Humana

Abstract

Alguns vírus oncolytic exploit ativada sinalização Ras, a fim de se replicar em células cancerosas. A activação constitutiva da via Ras /MEK é conhecida por suprimir a eficácia do interferão (IFN) resposta antiviral, o que pode contribuir para oncólise virai Ras-dependente. Aqui, foram identificados 10 linhas celulares de cancro humano (de 16) com o aumento da sensibilidade aos efeitos anti-virais do IFN-α após o tratamento com o inibidor de MEK U0126, sugerindo que a Ras /via de MEK subjacente a sua sensibilidade reduzida ao IFN. Para determinar como Ras /MEK suprime a resposta de IFN nestas células, foram utilizados microarrays de ADN para comparar a transcrição induzida por IFN em células SKOV3 IFN-sensíveis, as células HT1080 moderadamente resistentes, e células HT1080 tratada com U0126. Descobrimos que 267 genes foram induzida por IFN em células SKOV3, enquanto apenas 98 genes foram induzidos em células HT1080 no mesmo ponto de tempo. Além disso, a expressão de um subconjunto distinto de IFN genes induzíveis, que incluíram RIGI, GBP2, IFIT2, BTN3A3, MAP2, MMP7 e STAT2, foi restaurada ou aumentada em células HT1080, quando as células foram co-tratados com U0126 e IFN. análise bioinformática dos processos biológicos representados por estes genes revelou uma maior representação de genes envolvidos na resposta anti-viral, a regulação da apoptose, diferenciação celular e metabolismo. Além disso, a introdução de Ras constitutivamente ativo em células SKOV3 sensível IFN reduziu a sua sensibilidade IFN e capacidade de ativar a transcrição induzida por IFN. Este trabalho demonstra, pela primeira vez que a Ras activado /MEK em células de cancro humano induz a regulação negativa de um subconjunto específico de genes IFN-indutível

citação:. Christian SL, Zu D, Licursi H, Y Komatsu, T Pongnopparat , Codner DA, et ai. (2012) Supressão de Transcrição IFN-Induced subjaz Defeitos IFN Geradas pelo activado Ras /MEK em células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10.1371 /journal.pone.0044267

editor: Elankumaran Subbiah, Virginia Polytechnic Institute e State University, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de maio de 2012; Aceito: 31 de julho de 2012; Publicação: 07 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Christian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institutes for Health Research (www.cihr-irsc.gc.ca), números de subsídios MOP74429 e ROP99020. SLC foi apoiado por uma concessão do estagiário do Instituto de Pesquisa do Câncer Hunter Beatrice com fundos disponibilizados pelo Programa de Formação de Pesquisa do Câncer, como parte do programa de treinamento Terry Fox Foundation Strategic Health Research em Cancer Research na CIHR (www.bhcri.ca). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vírus oncolítico replicar especificamente em células cancerosas, mas não em células normais, explorando as diferenças no ambiente intracelular de células de tumor que promove o crescimento celular anormal [1], [2], [3], [4] . A activação constitutiva de sinalização de Ras foi relatado originalmente para ser usado por reovírus oncolítico para aumentar a sua capacidade replicativa [5]. Na sequência da descoberta de oncólise por reovírus, outros vírus, tais como o tipo selvagem de vírus herpes simplex (HSV) [6], vesicular stomatitis virus (VSV) [4], vírus da influenza (estirpe delNS1) [7], adenovirus (VAI mutante) [ ,,,0],8], poliovírus [9], e virus da doença de Newcastle [10] verificou-se de forma semelhante explorar activado via de sinalização de Ras para oncólise. Ras é uma proteína de ligação de GTP ligado à membrana que actua como um interruptor molecular para activar percursos a jusante para regular a proliferação, diferenciação e transformação [11]. Na via de Ras canônica, GTP-bound Ras ativa seu mediador a jusante, a quinase Raf. Activado Raf fosforila e activa depois MEK1 os /2-cinases, que fosforilam e activam a extracelular regulada por sinal quinase (ERK) 1 e 2. ERK1 /2 pode, em seguida, activam ou inibem a transcrição de factores para promover a sobrevivência e proliferação das células [12]. mutações ativadoras de Ras foram encontrados em cerca de 30% de todos os tumores humanos [13]. Além disso, na ausência da mutação de Ras activo, via de Ras activada é frequentemente inadequada por activação dos seus componentes de sinalização a montante, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico, HER2 /neu e Src [14].

múltipla celular mecanismos que estão na base da onc�ise viral dependente Ras foram identificados. A inibição da proteína antiviral quinase activada por ARN de cadeia dupla (PKR) por Ras foi originalmente descrita como um mecanismo importante para a replicação do vírus oncolítico em células tumorais [5], [6]. Também tem sido demonstrado que a Ras activado promove o desencapsulamento e libertação de reovírus oncolítico que aumenta a produção de vírus de progénie [15]. activação Ras também melhora a eficiência da tradução independente de cap do poliovírus oncolytic [9]. Além disso, e um outro grupo relataram que a activação da via de Ras pode evitar a activação efectiva de interferão de tipo I (IFN) a resposta anti-viral nas células humanas cancerosas e células de fibroblastos de rato [16], [17], [18], sugerindo que o defeito de resposta de IFN induzido por Ras activado é um dos mecanismos comuns de oncólise virai.

IFNs são secretadas citocinas que têm vários efeitos no corpo, incluindo papéis anti-viral, anti-proliferativas e imunomoduladores. Como tal, os IFN são utilizados no tratamento de doenças virais tais como a infecção pelo vírus da hepatite C, o tratamento de cancro e esclerose múltipla. IFN liga-se ao receptor de IFN-α (IFNAR) [19], que conduz à activação de duas cinases de tirosina, Janus quinase 1 (Jak1) e tirosina-quinase 2 (Tyk2) que estão associados com o IFNAR [20], [21]. Jak1 e Tyk2 então fosforilar transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT) 1 e STAT2, a qual, em seguida, associar com a proteína de ligação de ADN factor regulador de IFN 9 (IRF9), para formar um factor de transcrição heterotrimérica denominado IFN-estimulada factor de gene 3 (ISGF3) [22], [23]. A ligação de ISGF3 ao elemento de resposta estimulada por IFN (ISRE) nos promotores de genes de IFN-indutíveis induz a expressão de centenas de genes colectivamente conhecidos como genes de IFN-estimuladas (ISG), muitas delas com anti-viral, anti-proliferativo e imunomodulador funções [24]. No entanto, a eficácia de IFN pode ser limitada por proteínas anti-IFN codificados pelos genomas virais ou por eliminadores celulares endógenos que regulam a sinalização de IFN [21].

Anteriormente, foi demonstrado que um vírus sensível IFN, VSV, foi capaz de se replicar em células NIH3T3 com Ras activado /MEK enquanto IFN impediu a infecção de células NIH3T3 de controlo [16]. Noser et. ai. [25] relataram também que a inibição da Ras /MEK em linhas celulares de cancro humano restaurado respostas antivirais induzidas por IFN. Estes estudos demonstram claramente que a activação de Ras /MEK subjacente IFN deficiência em células cancerosas. Em um estudo de acompanhamento, descobrimos que Ras activado /MEK suprimida transcrição de STAT2, que é um dos IFN sinalização componentes essenciais [17]. protecção de IFN-mediada contra a infecção pelo vírus foi apenas parcialmente restaurada em células NIH3T3 transformadas com RasV12 superexpressão de STAT2. No entanto, quando a via de Ras /MEK foi inibida pelo inibidor da MEK U0126 em células RasV12, IFN foi tão eficaz na indução de uma resposta antiviral em células de controlo do vector. Portanto, é pouco provável que a regulação negativa da expressão STAT2 é o único mecanismo envolvido na Ras /MEK supressão de IFN mediado. Aqui, para identificar ainda mais o mecanismo de inibição de Ras-mediada da resposta de IFN, analisamos o envolvimento do /MEK via de Ras na regulação da transcrição induzida por IFN em linhas celulares de cancro humano.

Resultados

Sensibilidade de câncer de células humanas linhas para o antiviral Response

primeiro, foram selecionadas 16 linhas celulares de cancro derivadas de diferentes tipos de tumor (3 mama, 1 cervical, 4 colon, 1 fibrossarcoma, 2 melanoma induzida por IFN , 3 ovário e duas linhas de células de próstata) e medida a sua capacidade de resposta para o efeito anti-viral induzida por IFN. As células foram tratadas com IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1.000 e 5.000 U /ml) durante 16 horas e, em seguida, desafiados com VSV, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 durante 24 horas. O nível global de onc�ise foi avaliada utilizando a coloração violeta cristal. Com base na dose eficaz (efeito citopático (CPE) 50) do IFN, o que é definido como a concentração eficaz de IFN que induz uma protecção de 50% contra a infecção por VSV, as linhas celulares foram divididas em três grupos seguintes: IFN sensível: linhas celulares com CPE50 menos do que 10 U /ml, IFN moderadamente resistente: linhas celulares com CPE50 entre 10 a 5000 U /ml, e IFN completamente resistente: linhas celulares com CPE50 acima da concentração máxima de IFN testadas (5000 U /ml) (Fig . 1). Como mostrado na Tabela 1, três linhas de células (HeLa, SKBR3 e SKOV3) foram sensíveis ao IFN, enquanto 9 linhas de células (A375, DLD-1, HT29, HTB129, HT1080, células MCF-7, MDAH, MDA-MB468 e SW48) mostrou moderada resistência ao tratamento IFN. Em contraste, linhas de células de 4 (DU145, HCT116, LNCaP e PA-1) não respondem ao IFN dentro da gama de concentrações de IFN examinados.

IFN sensível (A), moderadamente resistente (B) e completamente resistente linhas de células (C) foram identificados por células de pré-tratamento com IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 e 5000 U /mL) durante 16 horas e, em seguida, desafiados com VSV a uma MOI de 1 durante 24 horas. A viabilidade celular foi determinada utilizando coloração com violeta de cristal e expressa como percentagem média em comparação com os poços de controlo não infectados (n = 3) poços. Um experimento representativo é mostrado.

Restauração de IFN Sensibilidade por MEK inibição de IFN moderada ou completamente resistentes linhas celulares de cancro

A seguir, determinar se a ativação dos Ras /MEK reduz a resposta antiviral induzida por IFN em IFN moderadamente ou completamente linhas de células de cancro resistentes. sensibilidades IFN das linhas de células foram examinados na presença de um inibidor da MEK U0126. As células foram tratadas com IFN (0, 12,5, 25, 50, 200, 500 e 2000 U /ml) e U0126 (0, 2,5, 5, 10 e 20 uM) durante 16 horas e, em seguida, desafiados com VSV a uma MOI de 1 durante 24 horas. A infecção foi avaliado qualitativamente por análise de Western blot da proteína VSV-G viral. A eficácia de inibição U0126 em MEK foi verificada por análise de fosforilação de ERK, o alvo principal de MEK [13]. inibição de MEK aumentou a sensibilidade de 10 linhas celulares de cancro de IFN (A375, DLD-1, DU145, HCT116, HT1080, HT29, HTB129, MDA468, MDAH e-1 PA) (linhas U0126 células responsiva), mas não teve nenhum efeito no 3 linhas celulares de cancro (LnCap, e MCF7 SW48) (linhas de células U0126 não-responsivos) (Fig. 2 e Fig. S1). Por exemplo, o VSV replicado em células HT1080 na presença de IFN (50 e 200 U /ml) enquanto a replicação do VSV foi inibida em células tratadas com a mesma quantidade de IFN em combinação com o tratamento U0126 (Fig. 2A). células HT1080 também ligeiramente reduzido infecção VSV na presença de 20 uM U0126 sozinho. Do mesmo modo, a resposta antiviral induzida por IFN foi restaurada em HT29, células HCT116 e MDAH quando o /MEK via Ras é inibida por U0126. Em contraste, não se observou a recuperação da resposta antiviral induzida por IFN em qualquer combinação de concentrações de U0126 e IFN em células LNCaP e MCF-7, sugerindo que a sua resistência ao IFN é regulado por outros que não Ras activado /via de MEK factores celulares. A mesma análise foi efectuada para examinar a promoção da resposta antiviral induzida por IFN nas outras linhas de células (A375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, PA-1 e SW48) (Fig. S1).

linhas celulares (a) foram infectadas com VSV (MOI = 1) durante 24 horas após o tratamento com IFN (0-5000 U /ml) com ou sem U0126 (0-20 uM), durante 16 horas. A análise por Western blot foi usado para detectar a proteína virai (VSV-G) níveis, o nível de ERK fosforilada (p-ERK) com GAPDH utilizado como um controlo de carga. As amostras foram analisadas em duas membranas simultaneamente utilizando condições idênticas para a incubação e a detecção. Uma experiência representativa em 3 é mostrado. (B) Produção de descendência virai foi determinada após a infecção com VSV (MOI = 1) durante 24 horas após o tratamento com IFN (50 ou 2000 U /mL) e com U0126 (0, 5, 10 ou 20 uM) durante 16 horas.

A restauração da resposta antiviral por inibição MEK nas quatro linhas de células U0126-responsivos foi confirmada pelo ensaio de vírus progênie (Fig. 2B). células HT1080, infectadas com VSV, mostraram uma redução significativa na produção de descendência do vírus com o tratamento combinado com IFN (50 U /ml) e toda a concentração de U0126 (5, 10 e 20 uM). Além disso, U0126 (20 M) só mostrou uma redução modesta, mas estatisticamente significativa na progênie viral. Nas outras linhas celulares (HT29, HCT116 e MDAH), o tratamento com IFN e U0126 combinados mostraram uma redução substancial e estatisticamente significativo na produção de progênie viral em comparação com IFN única ou U0126 único tratamento indicando maior capacidade de resposta ao IFN sobre a inibição de MEK.

Estes resultados indicam que a activação da via Ras /MEK suprime induzidas por IFN actividades anti-virais em algumas linhas celulares de cancro. Nós não encontrou nenhuma correlação entre uma resposta IFN ou capacidade de resposta U0126, e tipos de células cancerígenas.

Efeito da Ras /MEK inibição em induzida por IFN Transcrição

Para estudar como activado Ras /MEK suprime o IFN resposta em células cancerosas humanas, realizamos análise global expressão do gene e genes identificados com estatisticamente expressão aumentada em comparação com o controle pareado em tempo não tratada (ver informação de apoio [File S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] por listas completas de genes expressos diferencialmente). Em primeiro lugar, em comparação com o IFN expressão de genes induzíveis em células SKOV3 sensível IFN e células HT1080 moderadamente resistente (Fig. 3a). Após a estimulação de IFN durante 6 horas, 267 genes foram regulados positivamente em células SKOV3, enquanto apenas 98 genes foram induzidos em células HT1080. Setenta genes foram induzidos frequentemente em ambas as células SKOV3 e HT1080 enquanto 197 IFN genes indutíveis foram supra-regulada apenas nas células SKOV3 e 28 IFN genes indutíveis somente em células HT1080. Estes resultados demonstram que a transcrição induzida por IFN é suprimida em células HT1080 IFN moderadamente resistentes em comparação com células sensíveis SKOV3 IFN.

diagramas de (A) a partir de análise de Venn de microarranjo de DNA mostrando supressão globais de genes de IFN-regulados em células HT1080 comparado para células SKOV3. Mostram-se o número de genes regulados positivamente de forma significativa (FDR 0,01) a 6 horas após o tratamento com IFN nas linhas de células SKOV3 comparada HT1080. (B) Diagramas de Venn mostra o número de genes regulados positivamente de forma significativa (FDR 0,01) em células HT1080 após o tratamento com IFN, IFN U0126 ou ambos e U0126 durante 6 horas ou 12 horas como indicado. (C) Diagramas de Venn comparando genes regulados positivamente pelos tratamentos “protecção” em cada tipo de célula (IFN por células SKOV3 e IFN /U0126 para células HT1080).

Em seguida, determinar se a inibição de Ras /MEK poderia alterar a resposta transcricional de células HT1080 ao IFN. único tratamento de IFN activado transcrição de 98 genes em 6 horas e 167 genes em 12 horas, enquanto U0126 único tratamento induziu expressão de 636 genes em 6 horas e 97 genes em 12 horas (Fig. 3B). O tratamento combinado de IFN e U0126 transcrição induzida de 652 genes em 6 horas e 354 genes em 12 horas. Estes resultados demonstram que a MEK activada reprime a transcrição induzida por IFN em células HT1080 IFN moderadamente resistentes. Curiosamente, verificou-se 111 genes em 6 horas (Tabela S1) e 135 genes em 12 horas (Tabela S2) foram significativamente induzida pelo tratamento combinado com IFN e U0126, enquanto por si só, quer de tratamento não induziu a expressão, demonstrando verdadeira regulação sinérgica da expressão do gene por supressão de IFN e Ras /MEK. Estes genes incluem mediadores da função anti-virais (por exemplo. Apobec3 [26], IFIT2 [27], [28], [29], RSAD2 (viperin) [30], GBP2 [31] e MAP2 [32], [33 ], [34]), activadores de transdução de sinal de anti-virais, (por ex. RIGI [35]), os reguladores de processamento e apresentação de antigénios (por exemplo. IFI30 (porca jovem) [36], BTN3A3 [37] e PSME1 [38] ), e os reguladores de tumorigénese (eg. MMP7 [39]). Dado que o VSV replicado mais de 30 vezes menos eficientemente em células HT1080 tratados com IFN e U0126, em comparação com os tratados com IFN única ou U0126 única (Fig. 2B), acreditamos que alguns dos genes regulados positivamente pelo tratamento combinado em células HT1080 (111 genes em 6 horas 135 genes em 12 horas) tem uma função anti-viral significativa. Em seguida, compararam os genes induzidos em HT1080 pelo tratamento combinado de IFN e U0126 às que foram induzidas em células SKOV3 apenas por tratamento com IFN para restringir ainda mais que os genes podem ser os genes essenciais necessários para uma resposta de IFN antiviral de protecção (Fig. 3C ). Descobrimos que 36 genes foram geralmente induzida em 6 horas, e 26 genes em 12 horas, nos dois grupos experimentais (Tabela S3).

Gene ontologia (GO) análise foi realizada para determinar o processo biológico associado com os genes identificados como significativamente alteradas em células HT1080 tratados com IFN única, U0126 apenas, e tanto IFN e U0126 (Tabela 2 e Fig. 4). O tratamento com apenas U0126 ou ambos IFN e U0126 por 6 horas agrupadas indicando que estes tratamentos mudou a expressão de genes com funções similares (GO sobre-representação). Da mesma forma, os tratamentos de 12 horas com U0126 sozinho ou o tratamento combinado resultou na GO mais semelhante sobre-representação grupos. IFN-a apenas os grupos de tratamento (6 e 12 horas) agrupados provável porque um relativamente pequeno número de categorias de GO alterado quando comparado com os outros grupos de tratamento. No geral, genes caiu em 312 categorias GO que foram associados com 3 clusters sobre-representação GO, onde o cluster 3 poderiam ser divididos em 11 sub-clusters. Clusters 1, 3A, 3B, 3D e 3I mostraram aumento GO sobre-representação em resposta a U0126 combinada e tratamento IFN em comparação com qualquer tratamento sozinho. Estes aglomerados incluídos GO categorias associadas com a sinalização de NF-kB, a resposta anti-viral, a resposta imunitária, a regulação da apoptose, a sinalização da quimiocina, desenvolvimento celular, e metabolismo. Em contraste, os aglomerados 3C, 3E, 3F, 3H e 3K tinha reduzido categorias GO-sobre-representação mediante tratamento combinado, o que indica que a adição de estimulação de IFN resultou na perda da regulação de genes dos genes pertencentes a GO categorias associadas com a motilidade celular, reparo de DNA e divisão celular. Portanto, a inibição de MEK muda os tipos de genes que podem ser induzidas por tratamento com IFN além de aumentar o número total de genes induzidos.

Os genes com níveis de expressão significativamente regulados positivamente ou regulados negativamente em comparação com o controlo foram analisados ​​quanto sobre-representação de categoria ir em comparação com a observada no genoma. sobre-representados significativamente categorias GO (FDR 0,05) são mostrados com maior FDR = 0 mostrado em vermelho e categorias com FDR ≥0.05 ou ausente mostrado em azul

Em conjunto, estas análises indicam que. a via de Ras /MEK suprime a expressão de ISGs envolvidos na resposta antiviral em vários níveis, incluindo a detecção de padrões de agentes patogénicos associados, a activação da cascata de sinalização anti-viral e anti-genes virais efectoras directas.

Validação de Restauração do IFN expressão do gene induzida pela MEK Inibição

quantitativa de RT-PCR (RT-qPCR) foi realizada para confirmar que as alterações na expressão de genes observadas na análise de microarray utilizando células HT1080 tratados com IFN e /ou U0126 (Fig. 5 ). Oito genes (IFIT2, GBP2, MAP2, Rigi, STAT2, BTN3A3, MMP7 e ID2) foram selecionados com base em suas funções biológicas e alterações de expressão gênica em resposta ao IFN ou tratamento e /U0126. IFIT2, GBP2, MAP2 e MMP7 foram supra-regulada apenas nas células HT1080 tratados com ambos U0126 e IFN a 6 horas, enquanto a indução do gene de IFN foi observada em apenas U0126 e apenas os grupos no ponto de tempo mais tarde (12 horas). BTN3A3 foi induzida pelo tratamento combinado em ambos os pontos de tempo, mas não por U0126 única ou IFN único tratamento. Além disso, a inibição de Ras /MEK por U0126 era capaz de promover a expressão do gene de RIGI e STAT2 em 12 horas na ausência de IFN, conforme descrito anteriormente [17], [40]. Descobrimos que ID2, que não é um gene de IFN-induzível, foi regulado positivamente apenas por tratamento U0126 e o ​​tratamento combinado, mas não por tratamento com IFN. A maioria das alterações na expressão de genes foram confirmadas por RT-qPCR, mas, devido à diferença de sensibilidade e poder estatístico das duas técnicas diferentes, nem todas as alterações do gene foram identificados como estatisticamente significativa em ambas as análises. Por exemplo, RIGI foi encontrado para ser induzida em células HT1080 apenas por tratamento com IFN utilizando RT-qPCR, mas não na análise de microarray.

O nível de expressão de genes em células HT1080 tratados, tratados com IFN (50 U /ml), com U0126 (20 �) ou com IFN e U0126 durante 6 horas ou 12 horas foi determinada por RT-PCR quantitativo. O nível de expressão relativa foi calculada em comparação com o controlo não tratado 6 horas após a normalização em relação aos níveis de expressão de GAPDH. (N = 3, * P 0,01 comparado com o controlo correspondeu a tempo, ** P 0,05 comparado com todos os outros grupos).

Efeitos de activação de Ras na transcrição induzida por IFN em IFN SKOV3 Sensível células

Para examinar melhor a supressão de IFN transcrição por Ras activada, geramos células SKOV3 (sensível ao IFN) que expressam o mutante Ras constitutivamente activo (SKOV3-RasV12; clones 10 e 15). Ras /activação de MEK nas células mutantes foi confirmada por análise de Western blot utilizando anti-ERK fosforilada, e anticorpos ras (Fig. 6A). O controlo do vector células SKOV3 e SKOV3-RasV12 foram tratadas com IFN (0, 12,5, 25, 50 e 100 U /ml) durante 16 horas e, em seguida, desafiados com VSV, a uma MOI de 1. Análise Western blot da proteína VSV-G em 24 horas após a infecção VSV demonstraram que claramente mais eficiente em replicado transformadas com Ras SKOV3 mutantes (clones 10 e 15) do que nas células SKOV3 de controlo na presença de IFN (Fig. 6B). Nós também medidos os níveis de progenia viral 48 horas após a infecção para quantificar o grau de infecção virai (Fig. 6C). De acordo com a análise de Western Blot, verificou-se que a produção de vírus de progenitura foi significativamente maior no mutante SKOV3 transformadas com Ras do que no controle SKOV3 células tratadas com IFN (50 e 100 U /ml). Para determinar adicionalmente se o decréscimo na sensibilidade de IFN pela introdução de Ras activo é induzida pela regulação negativa da transcrição induzida por IFN, analisamos as variações transcrição IFN-induzida de 5 genes (GBP2, IFIT2, MAP2, STAT2 e rigi), os quais que anteriormente identificado para ser regulada negativamente por Ras /MEK em células HT1080 (Fig 5). células SKOV3 A indução de GBP2, IFIT2, MAP2 e RIGI foi inibida nos Ras transformadas em comparação com células de controlo SKOV3 a 12 horas após a estimulação de IFN, enquanto STAT2 indução não foi afectada significativamente (Fig. 7). Estes resultados demonstram que a sinalização de Ras activado suprime a transcrição de determinados genes IFN-indutível que levam à diminuição da sensibilidade celular ao IFN.

(A) análise de transferência de Western utilizando anticorpos anti-Ras, anticorpo ERK fosforilada ou GAPDH para determinar activação de Ras /MEK no controle SKOV3 e Ras transformada SKOV3 (clone 10 e 15). Controlo de células SKOV3 e SKOV3 Ras transformadas foram tratadas com IFN (0, 12,5, 25, 50 e 100 U /ml), e depois desafiados com desafiados com VSV (MOI de 1). A infecção foi avaliada por (B) Análise de Western Blot para a proteína VSV-G e GAPDH em 24 horas de infecção e por ensaio (C) progenitura viral às 48 horas após a infecção.

A expressão de GBP2, IFIT2 , células SKOV3 MAP2, RIGI STAT2 e no controle SKOV3 e transformadas com Ras (clone 15), 12 horas após a estimulação de IFN (0, 12,5, 50 e 100 U /ml) foi determinada por RT-PCR quantitativo. O nível de expressão relativa foi calculada em comparação com as células de controlo não tratadas após a normalização SKOV3 contra os níveis de expressão de GAPDH. (N = 3, * P 0,05 e ** P 0,01 em relação ao controle pareados por concentração de IFN).

Discussão

Como demonstrado anteriormente, a diminuição da resposta de IFN em células cancerosas é considerado um dos mecanismos comuns para onc�ise viral [3], [10]. A activação da via Ras /MEK tem sido relatado para suprimir respostas antivirais induzidos por IFN [4], [16], [17], [25], [40]. Neste estudo, foram pesquisados ​​primeiro um painel de linhas celulares de cancro humano e determinou 1) a sua capacidade de resposta ao IFN na produção de um estado anti-viral e 2) a capacidade do inibidor de MEK, U0126, para restaurar a sensibilidade de IFN. Verificou-se que 13 das 16 linhagens de células testadas foram moderadamente ou totalmente resistentes a resposta anti-viral do IFN. Em 10 destes 13 linhas de células, a sensibilidade ao IFN foi restaurado após tratamento com o inibidor de MEK. Estes resultados sugerem que a via de Ras activado /MEK subjacente a resistência de células de cancro aos efeitos anti-virais induzidas por IFN. Para investigar o mecanismo subjacente para o efeito supressor do /via MEK Ras sobre a resposta IFN, foi realizada análise de expressão gênica global para determinar atividades de transcrição induzida por IFN em IFN SKOV3 sensível e IFN células HT1080 moderadamente resistentes. Verificou-se que houve uma redução substancial no número de genes induzidos por IFN em células HT1080 comparada com a de células SKOV3 (276 genes em células SKOV3, 98 genes em células HT1080, Fig. 3A). Além disso, a inibição de MEK restaurou a capacidade do IFN para activar a sua transcrição em células HT1080, que descobrimos que adicionais 111 genes em 6 horas e 135 genes em 12 horas foram expressos em células HT1080 tratados tanto com IFN e U0126 (Fig. 3B), indicando que Ras activado /MEK suprime a transcrição de um grupo de genes induzidos por IFN. Finalmente, fomos capazes de demonstrar que a expressão de Ras activo constitutivamente em células SKOV3 sensível IFN reduziu a sua capacidade para activar a transcrição induzida por IFN e para estabelecer a resposta antiviral induzida por IFN. Estes resultados demonstram claramente que a Ras activado /via de MEK suprime a transcrição de certos genes de IFN indutíveis para estabelecer insuficiência IFN em células cancerosas humanas.

pode hipótese vários mecanismos possíveis subjacentes para a supressão generalizada da transcrição induzida por IFN- a via de Ras /MEK. 1) Ras /MEK regula a actividade de um co-regulador transcricional para ISGF3, tais como os co-reguladores positivos IRF1 [41], [42], e SP3 [43] ou os negativos co-reguladores de NF-kB [44] e sequência de IFN-consenso de proteína [45] vinculativo. Neste caso, os genes de IFN-indutível que requerem a montante ou a sub-regulação de um co-regulador para a sua expressão seria suprimida em células com Ras activado /MEK. 2) Ras /MEK suprime os níveis de expressão basal dos principais componentes da via de sinalização de IFN. Faltam os níveis de expressão destes componentes leva ao comprometimento global de IFN induzida resposta antiviral semelhante à regulação negativa da expressão STAT2 que observamos nas células NIH3T3 que sobre-expressam constitutivamente activa Ras [17]. 3) a expressão dos genes de IFN-indutível pode ser suprimida por mecanismos epigenética. Por exemplo, a interacção de STAT2 BRG1 com [46], um componente chave da ATP-dependente da cromatina remodelação SWI1-SNF2 complexo de [46], podem alterar a expressão de um subconjunto de genes de IFN-regulados. Apesar de a regulação de BRG1 por Ras não tem sido demonstrada, a regulação negativa da proteína relacionada, Brm1, tem sido relatada [47]. Da mesma forma, a regulação da metilação do DNA [48] ou modificação da histona [49] Ras-mediada, se direcionados para genes IFN-regulada, poderia suprimir globalmente a sua expressão. 4) Finalmente, a via de Ras /MEK pode activar ou regular positivamente os reguladores negativos da via de IFN, tais como SOCS [50] ou [51] PIAS. Estes reguladores negativos podem suprimir a transcrição dos genes induzíveis IFN identificados para ser regulada negativamente por Ras /MEK neste estudo.

Análise dos processos biológicos representados nos conjuntos de genes revelaram que o número de processos biológicos e afectadas pelo IFN U0126 foi maior do que qualquer um ou U0126 IFN sozinho. Além disso, o número de diferentes categorias GO representados era superior às 6 horas em comparação com 12 horas em sozinho quer U0126 ou o tratamento combinado sugerindo que a estimulação de longo prazo limita o número de processos biológicos que podem ser efectuadas pelos genes que são expressos . Como esperado, o IFN foi capaz de regular genes conhecidos para a resposta a vírus e de sinalização de NF-kB, no entanto, o tratamento combinado aumentou a representação de mais categorias GO anti-virais bem como genes importantes para a regulação de citocinas. Além disso, em comparação com o tratamento sozinho U0126, U0126 combinadas e tratamento de IFN reduziu a representação de genes responsáveis ​​pela replicação e reparação do ADN, a regulação do ciclo celular e a motilidade celular. No geral, o tratamento combinado aumentou a expressão do gene de resposta anti-viral /inflamatória em concerto com representação diminuiu de genes que promovem a divisão celular bem sucedida.

Curiosamente, um subconjunto de genes foi induzida normalmente por os dois tratamentos de protecção, o tratamento com IFN em SKOV3 células e tratamento combinado IFN e U0126 em células HT1080 (Tabela S3). Estes genes incluiu o gene C14orf159 que foi recentemente demonstrado que têm a função anti-viral largo, e o MOV10 e genes IFI44 mostrado ter actividade anti-viral mais restrito [52]. Da mesma forma, os membros da APOBEC3 anti-retroviral [53] e uma guarnição [53] famílias de genes foram induzidos por ambos os tratamentos de protecção. IFIT2 foi recentemente demonstrado que têm a função anti-viral [27], [28], [29] e a função anti-proliferativa [54]. Além disso, IFIT2 interage com os microtúbulos [27] sugerindo que IFIT2 podem associar-se MAP2 upregulated-IFN de interferir com a montagem virion e /ou o transporte através da regulação dinâmica dos microtúbulos [32], [33], [34]. Além disso, também identificou genes antivirais críticos, tais como proteínas guanilato vinculativo (GBP) -2 [31] e RIGI [35], que são sinergicamente induzidas em células HT1080 tratados com U0126 e IFN. Portanto, estes dados fornecem uma evidência adicional da importância destes genes para o estabelecimento de uma resposta anti-viral bem sucedida. Estudos futuros procurará identificar as funções precisas desses genes, quer isoladamente ou em combinação, para mediar a resposta anti-viral do protetor do IFN e regulando onc�ise viral.

Não houve correlação entre a origem do tecido do câncer humano as células utilizadas neste estudo e sensibilidade ao IFN ou a capacidade de restabelecer a responsividade ao U0126 IFN.