Abstract
Poli (ADP-ribose) polimerase-1 vias de resposta ao dano DNA (PARP-1) e telomerase, bem como são alvos para o desenvolvimento de fármacos no tratamento, e inibidores específicos estão atualmente sob investigação clínica. O objetivo deste trabalho é avaliar as atividades anticancerígenas de tricíclicos derivados de antraquinona e pequenas moléculas tetracíclicos e suas relações estrutura-actividade com PARP-1 inibição do câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) e NSCLC-superexpressão clone Oct4 e Nanog, que mostram-expressão elevada de PARP-1 e maior resistência à droga anticancerígena. Nós aplicamos nossos compostos de biblioteca selecionado para 60 linhagens de células do NCI cancerosas humanas (NCI-60), a fim de gerar dados de perfis sistemáticas. Com base em nossa análise, é a hipótese de que essas drogas possam ser, direta e indiretamente, alvo componentes para induzir a transição de permeabilidade mitocondrial e a liberação de fatores pró-apoptóticos como potenciais anti-NSCLC ou PARP candidatos inibidores. Ao todo, a NSC747854 mais ativo mostrou o seu modo inibidor PARP citotoxicidade e de dose-dependente, portanto, surge como uma estrutura promissora para a terapia anti-cancro com nenhuma influência significativa sobre as células normais. Nossos estudos apresentam evidências de que a manutenção dos telômeros deve ser levado em consideração nos esforços não só para superar a resistência aos medicamentos, mas também para otimizar o uso de terapias à base de telómeros. Estes resultados serão de grande valor para facilitar a concepção baseada na estrutura de inibidores de PARP selectivos, em geral, e os inibidores de telomerase, em particular. Juntos, os dados aqui apresentados expandir a nossa visão sobre os inibidores de PARP e apoiar a otimização de chumbo que exige grandes recursos de pequenas moléculas estruturalmente relacionados para terapia de câncer humano
Citation:. Lee YR, Yu DS, Liang YC, Huang KF , Chou SJ, Chen CT, et ai. (2013) Novas Abordagens de PARP-1 inibidores em células de câncer de pulmão humano e câncer de células estaminais-Como por alguns Derivado-antraquinona Selecionado pequenas moléculas. PLoS ONE 8 (2): e56284. doi: 10.1371 /journal.pone.0056284
editor: Ferenc Gallyas, Universidade de Pecs Medical School, Hungria
Recebido: 18 de junho de 2012; Aceito: 12 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O presente estudo foi apoiado pelo National Grants Conselho de Ciência NSC99-2113-M-016-001, NSC100-2113-M-016-001 e NSC 97-3111-B-075-001-MY3 respectivamente. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução cancros
pulmonares são geralmente classificados como carcinomas do pulmão de pequenas células (SCLC) e carcinomas de pulmão de células não pequenas (NSCLC), que são ainda subclassificados como adenocarcinoma (AC), o carcinoma de células escamosas (CCE), e células grandes o carcinoma (LCC) [1], [2]. células-tronco cancerosas são pequenos reservatórios de células auto-sustentável com a capacidade exclusiva de auto-renovação e tumor de manutenção [3]. Embora os novos agentes de quimioterapia e radioterapia têm melhorado a sobrevida ea qualidade de vida dos pacientes, a taxa de sobrevivência a longo prazo dos pacientes com pulmão AC continua a ser insatisfatória. A quimioterapia na última década tem sido usado principalmente como tratamento paliativo em vez de redução da mortalidade; Há ainda uma necessidade urgente de procura ainda mais as novas moléculas pequenas para novos agentes quimioterápicos.
PARP, que desempenha um papel na reparação do ADN em cadeia simples (ADNcs) quebras, tem uma série de actividades bioquímicas distintas que têm sido um alvo atraente para a concepção de agentes contra o cancro [4] – [6]. Ao longo da última década, muitas pequenas moléculas com inibição da família de PARP têm sido sintetizados e alguns deles estão actualmente a ser testada em ensaios clínicos como terapias do cancro [7] – [9]. Embora tenham sido estudados quanto à sua utilidade na detecção de danos no DNA e de reparação, na medida em que o controlo de PARP outro processo específico do desenvolvimento não é clara. O desenvolvimento de inibidores específicos, potentes, eficazes e seguras de PARP tornou-se uma área de investigação activa e publicação muito recente no campo da PARP. Por esta razão, a inibição da actividade de PARP, especialmente de PARP-1, com moléculas pequenas reduz a reparação de quebras de ssDNA, e é provável que seja útil para o tratamento de cancros, stress, as respostas inflamatórias e doenças cardiovasculares [7], [8]. Os ensaios clínicos actualmente em curso estão a analisar a segurança e eficácia de PARP-1 como inibidores anti-câncer, incluindo mama, útero e ovário [9]. Além disso, as funções de PARP nas respostas de danos no DNA e protecção dos telómeros podem sobrepor-se com a telomerase [10]. Um relatório anterior sugeriu que a telomerase e PARP desempenha um papel na instabilidade do cromossoma e danos no ADN [11]. Em muitos casos, a eficácia dos inibidores pode ser devido à letalidade sintético entre a inibição de PARP e uma lesão genética nas células tumorais [12] – [14].
3-aminobenzamida (3-AB) é uma primeira geração de PARP-1 de inibidor [15], [16], mas falta-lhe a selectividade e a potência necessária para ser útil em situações clínicas ou como uma ferramenta de pesquisa [9], [17]. Além disso, a nicotinamida, o produto de clivagem menores de NAD
+ também exerce um efeito inibidor sobre a PARP-1 [18]. Veliparib (ABT-888) é também um processo novo e potencial medicamento anti-cancro actuando como um inibidor de PARP-1 [19]. Olaparibe (AZD2281) mostrou promissor eficácia clínica em fase II ensaios não randomizado, em doentes com cancro do ovário com BRCA1 ou BRCA2 deficiência [20]. Iniparib (BSI-201) é notável pela sua estrutura simples, mas que mata as células normais e neoplásicas a elevadas concentrações e não devem ser considerados como inibidor de PARP [21]. Outras drogas, tais como INO-1001, CEP-8933 /CEP-9722 e derivados relacionados-fenantreno PJ-34 também foram avaliados em ensaios clínicos até agora [22]. PJ-34 também foi o composto mais potente neste campo [23]. Nós fornecemos PARP-1 atividades de alguns compostos seleccionados, bem como uma investigação em profundidade dos nossos trabalhos publicados ou não publicados nos últimos anos que forneceram novos insights sobre a inibição da PARP-1 no núcleo (Figura 1) [ ,,,0],24] – [33].
no sentido de apoiar a hipótese acima mencionada, estudos têm mostrado que as células de câncer de mama p53 deficiente tratados com a PARP-1 inibidor resistência perder a doxorrubicina, um antibiótico antitumoral de antraciclina clinicamente activo que promove a apoptose [34]. efeitos citoprotetores potentes Além disso, o estudo mostram que Fenantrenos relacionadas com PARP-1 inibidores têm
in vitro
e
in vivo
[35] estudo .Outra mostrou que a concentração de cisplatina pode ser reduzida depois de ser seguido por tratamento com inibidor de PARP-1, PJ-34, para obter o mesmo efeito citotóxico [36]. Como discutido no artigo, tendo como alvo a via de excisão de bases de reparo com potentes de PARP-1 inibidores está provando ser rota frutífera para o desenvolvimento de novos agentes que podem ter atividade não só como quimio ou radio-potencializando os agentes, mas também como um agente ativo na reparo do DNA dos cancros hereditários deficientes [37]. Neste estudo, destacamos informação emergente sobre a inibição de PARP-1 em derivados de resultados derivados de antraquinona, a sua interacção com a actividade anti-tumoral contra no painel completo de linhas celulares tumorais humanas e a inibição destes derivados em cima de PARP-1. Estas e outras descobertas clínicas relacionadas mudaram PARP-1 a partir de assuntos interessantes de análises moleculares à vanguarda como alvos clínicos para o tratamento do câncer. Em nossa abordagem a esta pesquisa, investigamos recém-descoberto inibidores de PARP, as pequenas moléculas derivadas de antraquinona adequadamente modificados, para determinar os seus efeitos sobre a viabilidade celular, ensaio de western blot, células cancerosas e sua inibição PARP-1.
resultados e Discussão
avaliação antiproliferativa das pequenas moléculas seleccionadas
Um relatório anterior sugeriu que Rhein poderia induzir a apoptose em células de leucemia promielocítica humana (HL-60), caracterizado por a activação de caspases, clivagem de PARP, e fragmentação de ADN [38]. Como chegamos a compreender os vínculos entre o estado epigenético dos telômeros, PARP e pequenas moléculas irá abrir novos caminhos para a nossa compreensão do desenvolvimento de novos medicamentos para a terapia do cancro. Compreensão do modo de ação de medicamentos anticancerígenos à base de antraquinona tem aumentado nos últimos anos, mas ainda permanece incompleta. Nos últimos anos, nós também têm aproveitado um número de famílias do telômero-alvo de farmacóforo à base de antraquinona para gerar novidade estrutural e diversidade para os seus estudos biologicamente relevantes. Foi demonstrado que as antraquinonas planares ligar-se a extremidade da estrutura G-quadruplex através de interacções de empilhamento π-¸ com resíduos de guanina [39] – [43]. Mostrou-se também que as amido-antraquinonas representam um dos melhores pequenas moléculas para modular a ADN duplex e selectividade quadruplexes [44], [45].
O sete pequenas moléculas de derivados de antraquinona (NSC746364, NSC746365, NSC746366, NSC747515, NSC747854, NSC749235 e NSC749232) (Figura 2) aqui avaliadas foram selecionadas porque exibiu citotoxicidade significativa, que provocam atividade contra 60 do painel do NCI cheio de linhas de células tumorais humanas derivadas de tipos de células nove câncer: NSCLC, cancro do cólon, da mama cancro, cancro do ovário, leucemia, cancro renal, melanoma, cancro da próstata, e cancro do SNC. Há evidência adicional de que estas proliferações inibidos dependentes da dose em todas as linhas celulares de cancro de 60, a citotoxicidade, e PARP-1 foram derivados das experiências apresentadas neste estudo. Além disso, todas estas sete compostos foram seleccionados para posterior avaliação em cinco rastreio nível de dose. Neste estudo todos eles mostram boa actividade com IG
50, TGI e LC
50 em linhagens de células NSCLC, respectivamente. Com base na análise da sua NCI,-se a hipótese de que estes fármacos possam ter potencial para ser antineoplásicos candidatos de drogas. Para este fim, escolhemos NSCLC como o nosso foco principal. Mesmo NSC747854 é mais sensível para a mama, renal, cancros do ovário e da tela de 60 linha de células do NCI (Figura 3). Tirando proveito de uma visão estrutural recente sobre as linhas de células NSCLC do Programa tela de drogas NCI, analisamos o GI
50, TGI, e LC
50, assim como a atividade de inibição de PARP eo IC
50 no cancro do pulmão de células que sobre-expressam Oct4, clone Nanog (A3), linha celular de cancro do pulmão (A549) e a linha celular de fibroblastos normais (HEL299), respectivamente. O nosso resultado anterior que sugeriu a Oct4 e Nanog clone que sobre-expressam A549 é mais resistente à droga anti-cancro, a cisplatina, em comparação com a célula parental A549 [46].
a) Uma estrutura de NSC747854. b) A actividade antitumoral de NSC747854 em NCI-60 linhas celulares de cancro, que foi submetido à Developmental Therapeutics Program do NCI (National Institutes of Health) de modo a testar o seu efeito num painel de 60 linhas celulares de cancro derivadas de diferentes tecidos e órgãos. O GI
50 na escala logarítmica foram calculados e são mostrados no gráfico de barras. A linha do meio representa a concentração inibitória de crescimento médio de 50% para NSC747854 (
ou seja
6,92 M).
Os avanços de investigação cobertos feitas em nossos grupos e fornecidas discussões sobre algumas anthraquinone- selecionadas derivados pequenas moléculas que em diversas posições cobrem as relações estrutura-actividade (SARS), atividades biológicas e informações referentes a vias bioquímicas. No entanto, quando os perfis intrigantes da inibição do crescimento de células tumorais, citotoxicidade, actividade inibidora da telomerase e a actividade de inibição de PARP foram inicialmente descoberto, verificou-se que um alvo molecular deve ser limpo: estes pequenos inibidores segmentados por telómeros concebidas moléculas exigido actividade antitumoral e PARP inibição através de mecanismos desconhecidos de ação. Neste estudo, descrevemos as evidências multidisciplinares, abordagens e experiências realizadas para elucidar SARs na atividade inibitória PARP de vários compostos derivados de antraquinona como alvos potenciais antitumorais. A abordagem molecular, também foi obtida evidência de actividade anti-tumoral e a actividade da telomerase e discutido. Conforme resumido na Tabela 1, os sete moléculas pequenas sintéticas foram estudados quanto à actividade anti-proliferativa contra as linhas de células humanas NSCLC no Programa de tela de drogas NCI. Uma característica estrutural comum de PARP-1, inibidores é a presença de um grupo carboxamida ligado a um esqueleto de poli-cíclico. O átomo de oxigénio do grupo carbonilo pode actua como um aceitador de ligação de hidrogénio, e o átomo de hidrogénio a partir das funções de grupo amida como um doador de ligação de hidrogénio na interacção de ligação de hidrogénio com a PARP-1 [45]. Foi recentemente relatado que uma subsítio hidrofóbico recentemente em forma de milho emerge a partir do local activo da PARP-1 quando a PARP-1 complexo é combinado com inibidores de PARP-1 [47]. A maior parte dos compostos de ensaio seleccionados foram adicionados às linhas de NSCLC; talvez eles estavam no nível micro-molar. Todos os sete compostos escolhidos quase exibiu efeitos antiproliferativos notáveis em células A549, com GI
50 valores na gama baixa (Tabela 2). Em conjunto com os estudos, que planejava usar estas sete compostos para investigar mais de um
in vitro
ensaio de inibição de PARP-1. Compreender as vias de morte celular para a morte selectiva de tumores NSCLC quimio-resistentes iria levar a estratégias mais eficazes. Até agora, não há agentes quimioterápicos foram desenvolvidos que exploram PARP-1 hiper-ativação para a terapia de NSCLC. Por conseguinte, tem sido proposto que a inibição de PARP-1 podem aumentar a eficácia da terapia anti-cancro que danificam o ADN. Como observado nestas moléculas pequenas de companhia, NSC747854 é quimicamente e biologicamente romance única no seu mecanismo de acção e
teste padrão in vitro
de actividade. Nesta pesquisa, apresentamos evidências de que NSC747854 possuem uma série de propriedades farmacologicamente desejáveis que tem um padrão diferencial de multi-log de atividade e mecanismos exclusivos de ação na tela linhas de 60 células do NCI (Figura 3).
In vitro a citotoxicidade avaliação
para a mais e detalhada avaliação destes sete compostos, usamos MTT sobre células A549 para comparar estes compostos a 3-AB e PJ-34, que os dados são mostrado na Figura 4. A IC
50 de quatro compostos (NSC746364, NSC746365, NSC746366 e NSC749232) tinham entre 1 e 10 uM em células A549. Curiosamente, a citotoxicidade de sete compostos para a linha de células A3 foi melhor do que com a linha celular A549. Em geral, ambas as duas drogas, 3-AB e PJ-34, mostram citotoxicidade pior do que os compostos seleccionados (Tabela 3). Em comparação com a linha celular A549, nós descobrimos que as quantidades de PARP-1 foram expressão acentuadamente aumentada na linha de células A3 na Figura 6A. Assim, tomamos a linha de células A3 para ser a nossa plataforma de triagem de drogas baseado em linha de celular. Os resultados indicaram que as células A3 a seis compostos (excepto NSC746364) eram mais sensíveis do que as células A549. Este fenómeno interessante também apareceu em PARP-1 (inibidores da 3-AB e PJ-34) (Tabela 3). Base de dados em uma série de casos desse tipo de pesquisa, esperávamos que o desenvolvimento de novas drogas não só promete fornecer boa citotoxicidade, mas também promete resultar em nenhuma influência significativa sobre as células normais. Portanto, nós utilizamos HEL299 células como nossas linhas de células normais; tratámos nesta linha celular normal com sete compostos e dois inibidores de PARP-1, a fim de testar a citotoxicidade destes compostos seleccionados e dois inibidores de PARP-1 sobre as células normais. A IC
50 dados de ensaios MTT destes compostos são mostrados na Figura 5. Os efeitos citotóxicos de sete compostos foram ligeiramente melhores em células cancerosas Out-4- e o clone A549 Nanog-sobre-expresso (A3) e que nas células normais. Nosso estudo anterior tinha estabelecido Oct-4 e Nanog-overexpressed clone A549 (clone # 3; A3), e esta linha de células A3 adenocarcinomal apresentadas as propriedades de células-tronco cancerosas-like e transdiferenciação epitelial-mesenquimal, bem como a capacidade metastática [46 ], [48]. Os resultados do Western blot demonstrou que esta linha de células A3 foi altamente expressa de PARP-1, mas não em parental da A549 e as células HEL299 (Figura. 6B). É importante notar, além disso, a linha de células A3-A549 apresenta endogenamente os níveis elevados de expressão de CD133 (marcador de células estaminais de cancro) e ABCB1 bem como ABCG5 (genes resistentes a drogas), em comparação com as células parentais A549 [46], [48]. Neste estudo, os resultados do Western blot demonstrou que esta linha de células A3 foi altamente expressa de PARP-1, mas não em parental da A549 e as células HEL299 (Figura 6). Na figura 6c, os dados mostraram que o clone A3 pode formar significativamente os tumor-esferas no meio isento de soro com bFGF e EGF (10 ng /ml). Além disso, os resultados de formação de esfera e ensaio de viabilidade de células demonstraram que os compostos de NSC747854, NSC749232, e NSC749235 no clone A3 tratada pode bloquear de forma eficaz a formação de esfera e inibir o crescimento de células in vitro (Figura 6D e 6E). Notavelmente, utilizando RT-PCR quantitativo, foi demonstrado que os compostos de NSC747854, NSC749232, NSC749235 e pode inibir os níveis de PARP-1 em células tratadas A3 (Figura 6F). Após A3, A549 e células HEL299 foram tratados com compostos, comparou-se a taxa de sobrevivência, respectivamente, entre a linha de células A549 e a linha de células HEL299 por utilização de um teste t não emparelhado de duas caudas que NSC749232 tinha uma diferença significativa. Comparado com a linha de células A3, NSC747854, NSC749232 NSC749235 e tiveram uma taxa de sobrevivência significativamente diferente da linha de células HEL299. Notavelmente, 3-AB e PJ-34 também seria relativamente prejudiciais para a linha celular de fibroblastos normais (HEL299) neste estudo. Os resultados implicam que NSC747854 não afecta o crescimento e transcrição geral de células normais. Além disso, NSC747854 e outras pequenas moléculas de derivados de antraquinona seleccionados são, em geral, mais potentes do que a 3-AB e PJ-34. Foi primeiro relatado que os análogos da antraquinona são inibidores potentes de PARP humanos. Juntos, os dados aqui apresentados expandir a nossa visão sobre os inibidores de PARP e apoiar a otimização de chumbo que exige grandes recursos de pequenas moléculas estruturalmente relacionados para a terapia do cancro humano. A IC
50 dados de ensaios MTT destes compostos são mostradas na Figura 5.
valores de viabilidade celular são expressas em relação a esses poços em que vários compostos não foram adicionados (valor de controlo de 100%). Cada ponto representa a valores médios ± SD de pelo menos três experiências independentes.
Os valores representam uma média de pelo menos três experiências independentes.
a) Quando comparado com o expressão de uma proteína de arrumação β-tubulina, o grau de PARP-1 em células A3 foram estimados em mais do que em células A549 e HEL299. b) A morfologia das células cultivadas em meio A3-continha 10% de soro. c) Sob com bFGF e EGF (10 ng /ml) de cultura isento de soro, foi observada a formação do tumor esfera (setas) das células A3 (barra = 60 uM). Os compostos de NSC747854, NSC749232, e diminuiu NSC749235 d) a viabilidade celular, e), bloquear a formação de esfera, e f) inibir os níveis de expressão de mRNA em Parp1 A3 células tratadas. Cada ponto representa um valor médio ± DP de pelo menos três experiências independentes.
Além disso, o presente trabalho demonstra que a IC
50 destes selecionados sete compostos contra duas células cancerosas foram menor do que a do inibidor de PARP-1. A maioria destes compostos seleccionados foram desprovida de qualquer toxicidade para com os fibroblastos normais. Para elucidar a SARs e
in vitro
atividade anticancerígena, nós correlacionados seu perfil de atividade (GI
50, TGI e LC
50) no sistema de rastreio e também os seus efeitos sobre a proliferação de células, a toxicidade e PARP-1 efeitos inibitórios.
avaliação de inibição de PARP dos moléculas pequenas seleccionados
Até à data, um número de famílias de compostos têm sido desenvolvidos e a sua actividade de PARP e citotoxicidade têm sido extensivamente estudados. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que os anti-cancro potenciais de pequenas moléculas de derivados de antraquinona de encontro à base de células são, pelo menos em parte, atribuídas aos seus efeitos anti-cancro e a actividade de inibição de PARP. Os perfis de caracterização molecular, citotoxicidade e atividade da telomerase únicas merecer investigação mais profunda e indicam um potencial novo mecanismo de acção anticancerígena envolvido. Pequenas moléculas que modulam a PARP-1 inibitória provavelmente irá fornecer novos insights sobre a regulação desta via de desenvolvimento chave e, finalmente, fornecer nosso campo com os potenciais novos agentes farmacológicos, tais como drogas anti-câncer. Embora muitos programas de descoberta de medicamentos para novos tela de pequenas moléculas de PARP-1, inibidores de nenhum candidato apropriado ter ainda sido possuir inibidores potentes e específicos suficientes. Como resultado, verificou-se que o potencial de PARP-1 inibidor dependente da dose NSC747854 foi o único composto que seguiu todos os critérios acima mencionados.
Usamos placa de 96 poços revestidos de histona tratada com sete PARP- putativa 1 ou inibidores de PARP-1 bem conhecidas (3-AB), e depois foi adicionada enzima PARP a cada poço. enzima PARP catalisa a adição dependente de NAD de poli (ADP-ribose) a histona, e diluiu-se Strp-HRP pode ligar-se a PARylation histona. TACS-Sapphire ™ rendeu azul sob a existência HRP. A fim de avaliar sistematicamente o potencial atividade anticâncer, os compostos foram testados quanto à sua citotoxicidade
in vitro
contra 60 linhas cancerosas humanas em tela droga anticâncer do NCI, bem como para as curvas de resposta de dose e a atividade da telomerase. O crescimento celular foi analisada pelo ensaio de MTT, com as diferenças entre as curvas de dose-resposta analisados não parametricamente. a actividade de telomerase foi detectada por uma versão modificada do ensaio baseado em PCR e TRAP ensaio [31]. NSC746364, NSC746365 e NSC746366 são estruturalmente derivados 2,7- diamidoanthraquinone; NSC747515, NSC747854 e NSC749235 são derivados de antraquinona 1,2-heteroannelated, NSC749232 é um derivado 1,2-diamidoanthraquinone assimétrica, em comparação com outros agentes anticancerígenos utilizados clinicamente e exibiram uma citotoxicidade única na linha de células de alta expressa PARP-1, A3 . Desde PARP é um componente importante de cancros, estamos interessados em examinar os efeitos destes compostos sobre a actividade PARP, por isso, revelou um potencial inibidor de PARP através de várias abordagens de teste. Como mostrado na Figura 7, 3-AB, o efeito de inibição de PARP se comportou de uma forma dependente da dose. Os efeitos de inibição de PARP dos compostos revelou que sete NSC746364, NSC746366 e NSC749232 inibir a função do aumento da enzima PARP, juntamente com o aumento de concentração de 0,1 e 1 uM. No entanto, os efeitos inibidores de PARP não tinham diferença a 1 e 10 uM. Como descrito acima, NSC746364, NSC746366 e NSC749232 mostram a dose-dependência apenas em concentrações baixas. NSC746364 NSC746366 e mostrou um efeito inibidor de PARP de 56% e 47%, respectivamente. NSC747515 teve um efeito inibidor de PARP semelhante a 0,1, 1 e 10 uM. NSC747854 tinha maneiras de inibição de PARP de dose-dependentes em três concentrações diferentes, e alcançado o efeito inibidor máximo de 86% a 10 ^ M (Tabela 4). Estudos farmacodinâmicos de PARP-1, tais como inibidor de 3-AB, mostrou inibição dependente da dose da actividade da PARP em células mononucleares do sangue periférico. Para este fim, NSC747854 mostraram o efeito inibitório máximo de um modo de inibição de PARP, dependente da dose. Assim, NSC747854 pode ser o candidato inibidor PARP mais potente que seguiu todos os critérios acima mencionados. Nesta investigação, continuamos a concentrar a nossa atenção sobre o papel do NSC747854 e compreender a base da seletividade farmacóforo. De particular interesse é a diferença significativa com estes compostos selecionados, em comparação com a de 3-AB e PJ-34. Curiosamente, a maioria destes compostos seleccionados contêm uma amina única, com uma a três porções de ligador de carbono no espaço que poderia fornecer uma base estrutural para as diferenças na potência entre estes e outros inibidores de PARP-1. Do ponto de vista geral, estrutura-atividade, antraquinona planar tricíclicos demonstraram que as variações estruturais podem resultar em mudanças significativas na especificidade e potência em relação à atividade anticancerígena. Um sistema de anel aromático rico em electrões, incluindo um grupo carboxamida, deve ter pelo menos um átomo de hidrogénio no azoto da amida [47]. A porção amidinium é conhecido por contribuir para a estabilização do elemento de reconhecimento de ADN através de interacções electrostáticas e de ligação de hidrogénio [49]. Portanto, ligações de hidrogénio são frequentemente usados como elementos de reconhecimento devido à sua direccionalidade e também devido a ser factores atractivos para a actividade biológica (Figura 1) [50]. Muitas classes de drogas têm curvatura substancial, de elevada afinidade do ADN, ligação ao menor ranhura ou grande-sulco, a interferência com enzimas associadas ao ADN (por exemplo, a telomerase), e poli (ADP-ribose) polimerase, PARP. As afinidades de ligação e especificidades observadas sugerem que a incorporação de uma variedade de porções levará a substâncias que interagem com alvos de PARP. Esta abordagem aumenta grandemente a utilidade dos substituintes e farmacóforo relacionado para a construção de fármacos em geral. Portanto, é desejável conceber inibidores de PARP de acordo com vários parâmetros anticancerígenos. Foi primeiro relatado que os análogos da antraquinona são inibidores potentes de PARP humanos.
3-AB tinham efeitos inibidores dependentes da dose de PARP, e o efeito inibidor mais óbvio dependente da dose de PARP nas sete candidatos inibidor de PARP foi NSC747854. A 0,1 e 1? M, efeito inibidor PARP de NSC746364, NSC746366 e NSC749232 aumentou com a concentração aumentou, mas em 1 e 10? M, efeito inibidor PARP não apresentou diferença significativa.
Depois mostrando resultados promissores em vários estudos pré-clínicos, dois benzo [c] derivados fenantridina: dihydronitidine (DHN), nitidina (NTD) foram mostrados citotoxicidade seletiva [51], [52]. PJ-34, foi a molécula mais promissora pequena e também eficientemente impedido o desenvolvimento de células MDA-231 e células de cancro do pulmão H1299 sem induzir efeitos tóxicos detectáveis nas células proliferativas humanos normais [23]. Poderíamos sabe que os derivados relacionados-fenantreno desempenham um papel importante no campo dos inibidores de PARP e seleccionar a células cancerosas humanas. Em conclusão, os dados apresentados neste artigo indicam que os compostos apresentam diferencial potente e
in vitro
atividade contra células NSCLC e, especialmente, de PARP-1 células cancerosas expressas elevadas em comparação com as células normais de fibroblasto no curso desses experimentos. Com base nestas propriedades farmacologicamente desejáveis e o amplo espectro
In vitro
índice de actividade (GI
50, TGI, e LC
50) relataram, NSC747854 está actualmente em fase pré-clínica farmacologia mais detalhada e Os estudos de toxicologia, através do nosso laboratório. Colectivamente, estes estudos mostram que pequenas moléculas de derivados de antraquinona pode induzir características farmacológicas e bioquímicas de PARP-1 de inibição. Os nossos dados estende-se claramente as evidências biológicos utilizados pelos sete compostos seleccionados. Tanto quanto sabemos, antraquinonas nunca foram relatados para causar PARP-1 inibição. No seu conjunto, os nossos estudos suportam a conclusão de que as moléculas testadas NSC747854 compartilhamos um destino comum na telomerase e PARP que podem ser um romance menos modalidade tóxicos da terapia do cancro. uso PARP-1 do inibidor no tratamento do câncer é uma questão de alto perfil hoje. Alta expresso de PARP-1 é um mecanismo de importação-resistente. No nosso estudo, nós descobrimos que há uma expressão elevada de PARP-1 na linha celular de A3, o qual também pode ser explorada para o rastreio de fármacos de inibidores de PARP-1. Como uma parte da nossa pesquisa contínua de novos inibidores potentes, e de células-permeável desta enzima, análogos de derivados de antraquinona adicionais de NSC747854 foram também exploradas. estudos sobre os mecanismos preliminares, incluindo a influência sobre a PARP-1 Vias de inibição e citotoxicidade, foram, assim, realizadas a fim de revelar uma imagem mais detalhada sobre os possíveis alvos. Uma avaliação mais aprofundada será relatado em um futuro próximo.
Materiais e Métodos
Planejamento e síntese de compostos químicos
Nós previamente relatados alguns dos potenciais de novas pequenas moléculas como anticancerígeno agentes [17] – [26]. Os detalhes da síntese e caracterização química de NSC746364, NSC746365, NSC746366, NSC747515, NSC747854, NSC749235 e NSC749232 foram previamente descritos em um relatório separado e por isso têm alguns novos derivados sintéticos do nosso laboratório. Compostos como os descritos aqui, que interagem selectivamente com NCI Developmental Therapeutics Programa de
in vitro
60 linhas celulares de tela e inibir a telomerase, são potencialmente úteis como inibidores da proliferação de células que necessitam de telomerase para manter o comprimento dos telômeros para a continuação crescimento.
Avaliação de pequenas moléculas derivadas de antraquinona contra NCI-60 linhagens de células tumorais in vitro do painel e resumo de estudo preliminar
Como um rastreio primário, sete compostos selecionados foram submetidos à National Cancer linhas celulares Institute (NCI) tela para avaliação da sua actividade anticancerígena [53]. A partir da análise dos dados, conclui-se que aproximadamente 95% dos agentes activos a partir de linhas de tela da célula 60 podem ser identificados. Os métodos detalhados utilizados para o painel de linhas de células 60 foram descritas noutro local [54] – [59]. Resumidamente, os níveis de proteínas celulares foram determinados após 48 horas de exposição à droga por colorimetria SRB. Através da utilização de uma célula de controlo de tempo zero, o crescimento celular pode ser determinada para cada linha celular, permitindo, assim, os cálculos de GI
50, TGI, e LC
50. Comparação com placas não expostos à droga permite determinar a concentração e tempos de exposição conferem GI
50, TGI, e LC
50. Estes dados são então representados graficamente na forma de gráficos de barras e significativo como curvas de dose-resposta. Por esses critérios, sete compostos relatados em nosso banco de compostos foram todos ativos e repassados para avaliação no painel completo de 60 linhas de células tumorais humanas. O painel é organizado em nove subpainéis que representam a histologia diversificada:. Leucemia, melanoma, e cancros do pulmão, cólon, rim, ovário, mama, próstata, e sistema nervoso central
cultura celular
não-pequenas células do pulmão células cancerosas A549 e Oct-4 e clone A549 Nanog-sobre-expressos (clone # 3; A3), apresentou as propriedades das células-tronco do câncer semelhantes, bem como transdiferenciação epitelial-mesenquimal, de acordo com o nosso estudo anterior [46].