Abstract

Fundo

A exposição crônica da pele UV leva a defeitos de diferenciação da epiderme em seres humanos que podem ser largamente restaurado por doses farmacológicas de ácido nicotínico. O ácido nicotínico foi identificado como um ligando para o G-acoplados à proteína receptores humanos GPR109A e GPR109B que sinalizam através de G

inibição da adenilil ciclase i-mediada. Nós examinamos a expressão, distribuição celular e funcionalidade do GPR109A /B na pele humana e as células epidérmicas derivadas da pele.

Resultados

O ácido nicotínico aumenta a diferenciação epidérmica na pele humana fotolesionada como julgado pela marcadores de diferenciação terminal caspase 14 e filagrina. Ambos os genes GPR109A e GPR109B são transcritos na pele humana e nos queratinócitos epidérmicos, mas a expressão em fibroblastos dérmicos está abaixo dos limites de detecção. transcrições receptoras são extremamente sobre-expresso em cancros de células escamosas. proteína do receptor na pele normal é proeminente do basal através de camadas granulares da epiderme, com a localização celular mais dispersivo na camada basal, mas predominantemente localizada na membrana plasmática nas camadas epidérmicas mais diferenciadas. Em queratinócitos primários e imortalizados humanos normais, os receptores do ácido nicotínico mostrar a localização da membrana de plasma e funcional L

i de sinalização mediada. Em contraste, num carcinoma de células escamosas linha celular derivada de, proteína de receptor mostra uma localização celular mais difusa e os receptores são praticamente não-funcional.

Conclusões

Os resultados destes estudos justificar futuro genético e os estudos de intervenção farmacológica para definir possível papel específico (s) de receptores de ácido nicotínico na homeostase da pele humana

Citation:. Bermudez Y, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson MK, Jacobson EL (2011) nicotínico ácido Receptor Anormalidades na Human Câncer de pele: Implicações para um papel em epidérmico Diferenciação. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10.1371 /journal.pone.0020487

editor: Christophe egles, Université de Technologie de Compiègne, França |

Recebido: 09 de março de 2011; Aceito: 27 de abril de 2011; Publicado em: 31 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bermudez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694 e HD048837. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. MKJ e ELJ são diretores em NiadynePharma, Inc., cuja pesquisa patrocinada é gerido em acordo com as políticas da Universidade do Arizona de conflitos de interesse.

Introdução

a pele funciona como uma barreira biológica metabolicamente ativo contra agressões ambientais externos. A manutenção da barreira da pele é crítica como muitas doenças dermatológicas são caracterizados pela integridade da barreira defeituosa, resultando em uma capacidade diminuída de protecção da pele. formação da barreira da pele é caracterizada por um processo de homeostasia em que dividem as células na camada basal continuamente migram para a superfície da pele e sofrem diferenciação terminal e morte celular em última análise, prevista para formar o stratum corneum composto de queratinócitos diferenciados terminalmente, e outras substâncias que formam a barreira [ ,,,0],1]. No entanto, a proliferação epidérmica e diferenciação deve ser cuidadosamente equilibrado vez que os resultados de proliferação inadequadas em um afinamento da camada epidérmica da pele e perda de proteção de barreira, enquanto o aumento da proliferação sem coordenar maior diferenciação leva a distúrbios como a psoríase e cânceres de pele [1].

a grande ameaça ambiental, resultando em múltiplas alterações na estrutura e função da pele é a exposição à luz ultravioleta do sol [2]. exposição à luz solar, crônica pode levar à hiperproliferação epidérmica com a diferenciação prejudicada, resultando em queratose actínica lesões (AK) e carcinoma de células escamosas (SCC) da pele. A principal característica histológica da SCC é a substituição dos queratinócitos epidérmicos amadureceu normais com células escamosas atípicas pouco diferenciadas [3]. Mudgil et ai. demonstraram em equivalentes de pele epidérmicos da pele que transformadas, pouco queratinócitos diferenciados pode ser conduzido para diferenciar na presença de um número suficiente de queratinócitos normais [4]. Estas observações sugerem que os tratamentos que poderia promover a diferenciação epidérmica na pele fotodanificada têm o potencial para restaurar o equilíbrio de proliferação e diferenciação necessários para a manutenção da homeostase da pele e, assim, poderia contrariar o desenvolvimento de lesões QA e SCC.

Um dos efeitos farmacológicos do ácido nicotínico na pele danificada pela luz é promover a diferenciação epidérmica [5], levantando a possibilidade de que um receptor de ácido nicotínico podem estar envolvidos. O denominado receptor de GPR109A (HM74A em seres humanos e Puma-L em ratinhos), recentemente dada a designação de HGNC NIACR1, foi descoberto em adipócitos altamente diferenciados, baço, e células do sistema imune [6], [7], [8]. casais GPR109A a proteínas G do G

i família, uma proteína G inibidora, que após a ligação de sinais de diminuição de adenosina 3 ‘, 5’-monofosfato cíclico (cAMP) de produção através da inibição da adenilil-ciclase num toxina pertussis ligando maneira sensível a [6], [7], [8]. GPR109A é um membro de uma subfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR), composto de GPR109A GPR81 e ambas as quais são encontrados em seres humanos e roedores. GPR109B (também denominado HM74) é um outro membro desta família de receptores que se liga mas com baixa afinidade ao ácido nicotínico e só está presente em seres humanos. O ácido nicotínico ativa tanto GPR109A e GPR109B com CE

50 valores de 0,1 mM e 100 mM, respectivamente [9]. Embora seja considerado improvável que o ácido nicotínico é o ligando endógeno destes receptores, doses farmacológicas de ácido nicotínico que actuam através GPR109A mediar ambos os efeitos desejados anti-lipolíticos, bem como efeitos de vasodilatação cutânea indesejados associados com a terapia de ácido nicotinico oral [6], [7 ], [8], [10], [11]. Uma vez que a formação de prostanóides induzida por ácido nicotínico responsável pela lavagem da pele tem sido sugerido que ocorrem nas células de Langerhans dendríticas dérmica, a expressão de GPR109A na pele foi estudado neste contexto [10], [12], [13], [14] ; No entanto, pouco se sabe sobre as funções dos receptores de ácido nicotínico em outros aspectos da biologia da pele. Aqui nós examinar a expressão, distribuição celular e funcionalidade do GPR109A e GPR109B na pele e células derivadas de pele. Nossos resultados mostram que o câncer de células escamosas têm expressão anormal GPR109A /B, distribuição celular e função, indicando que estes receptores estão envolvidos na homeostase da pele.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK, Lonza, Suíça) foram rotineiramente cultivadas em EpiLife (Gibco /Invitrogen) contendo suplemento de crescimento dos queratinócitos humanos para menos de 10 duplicações da população. fibroblastos diplóides humanos normais, CF3, (população duplicações menos de 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK), a linha celular estabelecida de queratinócitos epidérmicos humanos imortalizados, HaCaT, e Ras-transformado HaCaT, presentes de Dr. Norbert Fusenig ( German Câncer Research Center, Heidelberg, Alemanha) [15], a linha humana de carcinoma epidermóide célula, a-431 (American Type Culture Colecção (ATCC), Manassas, VA), e a linha de células de carcinoma de células escamosas, SCC-25 (ATCC ) foram rotineiramente cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Todas as células foram mantidas em atmosfera humidificada contendo um 5% de CO

2 a 37 ° C.

Transcriptase Reversa Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

O ARN total a partir de tecido adiposo, placenta , pulmão e pele foram adquiridos de Stratagene (Cedar Creek, TX) e 1? g de cada ARN foi utilizado para realizar a síntese de ADNc utilizando o kit TaqMan transcrição reversa a partir de Applied Biosystems (Foster City, CA). A PCR foi efectuada utilizando os seguintes iniciadores para GPR109A e GPR109B: GPR109A – para a frente – 5 ‘CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3’, GPR109B – para a frente – 5 ‘CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3’, e o iniciador inverso para ambos os genes – 5 ‘CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3’ sintetizado por Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). condições de ciclos térmicos foram as seguintes: a activação da polimerase de ADN a 94 ° C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de amplificação a 94 ° C durante 1 min e 62 ° C e 68 ° C durante 1 min cada

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

o ARN total a partir de células cultivadas foi preparado utilizando o sistema RNeasy Mini Kit de purificação (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Congelado alcançado humanos normais biópsias de pele, AKs e SCCs foram obtidos a partir do projeto intitulado “Quimioprevenção da pele amostras Programa de Câncer projeto arquivado para análises adicionais, revisto pela Universidade do Arizona IRB (Tucson, AZ), Projecto Código 08-0201-04 . O estudo a partir do qual foram obtidas amostras foi conduzida de acordo com a Declaração de Princípios de Helsínquia. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos. O ARN total de amostras de tecido da pele foi preparado utilizando o RNeasy Mini Kit de tecido fibroso (Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante. a síntese de cDNA foi realizada utilizando o kit TaqMan Transcrição Reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante utilizando hexâmeros aleatórios e 1 ug de ARN total. Para baseada TaqMan qRT-PCR perfil de expressão, 25 ng de cada ADNc incluindo o ARN total a partir de amostras de carcinoma de células escamosas (Asterand, Detroit, MI) foi adicionado à iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA) juntamente com as sondas TaqMan MGB de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). qRT-PCR foi realizada como previamente descrito [16]. Sondas concebidas para detectar especificamente GPR109A humana (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341584_s1) e transcritos GPR109B (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341102_s1) foram adquiridos de Applied Biosystems. monitorização da fluorescência em tempo real foi realizado com o ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Em tecidos de pele humana, desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) e a expressão do gene β-actina alterado com o grau de malignidade em comparação com rRNA 18S, que se manteve constante. Em células em cultura, GAPDH e expressão β-actina permaneceu constante quando em comparação com rRNA 18S; por conseguinte, os níveis de expressão relativa das várias transcrições foram determinadas por comparação contra os genes de manutenção, 18S rRNA para tecidos e células de cultura para GAPDH. Todas as medições de expressão foram realizadas em triplicado utilizando pelo menos três amostras de cDNA gerados de forma independente. Os resultados são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM). a expressão do gene relativo foi calculado como descrito previamente [17]. Alterações na expressão de gene foram considerados significativos para a mudança 1,5 vezes e p≤0.05.

Antibody Geração e purificação

Para a análise de GPR109A humana e GPR109B, um costume, anticorpo comercial foi gerado em coelhos utilizando um péptido sintético (RHHLQDHFLEIDKKNC) para gerar anti-soro que reconhece o terminal N de GPR109A e GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, TX). manutenção de animais ea produção de anticorpos foram realizados por Sigma-Genosys acordo com o protocolo revisto e aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Sigma-Genosys (IACUC), OPRR Assurance A4182-01; USDA número de registo 93-R-283. Os anti-soros foram purificados por afinidade utilizando um kit de Pierce Aminolink de acordo com o protocolo do fabricante (Rockford, IL). Os anticorpos foram validados, demonstrando que os extratos de células HeLa, que não expressam o receptor, não mostrou imunotransfer�cias positivos, mas extratos de células HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) transfectadas com o receptor nicotínico o faziam bandas positivas show no a posição de migração esperado. Além disso, as células CF3 que não apresentaram a expressão do receptor por qRT-PCR também não mostraram positivos imunoblots. Além disso, todas as análises de imunotransferência incluído um controlo que mostraram que o péptido contra o qual os anticorpos foram gerados competiu para o sinal.

análises de imunotransferência

de SDS-PAGE e Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [ ,,,0],18]. populações de células aderentes foram lisadas em tampão de lise gelado (cloreto de sódio 150 mM, fluoreto de sódio 50 mM, fosfato de potássio 50 mM, pirofosfato de sódio 40 mM, 500 uL de Triton X-100, 100 uL de SDS, 200 mL de Tris-HCl 1 pH 7,4 em água e 1 comprimido de cocktail de inibidor de protease completo mini, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) durante 30 min a 4 ° C. Os lisados ​​foram então centrifugados a 12000 rpm durante 30 min a 4 ° C. A concentração de proteína dos lisados ​​foi determinada utilizando o BCA ™ Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte microgramas de proteína foram adicionados a 4 × tampão de carga (Tris 250 mM, pH 6,8, 8% SDS, 20% glicerol, 0,012% de azul de bromofenol, 4% β-mercaptoetanol), aqueceu-se a 95 ° C durante 5 min, sujeito a electroforese em 12,5 % géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (Amersham, Piscataway, NJ). Todas as membranas foram bloqueadas durante 1 hora com 5% de leite magro em tampão salino Tris (TBS) mais Tween-20 a 0,1% (10 mM de TBS-T, pH 7,4) e incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário ou primários anticorpo mais 1,000 excesso molar de péptido (utilizado para gerar o anticorpo) em relação ao anticorpo, incubadas em 5% de leite não gordo TBS-T 24 h antes da utilização. As membranas foram incubadas e desenvolvido em Immobilon ™ Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (Millipore, Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Após a secagem inicial, as membranas foram sondado para β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para assegurar uma carga uniforme. As manchas foram digitalizados e analisados ​​com o software ImageJ versão 1.39u (NIH, Bethesda, MD). Os valores apresentados para as proteínas alvo foram normalizadas para os níveis respectivos de p-actina dos blots em pelo menos três experiências independentes.

A imunocitoquímica (ICC)

CF3, NHEK, HaCaT, transformadas com Ras HaCaT, A-431, e as células SCC-25 foram cultivadas em lamelas. Para a fixação, as células foram lavadas duas vezes com TBS, incubada em formaldeído a 4% em TBS durante 30 minutos, e lavadas duas vezes com TBS. Para marcar os receptores GPR109A /B, o bloqueio biotina endógena foi realizada usando NeutrAvidin ™ Proteína de Ligação a biotina (Pierce) durante 30 min à temperatura ambiente. Imediatamente depois, as células foram incubadas em 3% de albumina de soro bovino dissolvido em TBS (TBS-BSA) durante 1 h tampão de bloqueio e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo primário diluído em tampão (1:10) de bloqueio. Para experiências de competição de péptidos, um excesso de 1000 vezes de péptido foi incluído. No dia seguinte, as células foram lavadas 3 vezes durante 5 min cada com TBS. O passo de bloqueamento foi repetido e as células foram incubadas em 01:25 biotina-SP-conjugado IgG AffiniPure de cabra anti-coelho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 min a 37 ° C. As lâminas foram lavadas com TBS e incubadas em estreptavidina 1:25 Quantum Dot 605 conjugados (Millipore) durante 45 min a 37 ° C. Após lavagens exaustivas com TBS, lamelas foram montadas utilizando meio de montagem contendo 90% de glicerol e 10% de TBS. As lâminas imunomarcadas foram colocados a 4 ° C e visualizada no dia seguinte sob um microscópio de fluorescência.

A imuno-histoquímica (IHC)

a detecção imuno-histoquímica de GPR109A /B foi realizada em secções embebidas em parafina de normal biópsias de pele humana. material arquivado a partir de um estudo realizado em conformidade com a Declaração de Princípios de Helsínquia revista por Integ Revisão Ética Review Board, Austin, TX. Todos os indivíduos leram e assinaram um Termo de Consentimento Livre IRB-aprovado. Todos os participantes, aqueles administrar as intervenções, e aqueles que estão avaliando os resultados foram cegos para atribuição de grupo. secções embebidas em parafina foram desparafinizadas em xileno e hidratadas em uma série graduada de álcool, as secções foram imersas em ácido cítrico no banho-maria a 87 ° C durante 20 min para aumentar a recuperação de antigénios. As secções foram então lavadas em TBS e bloqueadas em BSA a 3%, TBS durante 20 min. Imediatamente após o bloqueio, as secções foram incubadas em anticorpo primário em 3% de BSA-TBS (01:10) durante a noite a 4 ° C. Para experiências de competição de péptidos, um excesso de 1000 vezes de péptido foi incluído. No dia seguinte, as secções foram lavadas em TBS, bloqueadas, uma vez mais, e incubadas em 01:25 biotina-SP-conjugado IgG AffiniPure de cabra anti-coelho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 min a 37 ° C. As secções foram lavadas com TBS e incubadas em estreptavidina 1:25 Quantum Dot 605 conjugados (Millipore) durante 45 min a 37 ° C. Após lavagens exaustivas com TBS, lamelas foram montadas utilizando meio de montagem contendo 90% de glicerol e 10% de TBS. Para experiências de competição de péptidos, as secções foram lavadas em TBS e incubadas no 1:1000 FITC de cabra anti-IgG de coelho (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 1 h à TA.

análise IHC da caspase 14 e filagrina envolvido usando procedimentos análogos anticorpo SC5628 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para a caspase 14 e 3.137-500 (Abcam, Cambridge, MA) para filagrina. Quantificação da coloração com anticorpo foi realizada como descrito anteriormente [5].

Ensaio de cAMP

NHEK, HaCaT, transformadas com Ras HaCaT, A-431, SCC-25, e as células foram semeadas a CF3 uma densidade de 25.000 células em placas de cultura de 35 mm. Dois dias mais tarde, o meio de cultura foi removido e substituído com meio de cultura contendo ± 100 ng /ml de toxina da tosse convulsa (incubada durante a noite), ± 10 pM de forscolina na presença ou ausência de ácido nicotínico em diferentes concentrações durante 1 h antes do teste. Excepto para os estudos de resposta à dose, a concentração final de ácido nicotínico utilizado foi de 100 uM. A medição dos níveis de cAMP intracelular foi realizada utilizando Kit cíclico AMP completa EIA (Assay Designs, Ann Arbor, MI) conforme as instruções do fabricante. As experiências foram repetidas três vezes com culturas de células independentes. Os dados são apresentados como média ± SEM de três experiências separadas.

Resultados

O ácido nicotínico promove a diferenciação epidérmica em fotolesionada

pele humana

exposição aos raios UV crônica leva a diferenciação epidérmica prejudicada e aumentou proliferação epidérmica, que pode resultar em lesões de ceratose actínica e câncer de células escamosas da pele [19]. Temos concluído que mirist�ico nicotinate (MN), um pró-fármaco que proporciona ácido nicotínico para a pele, promove a diferenciação epidérmica com função de barreira da pele associada reforçada em pele cronicamente fotolesionada como julgado por mudanças na epiderme e da espessura do estrato córneo, a diminuição das taxas de perda de água transepidérmica e aumentos da dose mínima eritemal [5]. Para examinar os efeitos de MN na diferenciação mais diretamente, dois marcadores de diferenciação epidérmica, caspase 14 e filagrina [20] foram avaliados em indivíduos com photodamage pele num ensaio clínico controlado com placebo [5]. FIG. 1A mostra um exemplo de amostras de biópsia corados na linha de base e após 12 semanas de aplicação tópica de uma formulação que contém 5% de Mn e a Fig. 1B mostra a quantificação da caspase 14 e filagrina em indivíduos tratados com formulações placebo ou Mn. A presença de manganês resulta em um aumento relativamente ao grupo placebo de cerca de 30% para a caspase 14 e 20% para filagrina. A formulação placebo substituído miristato de miristilo para MN, evitando eventuais efeitos do álcool miristilo que são gerados como o ácido nicotínico é libertado a partir do pró-fármaco.

matrizes de tecido de amostras de biópsia da pele de um estudo clínico dos efeitos de nicotinato de miristilo (MN) em sujeitos humanos com pele fotodanificada [5] foram coradas para os marcadores de diferenciação terminal caspase 14 e filagrina. Painel A: Um exemplo de uma amostra de biópsia no início do estudo e 12 semanas de tratamento MN coradas com H E, e imunocoloração para a caspase 14 ou filagrina. Painel B: Quantificação da coloração para o placebo (n = 27) e MN tratado (n = 31) grupos para a caspase 14 e filagrina. Teste t de Student foi utilizado para comparar o placebo e MN tratados grupos e os valores de p são mostrados.

genes receptores de ácido nicotínico são expressos em condições normais

pele humana

A promoção da diferenciação epidérmica por ácido nicotínico levou-nos a caracterizar os receptores de ácido nicotínico em pele humana como um alvo de ácido nicotínico putativo. Os genes que codificam tanto de alta afinidade (GPR109A) e baixa afinidade (GPR109B) formas do receptor de ácido nicotínico foram descritos anteriormente e a expressão destes genes foi relatada em pele [6], [12], [21], mas caracterização muito escasso foi reportado. A análise de PCR revelou a expressão de genes que codificam receptores de ácido nicotínico em tecido adiposo, placenta e pulmão (Fig. 2A), tecidos anteriormente demonstrado que expressam ambas as formas de receptores de [6], [7], [8], [10], [12 ]. FIG. 2A mostra também que transcritos para ambas as formas de alto e de baixa afinidade do receptor foram facilmente detectados na pele humana e células HaCaT. Muito pouco sinal foi detectado na CF3 fibroblastos de pele dérmica (o sinal luminoso mostrado parcial para GPR109A provavelmente representa a contaminação da pista HaCaT, uma vez que não foi observada nas experiências de repetição). Os níveis relativos de expressão em pele humana examinados por qRT-PCR indicam que o gene que codifica a forma de elevada afinidade do receptor é expresso a nível aproximadamente 2,2 vezes maior do que a forma de baixa afinidade (Fig. 2B).

painel a: RT-PCR foi realizada em ARN total a partir de tecido adiposo, placenta, pulmão, e tecidos e células da pele utilizando iniciadores específicos para GPR109A (linha superior) e GPR109B (linha inferior), tal como descrito em Materiais e Métodos. Painel B: qRT-PCR foi realizada em ARN total de seis tecidos humanos normais diferentes da pele utilizando sondas específicas para GPR109A (coluna cinzento escuro) e GPR109B luz (coluna cinzenta) receptores como descrito em Material e Métodos. Teste t de Student foi utilizado para comparar GPR109A para GPR109B, * p ≤ 0,05. Painel C: análises qRT-PCR foram realizadas em RNA total de dez tecidos de carcinoma espinocelular humanos usando sondas específicas para GPR109A (colunas cinzentas escuras) e GPR109B (cinza claro colunas) receptores. Os resultados representam a média ± SEM. Teste t de Student foi utilizado para comparar a pele humana normal, * p ≤ 0,05.

genes receptores de ácido nicotínico são sobre-expresso em cancros da pele de células escamosas

A expressão de ambos GPR109A e GPR109B em relação à da pele normal foi examinada em cancros de células escamosas (SCC) de diferentes fases de progressão (Fig. 2C). amostras de Fase I SCC revelam um ligeiro aumento na expressão do mRNA de GPR109A, enquanto que a expressão de ARNm GPR109B não é significativamente elevada. Na fase II e tumores IIB, a expressão de ARNm GPR109A é elevada a cerca de 3 vezes enquanto que a expressão continua de novo GPR109B semelhante ao da pele normal. Na etapa III e em tumores unstaged classificados como “SCC invasiva”, ambos os perfis de expressão do receptor são elevados até 16 vezes em relação ao tecido da pele humana normal. Em geral, o aumento da expressão dos genes de GPR109 aumenta com a fase de progressão da doença.

genes de receptores do ácido nicotínico são transcritos e traduzidos em linhas de células da pele

várias linhas de células da pele foram examinadas por qRT- PCR para a expressão do gene GPR109A /B e os resultados foram comparados em relação a queratinócitos humanos normais primárias epidérmico (NHEK). queratinócitos epidérmicos (células imortalizadas HaCaT), queratinócitos epidérmicos tumorigénicas transformadas com Ras (HaCaT), uma linha de células epidermoide da vulva derivadas de carcinoma previamente relatado para conter os receptores nicotínicos de ácido (A-431), e uma linha de célula escamosa humana carcinoma (SCC- 25) expressam mRNA para ambos os receptores (Fig. 3A). A sobre-expressão relativa de NHEK é observado até 40 vezes em células de cancro da pele em comparação com NHEK (Fig. 3A). Em contraste, a expressão de receptores do ácido nicotínico na derme derivados de fibroblastos diplóides humanos normais (CF3) é indetectável

Painel A:. QRT-PCR foi realizada em ARN total de queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK), humana imortalizada queratinócitos epidérmicos (HaCaT), imortalizadas transformadas com Ras queratinócitos humanos da epiderme (transformadas com Ras HaCaT), células epidermóides humana de carcinoma de células de carcinoma de células escamosas (A-431), (SCC-25), e fibroblastos diplóides humanos (CF3), utilizando sondas específicas para GPR109A (colunas cinza escuro) e GPR109B (cinzento claro colunas) receptores. Teste t de Student foi utilizado para comparar a NHEK, * p ≤ 0,05. Os painéis B e C: Expressão de Proteínas de GPR109A e GPR109B em células de pele humana. Os extractos celulares de NHEK (pista 1), HaCaT (pista 2), transformadas com Ras HaCaT (pista 3), A-431 (pista 4), e SCC-25 (pista 5) foram sujeitas a SDS-PAGE e análises Western immunoblot utilizando um anticorpo contra GPR109A /B pré-incubados na ausência (painel B) ou na presença (painel C) de 1,000 vezes o excesso de péptido contra o qual o anticorpo foi gerado em relação ao anticorpo purificado. p-actina foi utilizado como um controlo de carga para análises de imunotransferência de Western. Um blot representativo é mostrado de três experiências independentes. As densidades relativas foram quantificadas utilizando o ImageJ. representação gráfica mostra as unidades densitométricas médios de três experiências independentes. Teste t de Student foi utilizado para comparar a NHEK, * p ≤ 0,05.

Para determinar se transcrições receptores de ácido nicotínico são traduzidos, examinamos extratos de células de proteínas GPR109A /B utilizando um anticorpo anti-peptídeo desenvolvida e caracterizada no nosso laboratório (ver Materiais Métodos). Este anticorpo tem como alvo uma sequência próxima do terminal N comum a ambos os receptores e não se diferencia entre o GPR109A altamente homólogas e proteínas GPR109B. análises de Western blot mostra que a proteína do receptor nicotínico foi detectado em todas as linhas celulares examinadas no tamanho esperado para os dois receptores do ácido nicotínico (~42 kDa) (Fig. 3B). O péptido usado para gerar o anticorpo eficazmente competido o sinal de anticorpo, demonstrando a selectividade do anticorpo (Fig. 3C). A quantidade de proteínas em relação a p-actina é maior nos, transformadas e linhas de células malignas imortalizadas examinados em comparação com NHEK.

receptores do ácido nicotínico na pele humana estão presentes na epiderme e folículo piloso

Para determinar a localização celular das GPR109A /B na pele humana, foram realizadas análises imunocoloração. Observou-se que GPR109A /B são expressos a partir da camada basal através das camadas espinhosas e granulares da epiderme e folículos pilosos de pele humana normal (Fig. 4A). ampliação maior (Fig. 4B) revela que a expressão GPR109A /B parece ser distribuída mais uniformemente por toda a célula nas camadas de células basais da epiderme e mostra uma distribuição mais periférica nas camadas espinhosas e granulares, onde os queratinócitos são em fases posteriores do terminal de diferenciação. Um marcador fluorescente alternativa, isotiocianato de fluoresceina (FITC), para a detecção de anti-péptido de ligação do anticorpo é utilizado na Fig. 4C para demonstrar que o péptido usado para gerar o anticorpo bloquearam a ligação eficaz nestes tecidos (Fig. 4D).

A imuno-histoquímica (IHQ) foi analisada em cortes de pele humanos embebidos em parafina, utilizando o anticorpo contra GPR109A /B. Painéis A e B utilizadas Estreptavidina ponto quântico 605 conjugados para detecção. Painéis C e D utilizados com FITC de cabra anti-IgG de coelho para a detecção. Painel A: amostra imunocoloração Representante mostrado em 200 × ampliação. Painel B: Amostra representativa IHC mostrado em 400 × ampliação. Painéis C e D: As amostras representativas IHC mostrado em 400 × ampliação na ausência (painel C) ou na presença (painel D) de competição com o péptido usado para gerar o anticorpo. Abreviaturas: SC, estrato córneo; SG, estrato granuloso; SS, spinousum estrato; SB, estrato basal. Tamanho marcador representa 2 microns.

receptores de ácido nicotínico localização celular varia entre as células epidérmicas cultivadas

células NHEK foram coradas utilizando o anticorpo anti-peptídeo (Fig. 5A) e da concorrência peptídeo bloqueado a coloração (fig. 5B). Coloração aparece na periferia dos agregados de células que formam estruturas de paralelepípedo “” enquanto que as células isoladas parecem ter um padrão mais difusa da etiquetagem (Fig. 5A). Em células HaCaT, a expressão GPR109A /B localiza-se principalmente para a periferia (Fig. 5C). Em contraste, no transformadas com Ras HaCaT (Fig. 5D), A-431 (Fig. 5E), e SCC-25 (Fig. 5F) a localização da membrana de plasma é acompanhada por meio de etiquetagem por todo o citoplasma. a expressão do receptor nos fibroblastos da pele, CF 3, não é detectável (dados não mostrados)

Painéis A e B:. imunocitoquímica (ICC) as análises utilizando um anticorpo contra GPR109A /B foram realizadas em NHEK mostrado em vermelho e fundiu-se com nuclear coloração DAPI em azul. O painel A mostra a coloração com o anticorpo GPR109A /B e o Painel B mostra a coloração na presença de 1.000 vezes em excesso de péptidos utilizados para criar o anticorpo. Painel C: HaCaT, Painel D: HaCaT transformadas com Ras, Painel E: A-431, Painel F: SCC-25. Para todos os painéis, a ampliação foi de 400 × e marcador de tamanho representa 10 microns.

queratinócitos normais demonstram um receptor de ácido funcional G acoplado a proteína nicotínico sinalização através de G

i cuja função é diminuída em câncer de pele células

a maioria das caracterizações da funcionalidade de receptores do ácido nicotínico foram estudadas em células que não expressam intrinsecamente os receptores, mas em que os genes de receptores são transfectadas e sobre-expresso. Nos nossos estudos, que examinaram a funcionalidade do receptor intrínseca pela medição da capacidade de ácido nicotínico para inibir a formação de cAMP estimulada por forscolina, na ausência de expressão heteróloga. Sob estas condições, a contribuição relativa de formação de AMPc sensível a ácido nicotínico é menor do que nas células transfectadas. tratamento de forscolina induzida a formação de cAMP em todas as células estudadas com uma acumulação de 170-200 pmoles de cAMP por mg de proteína em 1 h de incubação e a presença de 100 uM de ácido nicotínico inibiu a produção de AMPc induzida por forscolina diferencialmente em vários tipos de células ( A Fig. 6A). O grau relativo de inibição nas diferentes linhas de células por ácido nicotínico é mostrado na Fig. 6B. A inibição da formação de cAMP por ácido nicotinico através dos receptores intrínsecas foi de aproximadamente 44% em células NHEK, 43% em HaCaT e 39% em células HaCaT transformadas com Ras. Em contraste, de cAMP estimulada por forscolina foi significativamente reduzida nas células derivadas de tumor. O ácido nicotínico inibida apenas 23% em células A-431 e 13% em células SCC-25. FIG.