boyden câmaras verificámos que o tratamento de células com FMA ou cis sozinho inibiu a migração celular de um modo dependente da dose, em comparação com células de controlo não tratadas. Embora o tratamento de células com 20 uM CIS inibiu a migração de células, a adição de FPA (0,5 uM ou 1,5 uM) para CEI resultou num aumento de inibição da migração de células, sugerindo que o FPA combinado com CEI é mais eficaz do que cada agente empregue.

células A2780 foram tratadas com diferentes concentrações de WFA e CIS sozinho e em combinação para 48 h. As células foram tratadas com tripsina e sujeitas a migração de células usando câmara de Boyden. As células foram coradas com violeta de cristal e fotografado (A). As células coradas foram contados sob microscópio usando três diferentes áreas; os valores apresentados são média ± SD de três experiências independentes. * Representa significativa comparado com o controlo na p £ 0,05 (B). Con = controle, W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são? M.

WFA /combinação CIS suprime o crescimento de tumores e metástases em ratinhos nus

Em nossos

in vitro

estudos, mostrou que o tratamento de linhas de células sensíveis CIS-(A2780 e CaOV3) bem como linha de células-CIS resistência (A2780 /CP70) com FPA e CIS tanto sozinho e em combinação inibiu a proliferação de células em um tempo e dose-dependente forma e a apoptose celular induzida e danos no ADN. Além disso, o efeito combinado da WFA e CIS foi sinérgica [10]. Para avaliar a eficácia da combinação FPA /CIS sobre o crescimento tumoral e metástases in vivo, testou-se o efeito de FMA e CIS tanto sozinho e em combinação sobre o crescimento de tumores e metástases em ratinhos nus portadores de tumores de ovário humano inoculadas ortotópicos. Murino tumores ortotópicos foram estabelecidas através da injecção de células A2780 directamente no ovário esquerdo de 5 a 6 semanas de idade nu /nu fêmea. Começando a partir do dia 10 após a inoculação de células tumorais, os animais foram tratados com FPA e CIS tanto sozinho e em combinação tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Após 4 semanas de tratamento, os animais foram sacrificados. Observamos que os animais de controlo falsamente tratados desenvolveram tumores altamente vascularizadas e grandes (Fig. 2). Ao mesmo tempo, com 4 de 5 FPA (2 mg /kg) tumores animais tratados isoladamente desenvolvidos que eram significativamente menores em tamanho. Da mesma forma, em 3 de 5 animais tratados com cis (6 mg /kg) desenvolveu tumores que eram significativamente menores em tamanho quando comparados com os controlos falsamente tratados. Além disso, o tratamento dos animais com FMA (2 mg /kg) em combinação com CIS (6 mg /kg) resultou numa redução de 70 a 80% em peso do tumor em comparação com animais de controlo não tratados (Fig. 2) e de 5 ratinhos, única três ratinhos desenvolveram tumores. Não foram observadas diferenças significativas no peso do tumor em ratos tratados com WFA e CIS isoladamente ou em combinação (Fig 2)

A:. 1 × 10

6 células A2780 foram injetados ovário feminino mouse. Depois de 10 dias de pós-injecção, os ratinhos foram tratados com FPA e CIS tanto sozinho ou em combinação, durante quatro semanas. Os ratinhos foram sacrificados; Os tumores foram excisados ​​para fora, fotografado e ponderados. Os tumores apresentados são representativos de cada grupo. B: peso Tumores foi representada graficamente a partir de cada grupo. A linha horizontal representa o peso médio de cada grupo. grupo tratado apresentaram peso significativamente menor do que os ratos não tratados. Os resultados são a média (linha vermelha) e ± SD (barra vertical). * Representa significativa em relação ao controle em p≤0.05

H . E a análise histo-patológico de ovários injetou-un opostos, fígado e pulmões mostrou metástase para o fígado e ovários em animais tratados mock- única . células metastáticas compreendida ~ 10% de células nesses órgãos (Fig. 3). Em contraste não foram observadas metástases no WFA e CIS grupos tratados. Estes resultados sugerem que a combinação de baixa dose de FPA (2 mg /kg) com uma dose sub-óptima de cis (6 mg /kg) é altamente eficaz na supressão do crescimento de tumores e metástases de tumores ovarianos ortotópico em murganhos nus. Isto indica que seria possível reduzir a dose terapêutica da CEI, quando combinado com FMA em seres humanos para melhorar os efeitos colaterais associados com alta dosagem de CIS.

Os ratinhos foram tratados com FPA e CIS, conforme indicado na Figura 2. Os tumores e outros tecidos secções foram coradas com H e e examinados por um patologista qualificado. Metástase (indicado pelas setas) foi observada em ovários e fígado injetados-un e representam aproximadamente 10% das células.

WFA sozinho ou em combinação com CIS elimina as células-tronco do câncer putativos em tumores de ovário ortotópicos

Chemo-resistência e recorrência de câncer de ovário é um problema grave e causa da morte. Nos últimos anos, um conceito de CSCs em cancros sólidos incluindo os cancros do ovário, foi proposto [57], [58]. CSCs têm sido relatados para ser responsável por quimio-resistência, o crescimento do tumor e a recorrência de cancro após tratamento. CSCs putativos foram relatados como células cancerosas iniciadores capazes de desenvolver tumores quando injectadas em ratinhos nus [57]. Para testar se FPA quando utilizado isoladamente ou em combinação com Objectivos da CEI CSCs, foi realizada a análise imuno-histoquímica dos tumores recolhidos a partir dos animais e os animais falsamente tratados tratados com FPA e CIS tanto sozinho e em combinação com os anticorpos para marcadores expressos por CSCs putativos incluindo CD44, CD24, CD34, CD117 e Oct4 [56]. Como mostrado nas Figs. 4-6, observou-se ~10-20% de células positivas para CD44, CD24, CD34, CD117 e Oct4 em tumores recolhidos a partir de animais não tratados. No entanto, o tratamento dos animais com FMA (2 mg /kg) resultou numa redução altamente significativa no número destas células. Em contraste, o tratamento dos animais com CIS sozinho a uma dose de 6 mg /kg resultou em aumento significativo em CD44, CD24, CD34, CD117 e outubro 4 células positivas (60%) (Figs. 4-6). Mais importante ainda, o tratamento de animais com FMA em combinação com CIS (6 mg /kg) reduziu significativamente o número de células que expressam marcadores CSC.

Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes. W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são mg /kg.

Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes. W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são mg /kg.

Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes. W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são mg /kg.

WFA sozinho ou em combinação com CIS regula para baixo a expressão de marcadores relacionados com a CSC

Para confirmar nossa análise imuno-histoquímica do CD44, células positivas de CD24, CD34, CD117 e Oct4 em tumores ortotópicos, foi realizada a análise de Western blot dos extractos de tumores usando anticorpos específicos para os marcadores detectados por coloração imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 7, a expressão de CD24, CD34, CD44, e antigénios Oct4 foi significativamente regulada para baixo em tumores de animais tratados apenas com FPA, em comparação com os tumores de animais falsamente tratados. Em contraste, foi observado aumento significativo na expressão de CD24, CD34, CD44 e Oct4 em extractos de tumor de animais tratados com cis (6 mg /kg) quando comparado com ratos falsamente tratados ou ratinhos tratados com FMA (2 mg /kg) sozinho . Curiosamente, o tratamento dos animais com FMA (2 mg /kg) em combinação com CIS (6 mg /kg) resultou num significativa eliminação de células que expressam os antigénios CD44, CD24, CD34 e Oct4.

beta-actina foi usado como um controlo interno. Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes. Con = controle, W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são mg /kg.

Aumento do número de células que expressam marcadores de CSCs putativos em tumores de animais tratados com CIS como analisado por imuno-coloração, bem como análise de Western blot sugere que tratamento por CIS pode aumentar o número de células que expressam estes marcadores e podem explicar o desenvolvimento de quimio-resistência e recorrência de cancro do ovário em doentes tratados com o CIS ou um seu derivado, tais como carboplatina em combinação com paclitaxel, que são comumente utilizados na quimioterapia. Em contraste eliminação de células que expressam marcadores CSC em tumores por tratamento com FMA sozinho ou em combinação com CIS (6 mg /kg) demonstra que FPA é altamente eficaz na eliminação de células que expressam marcadores CSC.

FPA sozinho ou em combinação com CIS inibe a Notch 1 e os seus genes de sinalização a jusante (HES1 e Hey1)

a auto-renovação, a resistência aos medicamentos e diferenciação são as principais características de CSCs. Sonic hedgehog (Shh), Notch1, TWIST1, Caracol e Wnt1 vias de transdução de sinalização desempenham um papel importante na auto-renovação dessas células [33], [59] – [68]. FPA tem sido relatado para inibir Notch-1 e os genes a jusante de sinalização (HES1 e Hey1) [33], [68]. Notch uma via de sinalização está associada com a regulação do destino celular em vários estádios de desenvolvimento distintas e tem sido implicado na iniciação e progressão do cancro [63], [69], [70]. No nosso estudo, como mostrado na Fig. 8, observou-se inibição altamente significativa da expressão de um entalhe e os seus genes de sinalização a jusante HES1 e Hey1 em tumores recolhidos a partir de ratinhos tratados com FMA (2 mg /kg) quando comparado com tumores de controlo de animais falsamente tratados. Em contraste, os animais tratados com cis (6 mg /kg) mostraram um aumento muito significativo dos níveis de genes de Notch1, HES1 e Hey1. O que é importante, os tumores colhidos a partir de ratinhos tratados com FMA (2 mg /kg) em combinação com CIS (6 mg /kg) mostraram significativa diminuição dos níveis de Notch1, bem como proteínas HES1 e Hey1 (Fig. 8), sugerindo que a regulação negativa de Notch1 sinalização por FPA sozinho ou em combinação com CIS conduzindo a eliminação das CSCs putativos.

beta-actina foi utilizado como um controlo interno. Os dados mostrados são representativos de duas experiências independentes. Con = controle, W = WFA. Os valores mostrados em parênteses são mg /kg.

Discussão

A primeira quimioterapia linha mais comum usado para câncer de ovário após a cirurgia cytoreductive é carboplatina em combinação com paclitaxel. taxa de resposta inicial a esta combinação é muito elevada (70 a 80%), no entanto, dentro de 6 a 20 meses após tratamento reincidência do tumor inicial e os pacientes tornam-se a resistência ao CIS [71]. A resistência ao CIS tem sido associado com o número de mecanismos, tais como aumento dos níveis de glutationa e de metalotioneina, diminuição da absorção da droga, aumento nos mecanismos de reparação do ADN (devido à expressão aumentada de genes de reparação da excisão) e tolerância da formação de aductos de ADN-platina [ ,,,0],72]. Alterações no estado de p53 também tem sido relatada a desempenhar um papel importante na sensibilidade do CIS [73], [74].

Nos últimos anos, vários investigadores relataram uma presença de uma pequena população de CSCs em tecidos de tumor de é responsável pela indução de quimio-resistência e recorrência de cancro [75] – [77]. As evidências convincentes para o papel das CSCs em cancro do ovário foi fornecida por Bapat et ai. [45] que demonstraram a presença de CSCs no nível de célula única nas ascites de uma doente com cancro do ovário, que poderia propagar sequencialmente do tumor ao longo de várias gerações. Consistente com isto, muitos outros investigadores relataram a presença de CSCs em linhas celulares de cancro do ovário, tumores do ovário e tumores dos pacientes associados a ascite [57], [76], [77]. No seguimento destas observações CSCs foram isoladas com base na presença de alguns marcadores extracelulares. makers mais comuns utilizados para CSCs ovarianos incluem CD44, CD24, CD34, CD117 e CD133. CSCs também expressam ALDH1, Oct4, MyD88 e EpCAM [47], [51], [57], [60], [78], [79]. Um aumento no número de CSCs em tumores de ovário correlaciona-se com um mau prognóstico, incluindo sobrevida livre global e as doenças mais curto [80] – [82]. Desenvolvimento de quimio-resistência do cancro do ovário pode ser explicada por enriquecimento para os CSCs [77], [83] – [85]. Em um estudo recente, Abubaker et al. [53] demonstraram utilizando duas linhas celulares de cancro do ovário (OVCA433 epiteliais e mesenquimais) HEY enriquecimento de uma população de células com elevada expressão de marcadores de CSC na proteína, bem como os níveis de ARNm após o tratamento com paclitaxel e CEI, a combinação de ambos. Além disso, estes investigadores mostraram aumento nas propriedades tumorigénicas das células de cancro do ovário, em resposta à quimioterapia. No presente estudo, nós mostramos alguma forma de acordo com esses estudos [53] que o número de CSCs aumenta em animais portadores de tumores ovarianos ortotópicos tratados com CIS a 6 mg /kg. Este aumento na população CSCs em tumores do ovário de ratos com CIS pode explicar o desenvolvimento da quimio-resistência e recorrência de cancro do ovário em doentes tratados com carboplatina CIS ou seu derivado utilizado em combinação com paclitaxel.

Aumento do número de CSCs em tumores inoculados em ratinhos nu seguido de tratamento CIS é resultado da ampliação de CSCs presentes no câncer humano linha de células A2780. Por outro tumor crescendo mão vai atrair células-tronco normais derivados do hospedeiro que irá fornecer estroma e da vascularização para a expansão do tecido tumoral. Essas células poderiam fornecer sinais tróficos para CSCs, e este é actualmente investigados em nossos laboratórios.

Nos últimos anos, uma grande quantidade de esforços tem se dedicado a desenvolver drogas que podem matar células cancerosas, bem como CSCs em ordem para reduzir quimio-resistência e recorrência do câncer após o tratamento. FPA como exposições relatado um efeito inibidor contra vários tipos diferentes de células de cancro. No entanto, o seu efeito sobre os CSCs não foi explorada até agora. No nosso estudo anterior [10], que demonstraram que FPA quando utilizado isoladamente ou em combinação com CIS inibe a proliferação celular e induzem morte celular de ambos CIS-sensível (A2780 e CaOV3), bem como linhas de células resistentes ao CIS (A2780 /CP70) . No nosso estudo de seguimento presente mostra-se que FPA (2 mg /kg) quando usados ​​sozinhos ou em combinação com CEI para tratar a ratinhos portadores do tumor do crescimento do tumor do ovário ortotópico reduzida de 70 a 80% e impedido metástase para outros órgãos. Além disso, o tratamento de ratinhos portadores de tumores ovarianos ortotópicos com FMA sozinho ou FMA + CIS eliminado células que expressam marcadores CSC. (CD44, CD24, CD34, CD117 e Oct4). Em contraste o número destas células como mencionado acima aumentado nas nossas mãos, após o tratamento por CIS sozinho. Assim, os nossos resultados demonstram claramente que a combinação de baixa dose de FPA (2 mg /kg) com uma dose sub-óptima de cis (6 mg /kg) é altamente eficaz na supressão do crescimento do tumor e a eliminação das CSCs putativos “expandida” por tratamento CIS. Uma vez que, dose terapêutica de CIS é de 8 mg /kg [19], WFA em combinação com CIS tem potencial para ser altamente eficaz e terapia eficaz para o câncer de ovário e pode melhorar os efeitos colaterais relacionados CIS-terapia.

Auto- renovação, a resistência aos medicamentos e diferenciação são as principais características de CSCs e várias vias de desenvolvimento, como o sonic Hedgehog (Shh), Notch, Wnt e TGF, twist, e caracol que foram mostrados a ser crucial nestes processos [33], [59] – [67], [86]. FPA tem sido relatado para inibir Notch1 e genes de sinalização a jusante (HES1 e Hey1) [43], [77] que foram implicados na iniciação e progressão [63] do cancro, [69], [70].

no nosso estudo, que mostram uma primeira vez altamente inibição significativa de Notch1 e as suas proteínas de sinalização a jusante HES1 Hey1 e em tumores de animais tratados com FMA (2 mg /kg), em comparação com os tumores de animais falsamente tratados. Em contraste, os animais tratados com cis (6 mg /kg) sozinho mostrou um aumento significativo nos níveis de genes de Notch1, HES1 e Hey1 o que é consistente com o aumento no número de CSCs, sugerindo um papel importante da via de transdução de Notch1 na amplificação daqueles células.