Abstract

Design Estudo

Para investigar os mecanismos específicos pelos quais Golgi fosfoproteína 3 (GOLPH3) afeta a progressão do cancro gástrico e para explorar o seu significado clínico.

métodos

a análise imunohistoquímica foi utilizada para avaliar as correlações entre GOLPH3, mTOR fosforilada (p-mTOR), fosforilada Akt (p-Akt), p70S6 fosforilada (p-p70S6), fosforilada 4E-BP1 (p-4E -BP1) e as características clínico-patológicas do câncer gástrico. Os níveis de expressão de ARNm de GOLPH3, mTOR, Akt, p70S6 e 4E-BP1 em cancro gástrico, carcinoma de tecido normal adjacente e emparelhado foram analisados ​​utilizando RT-PCR. Western blot foi utilizada para determinar a expressão da proteína de GOLPH3, p-mTOR, P-Akt, p-p70S6 e p-4E-BP1 em tecidos.

Resultados

os níveis de proteína de alta expressão GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p70S6, p-4E-BP1 foram associados positivamente com o grau histológico (

p Art 0,05), profundidade da invasão (

p Art 0,05 ), metástases à distância (

p Art 0,05) e comprometimento de linfonodos (

p Art 0,05). Comparado com carcinoma e os tecidos normais adjacentes emparelhados, os níveis de expressão de ARNm de GOLPH3, AKT, mTOR, e p70S6 4EBP1 em tecidos de cancro gástrico foram significativamente maiores. Os níveis de expressão de proteína de GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p-p70S6 e p-4E-BP1 em tecidos de cancro gástrico também foram significativamente mais elevados do que no carcinoma e os tecidos normais adjacentes emparelhados. Observou-se uma forte correlação positiva entre GOLPH3, p-mTOR, p-p70S6 e expressão p-4EBP1 (

r

= 0,410, 0,303 e 0,276, respectivamente,

p Art 0,05), mas não foi observada correlação significativa entre a expressão de GOLPH3 e P-Akt.

Conclusões

o nível de expressão GOPLH3 está altamente correlacionada com a sinalização de Akt /mTOR em amostras de câncer gástrico humanos. GOLPH3 combinada com a activação de sinalização de Akt /mTOR pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento, diferenciação, invasão e metástases de cancro gástrico

citação:. J Peng, Fang Y, Tao Y, Li K, Su T, Nong Y, et al. (2014) Mecanismos de GOLPH3 Associated com a progressão do câncer gástrico: Estudo Preliminar. PLoS ONE 9 (10): e107362. doi: 10.1371 /journal.pone.0107362

editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

Recebido: 13 de junho de 2014; Aceito: 07 de agosto de 2014; Publicação: 06 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. estão disponíveis a partir do manuscrito e figuras todos os dados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Pesquisa de Tecnologia Apropriada Guangxi Projeto Saúde e Desenvolvimento (número Grant: S201415-01). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora as estatísticas globais mostram que o câncer gástrico (CG) é o quarto tipo de câncer mais comum em homens eo quinto câncer mais comum em mulheres, a mortalidade por câncer gástrico está em segundo lugar apenas para o câncer de pulmão [1]. A incidência mundial de câncer gástrico tem vindo a diminuir desde a Segunda Guerra Mundial [2]. No entanto, nos países em desenvolvimento, incluindo a China, a morbidade e mortalidade do cancro gástrico mantiveram-se elevadas. tratamento do câncer gástrico tem melhorado nos últimos anos, mas a maioria dos pacientes ainda são diagnosticados com câncer gástrico avançado, muitas vezes incluindo invasão e metástases à distância, levando a uma taxa de efeito do tratamento insatisfatório. Como o câncer gástrico apresenta uma ameaça significativa para a saúde humana e da vida, é crucial para compreender a patogênese do câncer gástrico no processo de desenvolvimento de neoplasias, invasão e metástase para orientar o diagnóstico e tratamento precoce.

É comumente aceito que a formação de tumores envolve a desregulação de numerosas oncogenes, genes supressores do tumor e genes relacionados com a metástase de Golgi fosfoproteína 3 (GOLPH3), que também é conhecido como GPP34, GMx33, ou MIDAS, é uma proteína de membrana de 34 kD que foi inicialmente identificada no rato aparelho de Golgi por análise proteômica [3]. GOLPH3 pertence à família de proteínas da matriz de Golgi, que é altamente conservado da levedura para os seres humanos [4]. Após GOLPH3 foi translacionalmente modificado, que é ligado de forma dinâmica para a matriz negativa de Golgi, rapidamente transportado através da rede trans-Golgi (TGN) para o citoplasma, e distribuiu-se em vesículas de membrana de plasma e células endócrinas [4]. Vários estudos têm demonstrado que está envolvido na GOLPH3 anterógrada e tráfico de Golgi retrógrado, a reciclagem do receptor, e de glicosilação a partir do aparelho de Golgi para a membrana plasmática; GOLPH3 também desempenha um papel em interacções e manutenção da estrutura do citoesqueleto de Golgi [4] – [7]. Scott et ai. identificado pela primeira vez o papel oncogênico dos GOLPH3, revelando o seu importante papel na diferenciação de células tumorais e proliferação e sua presença em muitos cancros sólidos [8]. Curiosamente, alguns estudos sugeriram que regula GOLPH3 células cancerosas de mamífero através do aumento da actividade alvo de rapamicina (mTOR). mTOR é uma proteína quinase serina /treonina e um integrador de chave de quinase (RTK-PI3K) Vias 3-fosfatidil-inositol conhecido por regular o crescimento celular, proliferação e sobrevivência em células cancerosas humanas [9] – [10]. Muitos estudos estão actualmente a investigar a relação entre o GOLPH3 e vários cancros sólidos No entanto, não há provas suficientes para apoiar a hipótese de que a expressão GOLPH3 está associada com a progressão humana câncer gástrico e prognóstico, ea base mecanicista pelo qual GOLPH3 afeta a tumorigênese, invasão e metástase do cancro gástrico permanece obscura. Neste estudo, nós investigamos significados clínicos de GOLPH3 e AKT /mTOR sinalização no cancro gástrico. Enquanto isso, nós descobrimos a relação de GOPLPH3 e Akt sinalização /mTOR no câncer gástrico para revelar o papel potencial da GOLPH3 na regulação mediada por mTOR câncer gástrico tumorigênese, invasão e metástase.

Materiais e Métodos

Ethical declaração

Todos os procedimentos do estudo foram revistos e aprovados pelo Institutional Review Board Ética do primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Guangxi e conduzida de acordo com os princípios expressos na declaração de Helsinki. O consentimento informado foi dispensado pelo conselho devido aos espécimes frescos foram tratados e anónimos de acordo com padrões éticos e legais.

As amostras de tecido e dados clínicos selecção

As amostras de tecido fresco foram coletadas de oitenta pacientes com câncer gástrico submetidos ao tratamento cirúrgico no primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Guangxi, no período de janeiro de 2012 a janeiro de 2013. tecidos cancerosos e carcinoma adjacente (3 cm de distância do câncer) e tecidos normais pareados foram obtidos a partir de cada paciente e o paciente foi diagnosticado de forma independente por dois patologistas experientes de acordo com a Comissão americana conjunta sobre critérios de câncer [11]. dados clínicos originais completos estavam disponíveis para pacientes com diagnóstico de câncer gástrico. O grupo incluiu 36 fêmeas e 44 machos, com idade média de 55,4 ± 13,1 anos (variação 27-75 anos). Características adicionais do paciente estão apresentados na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3. Os pacientes que recebem quimioterapia ou radioterapia antes de uma cirurgia ou que tinham uma história de outros tumores foram excluídos. Nos estudos seguintes, uma porção da amostra utilizada durante a cirurgia foi imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido e subsequentemente armazenados a -80 ° C, e uma parte foi fixada em formalina a 10% tamponada, durante 24 h e embebidas em parafina.

imunohistoquímica

espécimes embebidos em parafina foram seccionados em secções de 3 mm de espessura das amostras de tecido canceroso, carcinoma adjacente, e emparelhado normais e montado em vidro slides. As secções foram inicialmente cozida a 65 ° C durante 2 h. Em seguida, as secções foram desparafinadas em 100% de xileno e re-hidratadas numa série descendente de etanol (100%, 90%, 80%, e 70% de etanol) e água destilada de acordo com protocolos padrão. Em seguida, as secções foram embebidos no tampão de recuperação antigénico citrato, aquecida numa autoclave, e deixada arrefecer até à temperatura ambiente. Depois, as secções foram lavadas em PBS três vezes durante cinco minutos, 3% de peróxido de hidrogénio foi adicionado para bloquear a actividade da peroxidase endógena e o antigénio não específico de ligação à temperatura ambiente durante 20 min. Depois de se lavar novamente com PBS, as secções foram incubadas com um anticorpo específico numa câmara húmida durante a noite a 4 ° C. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo GOLPH3 em 1:100, anticorpo p-mTOR em 1:200, anticorpo P-Akt em 1:200, anticorpo p-p70S6 em 1:100, e p-4E-BP1 em um anticorpo :200. Para o controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído com PBS, e os passos restantes foram realizados como previamente descrito. As amostras foram então lavadas com PBS, e um agente de reforço de polímero foi adicionado às secções à temperatura ambiente durante 20 min. Após a lavagem, as secções de tecido foram tratadas com IgG de cabra HRP-anti-coelho etiquetado, a imunoglobulina anti-coelho biotinilado, e peroxidase de estreptavidina reagente complexo durante 30 min. As secções foram então visualizadas em solução fresca 3-3 ‘diaminobenzidina, contrastante com hematoxilina e ácido clorídrico 0,1% (para auxiliar a separação de cores). Finalmente, as lâminas foram montadas na goma neutra e analisadas com um microscópio de campo brilhante

.

O grau de imunocoloração de cada secção de tecido foi avaliada de forma independente por dois patologistas experientes que eram cegos aos dados clínicos dos pacientes. Os níveis de expressão de proteína foram avaliadas usando um sistema de pontuação semi-quantitativa com base na percentagem total de células de tumor coradas positivamente e a intensidade da coloração. A percentagem de células coradas positivamente foi pontuada de acordo com os seguintes critérios: 0 (% ≤5 células tumorais positivas coradas), 1 (células tumorais positivas para 6-25% corados), 2 (células tumorais positivas para 26-50% corados, 3) (células tumorais positivas ≥51% corado). A intensidade da coloração foi classificada utilizando uma escala de 0 a 3 como se segue: 0 (sem coloração), 1 (fraca coloração = amarela clara), 2 (moderada = coloração amarelo-castanho), 3 (= forte coloração castanha). Para a análise, pontuação global 4 foram definidos como baixa expressão, e dezenas ≥4 foram definidos como alta expressão

A transcrição reversa da polimerase reação em cadeia

O RNA total foi extraído de tecidos frescos usando. reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores de RT-PCR utilizados no estudo foram concebidos e sintetizados por Shanghai Sangon Biological Engineering Technology Services Co. Ltd. β-actina foi utilizado como referência interna. As informações sobre as sequências dos iniciadores utilizados no estudo é apresentada na Tabela 4. A RT-PCR foi realizada utilizando um método de dois passos. Um micrograma de RNA total foi transcrito em sentido inverso-cDNA a 37 ° C durante 60 min e 85 ° C durante 5 s. A PCR foi então realizada de acordo com as seguintes condições: aquecimento a 95 ° C durante 5 min; 40 ciclos de desnaturação durante 30 s a 95 ° C, hibridação a 60 ° C durante 30 s, e extensão durante 30 s a 72 ° C; e extensão final a 72 ° C durante 7 min antes da reacção foi armazenada a 4 ° C. Sete microgramas do produto final de PCR foram carregadas num gel de agarose a 2% para electroforese e análise de imagem com luz ultravioleta. O programa de software Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi utilizado para medir as bandas e o valor cinzento β-actina dos produtos de PCR.

Western blotting

As amostras de tecido canceroso, carcinoma que adjacente e emparelhado normais foram pesados ​​e terra em pedaços pequenos em azoto líquido. Pré-refrigerados PBS foi usado para lavar as amostras, as quais foram, em seguida, centrifugadas a 5000 rpm a 4 ° C durante 5 min. Após lavagem três vezes com PBS, foram adicionados pré-gelada de tampão de fosfato de lise e PMSF. A amostra foi sonicada a 180 W, a 4 ° C durante 5 min e centrifugadas a 1000 rpm a 4 ° C durante 5 min; O sobrenadante foi então imediatamente removido, e a concentração de proteína foi quantificado pelo ensaio de Bradford, utilizando um kit comercial adquirido a Bio-Rad Laboratories. Os sobrenadantes foram misturados com tampão de carga e ferve-se a 100 ° C durante 5 minutos para desnaturar as proteínas. Quantidades iguais de cada amostra foram carregadas em poços de um gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida a 4-12%, a electroforese e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada com tampão de BSA a 5% durante 1 h com agitação e depois incubadas a 4 ° C durante a noite com os anticorpos primários diluídos em TBST individuais. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo policlonal de coelho anti-humano GOLPH3 (1:1000, Abcam plc, Cambridge, Reino Unido), anticorpo policlonal de coelho anti-humano de P-p70S6 (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-humano de P-Akt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EUA), de coelho anti-humano monoclonal p-mTOR (Ser2448) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EUA) e de coelho anti-humano monoclonal de P-Akt (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, EUA). A membrana foi então lavada com TBST cinco vezes durante cinco minutos cada, e de cabra de peroxidase de rábano conjugada com IgG de coelho anti-anticorpo secundário (Santa Cruz Biotechnology, sc-2004) foi adicionado antes da incubação à temperatura ambiente durante 1,5 h, com agitação. β-actina foi utilizado como um controlo interno. Depois de se lavar com TBST três vezes durante cinco minutos, a banda de interesse foi detectado utilizando o ECL Prime kit de Western blotting (Xangai Pufei Biotecnologia, Xangai, China), e a Quantidade Um software de análise (Bio-Rad, CA, EUA) foi usada para avaliar os dados de densitometria.

análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa Statistical Package for the social Sciences, versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os resultados de RT-PCR blotting e ocidentais são apresentados como a média ± SE. A ANOVA one-way, seguido por testes de múltipla gama de LSD foi utilizado para analisar as diferenças entre os grupos. As relações entre GOLPH3 e p-mTOR, p-Akt, p-4E-BP, e os níveis de expressão de p-p70S6 foram estimados por meio do coeficiente de correlação de Pearson. As associações entre a expressão da proteína e as variáveis ​​clínico-patológicos foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado. P 0,05 (bicaudal) foi usada como o nível de significância estatística

Resultados

As relações entre as variáveis ​​clínicas e os níveis de expressão de proteína por imuno-histoquímica

Detecção imunohistoquímica. mostrou que GOLPH3, P-Akt, e p-4E-BP1 eram mais comum no citoplasma, e fosforilada de m-TOR (p-mTOR) também estava presente no núcleo a um nível baixo. No entanto, p-p70S6 coloração foi observado apenas no citoplasma. GOLPH3 e proteínas da via /mTOR fosforilados Akt foram mais altamente expressa no grupo cancro gástrico do que o tecido para-carcinoma e grupos mucosa normal emparelhado (Figura 1, Tabela 5). Além disso, as relações entre a expressão variáveis ​​clínicas e proteína foram examinados e estão resumidos na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3. A análise estatística revelou que a taxa de expressão positiva de GOLPH3 no grupo cancro gástrico fortemente correlacionados com o grau histológico (

p

= 0,011), profundidade da invasão (

p

= 0,007), metástases à distância (

p

= 0,002), e comprometimento de linfonodos (

p

0,004), ao passo que não se correlacionou significativamente com a idade ou sexo (

p

= 0,801 e 0,833, respectivamente). Interessantemente, os níveis de expressão elevados de P-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 foram observados como sendo consistente com a expressão elevada GOLPH3

A:. O cancro gástrico grupo B: O carcinoma Adjacente grupo tecido C: O grupo de tecido normal emparelhado. secções de tecido representativo do grupo de cancro gástrico (n = 80), o grupo de carcinoma de tecido adjacente (n = 80) e o grupo emparelhado de tecido normal (n = 80). resultados imuno-histoquímica demonstrou que a GOLPH3, P-Akt, p-mTOR e p-4E-BP1 foram mais expresso no núcleo, o p-p70S6 foi mais expresso no citoplasma. O GOLPH3, fosforilada Akt-mTOR sinalização, p-4E-BP1 e p-p70S6 foram altamente expressa em grupos de câncer gástrico.

expressão de mRNA de GOLPH3 e mTOR sinalização genes relacionados à via por RT-PCR

Foram extraídos RNA de câncer gástrico, o tecido para-carcinoma, e amostras de tecidos normais pareados de oitenta pacientes com câncer gástrico. Os níveis de GOLPH3 e mTOR sinalização genes relacionados com a via, incluindo Akt, mTOR, tradução eucariótica fator de iniciação 4E proteína de ligação 1 (4E-BP1), e proteína p70 ribossomal S6 quinase (p70S6) de expressão, foram avaliadas em três grupos por RT -PCR. Os níveis destes genes no carcinoma gástrico expressão foram maiores do que em tecidos de carcinoma que adjacente e significativamente maiores do que em tecidos normais gástrica emparelhados. A densidade média e a distribuição de GOPLH3, mTOR, Akt, 4E-BP1 e p70S6 expressão são mostrados na Figura 2. A análise estatística revelou que os níveis de GOLPH3 e mTOR sinalização genes relacionados com a via de expressão foram significativamente diferentes em diferentes tecidos gástricos (

p Art 0,05)

câncer:. O grupo câncer gástrico (n = 80); paracancerous: O grupo paracancerous tecido (n = 80); normais: O grupo emparelhado normais da mucosa gástrica (n = 80). A, B, C, D e E: Os níveis de ARNm de GOPLH3, Akt, mTOR, 4E-BP1, p70S6 nos diferentes medido por RT-PCR, respectivamente. F, G, H, I e J: quantificação densitométrica da expressão GOLPH3, Akt, mTOR, 4E-BP1 e p70S6 ARNm em diferentes tecidos, respectivamente. A expressão de ARNm foi significativamente diferente entre si e atingiu um pico de cancro. Os dados são apresentados como a média ± SE. *

p Art 0,05 contra o cancro,

#

p

. 0,05 em relação paracancerous

A expressão de proteínas de proteínas relacionadas via de sinalização GOLPH3 e mTOR por Western blotting

análise de transferência de Western mostrou que GOLPH3, p-mTOR, p-Akt1, p-4EB-P1 e P-p70S6 também foram expressas no cancro gástrico, carcinoma adjacente, e emparelhado mucosa gástrica normais grupos. Curiosamente, um aumento progressivo foi observada nos valores médios dos níveis de expressão de proteína acima mencionados a partir do grupo mucosa gástrica normal, emparelhado com o grupo do cancro gástrico (Figura 3), e não havia uma diferença significativa entre os grupos (

p

0,05)

a:. os níveis de proteína de GOPLH3, P-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 nos diferentes medidos por transferência western. B, C, D, E e F: O GOPLH3, P-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 níveis proteicos nos diferentes tecidos, respectivamente. câncer: O grupo de câncer gástrico (n = 80); paracancerous: O grupo paracancerous tecido (n = 80); normais: O grupo emparelhado normais da mucosa gástrica (n = 80). Os dados são apresentados como a média ± SE. *

p Art 0,05 contra o cancro,

#

p

. 0,05 em relação paracancerous

As correlações entre a expressão de GOLPH3 ea sinalização sinalização proteínas relacionadas às vias

análise de correlação

de Pearson revelou uma forte correlação entre a expressão GOLPH3 e que da via de sinalização (Tabela 6). A análise estatística mostrou que os coeficientes de correlação do momento do produto de Pearson foram todos positivos no grupo de câncer gástrico. Curiosamente, a expressão GOLPH3 foi fortemente associada com p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 e 0,128, respectivamente,

p Art 0,05) expressão e uma correlação positiva entre GOLPH3 e P-Akt foi quase significativo (

p

= 0,054). Entretanto, foram observados fortes correlações entre a expressão de P-4E-BP1 e as proteínas acima mencionados com a excepção de P-mTOR. expressão mTOR fosforilado foi também positivamente correlacionada com a expressão de p-Akt (

r

= 0,521,

p

= 0,027). expressão fosforilada p70S6 também foi correlacionada com a expressão de p-Akt (

r

= 0,274,

p Art 0,001) e p-mTOR (

r

= 0,451,

p

= 0,007).

Discussão

Embora a incidência de câncer gástrico tem diminuído nos últimos anos [2], continua a ser uma séria ameaça para a saúde humana . A maioria dos pacientes com câncer gástrico são diagnosticados em estágios avançados e tendem a apresentar-se com a invasão tumoral e metástase. Durante a última década, não houve grandes melhorias foram alcançados em relação ao diagnóstico precoce e tratamento do câncer gástrico. Uma compreensão do câncer gástrico subjacente biologia molecular ainda está faltando. Desde 2009, GOLPH3 tem recebido atenção considerável como um oncogene. Esta proteína se localiza a face citoplasmática do trans-Golgi e tem sido estreitamente associado a tumorigenicidade [3], [8]. Grandes estudos descobriram que GOLPH3 sobre-expressão ocorre em vários cancros humanos, incluindo o carcinoma epitelial do ovário, carcinoma de células renais, glioblastoma multiforme, carcinoma das células escamosas do esófago, cancro e língua oral [12] – [16]. As evidências sugerem que GOLPH3 está envolvido na tumorigênese e correlaciona-se com mau prognóstico. Além disso, um estudo relatou que a superexpressão GOLPH3 está associada com mau resultado clínico em cancros gástricos [17]. No entanto, os mecanismos exactos subjacentes a esta relação não são claros, e o mecanismo molecular exacto pelo qual GOLPH3 está envolvido na tumorigénese cancro gástrico, invasão e metástase é mal compreendida. Para investigar o mecanismo molecular pelo qual o potencial GOLPH3 está envolvido no câncer gástrico, utilizamos primeira imunohistoquímica para localizar a expressão GOLPH3 em tecidos gástricos diferentes. Descobrimos que GOLPH3 foi primariamente localizada no citoplasma, e foi expressa em cancro gástrico, para-carcinoma e os tecidos normais gástrica emparelhados. Curiosamente, as taxas de expressão elevada GOLPH3 foram 75,00% (60 em 80) em tecidos de cancro gástrico, 43,75% (35 em 80) em tecidos de carcinoma que adjacente e 12,50% (10 em 80) em tecidos normais, respectivamente ( tabela 5). Além disso, GOLPH3 sobre-expressão foi observada em tecido de cancro gástrico e foi altamente relacionadas com a invasão e metástases do cancro gástrico. Nossos resultados sugerem que a alta expressão GOLPH3 foi significativamente relacionado com o grau histológico (

p

= 0,015), profundidade da invasão (

p Art 0,001), metástases em linfonodos (

p

0,001), e metástases à distância (

p

= 0,006) em tecidos de câncer gástrico (Tabela 1). Além disso, a transferência de Western e de RT-PCR foram realizadas para avaliar a expressão GOLPH3 na proteína e os níveis de mRNA. Curiosamente, os resultados foram semelhantes aos observados na análise imuno-histoquímica. As constatações acima indicam que a expressão aumentada GOLPH3 está intimamente associada com a incidência de cancro gástrico, e GOLPH3 podem estar envolvidos na invasão e metástase do cancro gástrico.

Recentemente, um número crescente de vias de transdução de sinal têm sido relatados para ser envolvidas na invasão tumoral e metástases. alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), o que é uma serina /treonina-quinase a jusante do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt sinalização e inclui mTORC1 (mTOR /RAPTOR) e mTORC2 (mTOR /rictor), regula a síntese de proteínas, células a proliferação, a diferenciação e o metabolismo das células [18], [19]. Activado mTORC1 sequencialmente activa directamente alvos a jusante, incluindo p70S6 cinase (S6K) e fator de iniciação eucariótico 4E-proteína de ligação 1 (4E-BP1), e mTORC2 tem mostrado desempenhar um papel crítico na fosforilação de Akt em Ser473, resultando na activação completa de Akt [20], [21]. Embora Akt ativa diretamente mTOR /RAPTOR, pode também activar directamente ou indirectamente a p70S6 cinase /4EBP1 via desta via por fosforilar o TSC2 supressor de tumores [22]. A via Akt /mTOR tem sido mostrado para ser activado frequentemente em vários tumores malignos, incluindo o cancro da mama, carcinoma urotelial, cancro do ovário, tumores neuroendócrinos pancreáticos, meduloblastoma humano, melanoma, cancro do endométrio e de carcinoma hepatocelular; Por conseguinte, esta via representa um possível alvo terapêutico em muitos cancros [23] – [30]. No nosso estudo, a RT-PCR e transferência de Western revelaram que os níveis de mRNA e da expressão da proteína de p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 do grupo de cancro gástrico foram significativamente maiores do que no para-carcinoma tecidos e grupos tecido gástrico normais emparelhados (Figura 2, Figura 3). Para determinar se os níveis de P-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 expressão foram associados com características clinicopatológicas críticos, realizamos análises posteriores. Neste estudo, 81,25% dos 80 pacientes com câncer gástrico teve alta expressão p-mTOR, 77,50% tiveram alta expressão p-4E-BP, 76,25% tiveram alta p-p70S6 expressão, e apenas 75,00% tiveram alta expressão P-Akt (Tabela 5). Surpreendentemente, uma análise imunohistoquímica revelou que os níveis destas expressões expressão de proteína foram significativamente associados com a profundidade da invasão, linfonodo e metástases à distância e grau histológico, mas não foram associados com sexo ou idade (Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3) . Estes resultados sugerem que a via Akt /mTOR é activado no cancro gástrico e pode desempenhar um importante papel na tumorigénese do cancro gástrico, invasão e metástase.

Recentemente, Scott et al. revelou que GOLPH3 pode promover a transformação celular e o crescimento do tumor por constitutivamente de activação da via de sinalização de mTOR em células de melanoma e que GOLPH3 estimula a via de sinalização via mTOR e complexos mTORC1 mTORC2, promovendo assim o crescimento de células tumorais e proliferação [8]. No entanto, não está claro se este fenômeno também ocorre em tecidos de câncer gástrico. Para nosso conhecimento, nosso estudo é o primeiro a explorar a patogênese da GOLPH3 promovido tumorigênese, invasão e metástase de câncer gástrico. Nossos dados mostram uma relação positiva significativa entre a expressão de GOLPH3 e p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 e 0,128, respectivamente,

p

0,05). No entanto, a correlação entre a expressão de GOLPH3 e P-Akt não foi significativa (

r

= 0,258,

p Art 0,05) (Tabela 6). Em particular, significativamente maior expressão GOLPH3 foi acompanhado por uma elevada expressão de p-mTOR, p-4E-BP1, e p-p70S6 em tecidos de cancro gástrico, e esta relação foi significativamente associado com a profundidade de invasão, grau histológico, e nó de linfa e metástases à distância. Nossos resultados revelaram várias relações entre GOLPH3 e proteínas /mTOR sinalização Akt, e a associação positiva entre GOLPH3 e P-Akt foi quase significativo. As causas específicas desta relação entre GOLPH3 e P-Akt não são claras e deve ser investigado. Especula-se que o tamanho da amostra pode ter sido muito pequena. Além disso, pode activar GOLPH3 principalmente o /mTOR via de sinalização de Akt através do mTORC1 activado complexo em vez de o complexo mTORC2, resultando em p70S6 e 4E-BP1 fosforilação, afectando assim o cancro gástrico. Estes resultados indicam que GOLPH3 pode estar envolvido na tumorigénese gástrica cancro, invasão e metástase através da activação anormal da Akt /mTOR via de sinalização.

Em conclusão, este estudo detectados os níveis de expressão elevados GOLPH3, P-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 e p-p70S6 no grupo de câncer gástrico fortemente que se correlacionou com o grau histológico, profundidade de invasão, metástase distante e comprometimento de linfonodos por análise de variáveis ​​clínico-patológico e imuno-histoquímica. Além disso, a expressão de GOPLH3 está altamente correlacionada com a activação da via de sinalização de Akt /mTOR em amostras de cancro gástrico humano. Com base nestes resultados, especula-se que GOLPH3 pode ser afetada progressão e metástase de câncer gástrico através da activação da Akt /mTOR via de sinalização. Além disso, propõe-se que a inibição da expressão de genes na via de sinalização GOLPH3 mTOR e podem representar um novo alvo para a terapia do cancro gástrico. Finalmente, os mecanismos de invasão e migração de GOLPH3 em câncer gástrico ainda precisa de mais investigação.