Abstract

A telomerase é uma transcriptase reversa associada com a imortalidade celular através da manutenção dos telómeros. Esta enzima é activada em 90% dos cancros humanos, e os inibidores de telomerase são actualmente em ensaios clínicos para neutralizar o crescimento do tumor. Muitos aspectos da biologia da telomerase foram investigados para a terapia, particularmente a inibição da enzima, mas pouco foi feito em relação à sua vaivém subcelular. Mostrámos recentemente que as mutações no sinal de exportação nuclear de hTERT, a componente catalítica de telomerase, levou a um mutante (

NES-hTERT) que falhou para imortalizar células, apesar de localização nuclear e a actividade catalítica. Expressão de

NES-hTERT em fibroblastos primários resultou na senescência prematura baseada telômero e disfunção mitocondrial. Aqui nós mostramos que a expressão de

NES-hTERT em LNCaP, células HeLa SQ20B e diminui rapidamente e significativamente a sua taxa de proliferação e capacidade para formar colónias em ágar mole sem interferir com a atividade telomerase endógeno. As células cancerosas mostrou aumento de danos ao DNA em telomérica e locais extra-teloméricas, e tornou-se sensível à radiação e peróxido de hidrogênio exposições ionizante. Nossos dados mostram que a expressão de

NES-hTERT neutraliza eficientemente o crescimento de células de câncer

in vitro

em pelo menos duas maneiras diferentes, e sugerem a manipulação com o NES de hTERT ou seu vaivém subcelular como uma nova estratégia para o câncer tratamento

Citation:. Kovalenko OA, Kaplunov J, Herbig U, deToledo S, Azzam EI, Santos JH (2010) Expressão de

NES-hTERT nas células cancerosas atrasos progressão do ciclo celular e aumenta a sensibilidade à genotóxico Estresse. PLoS ONE 5 (5): e10812. doi: 10.1371 /journal.pone.0010812

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Abril, 2010; Aceito: 03 de maio de 2010; Publicado em: 25 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kovalenko et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Comissão New Jersey em Pesquisa do Câncer (NJCCR), número de concessão 808.033 (JHS), 09-1124-CCR-eO (UH) e 10-2412-CCR-E0 (JF), o Escritório de Pesquisa do Exército, número do auxílio 56027LS (JHS), a Fundação médica Ellison conceder AG-NS-0387-07 (UH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a propriedade chave de tumores malignos é a sua capacidade de proliferar indefinidamente. Este é mediada, em 90% dos casos, pela reactivação da telomerase, uma transcriptase inversa responsável por manter os telómeros [1], [2]. A telomerase é composto minimamente em duas subunidades diferentes, um núcleo catalítico (hTERT) e um componente de ARN (hTR), que funcionam em conjunto para reabastecer os telómeros com cada divisão celular. hTERT foi recentemente mostrado para adquirir propriedades de uma polimerase de ARN dependente de ARN, quando em complexo com o componente de ARN da endorribonuclease mitocondrial MRP [3]; tal actividade não está envolvida na manutenção dos telómeros. Considerando hTR está presente em ambas as células somáticas e germinativas constitutivamente, a expressão de hTERT é estreitamente regulada. actividade da telomerase é elevada durante a embriogénese e na grande maioria dos tumores, mas é baixa ou inexistente na maioria das células somáticas do adulto [1]. Por essa razão, inibição da telomerase tornou-se uma estratégia promissora para o tratamento do cancro.

Várias abordagens diferentes têm sido desenvolvidos para bloquear a actividade da holoenzima telomerase, que varia a partir de inibidores de hTERT a G-quadruplex agentes estabilizantes para a degradação de alvo hTR associado [4] – [17]. Em todos os casos, os resultados de inibição da telomerase, diretos ou indiretos na incapacidade das células para manter os telômeros e, finalmente, as células parar o crescimento ou morrer. Um problema de estas abordagens é que várias semanas a meses são necessários para os efeitos uma vez que dependem principalmente extensa encurtamento do telómero [5]. No entanto, os inibidores de telomerase estão actualmente em ensaios clínicos [18].

Temos demonstrado recentemente que uma hTERT mutante deficiente na sua sinal de exportação nuclear (

NES-hTERT) não conseguiu manter os telômeros e mitocôndrias “saudável” em ambos os fibroblastos humanos primários e transformada com SV40 [19]. Apesar de localização nuclear e a actividade enzimática in vitro, a proteína mutante foi biologicamente inactiva in vivo, levando a senescência prematura com a activação da resposta clássica danos de ADN relacionada com a do telómero (DDR), quando expresso em células primárias. A expressão da proteína mutante também foi associada com disfunção mitocondrial e danos no ADN tanto telomérica e locais extra-telomérica [19]. Devido aos efeitos rápidas e dramáticas observadas, a hipótese de que a expressão ectópica de

NES-hTERT também pode ser um meio eficaz para combater o crescimento de células cancerígenas. No presente estudo, expressa

NES-hTERT em várias linhas de células cancerosas e mostrar um atraso rápida e eficiente na progressão do ciclo celular, sem qualquer alteração detectável nos níveis de actividade da telomerase enzimática endógena. A expressão da proteína mutante diminui significativamente a capacidade das células para o crescimento independente da ancoragem in vitro. Descobrimos que a expressão ectópica de

NES-hTERT levou a telomérica nuclear, DNA extra-telomérica e mitochondrial (mtDNA) de dano nas células cancerosas e sensibilizados pelo menos um tipo de células cancerosas tanto para o estresse oxidativo e γ-radiação. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem visando o NES de hTERT ou seu movimento intracelular como uma nova estratégia para combater eficazmente o crescimento de células tumorais.

Resultados

A superexpressão de

NES-hTERT na pele e linhas celulares de cancro da próstata rapidamente blocos ciclo celular progressão

Temos demonstrado recentemente que a expressão ectópica de um hTERT mutante em que o NES foi interrompida (

NES-hTERT) faz com que a senescência prematura em fibroblastos humanos telomerase-negativos [19]. As células primárias expressando

NES-hTERT parou de crescer dentro de 5-20 duplicações da população após a introdução da proteína mutante, que foi associado com sinais clássicos de senescência celular, tais como bloqueio no G1 a S transição, regulação positiva de p21

WAF1 , p16 e positividade para β-galactosidase associada à senescência (β-gal) actividade [19]. Tendo em conta estes efeitos, nós perguntado se expressão de

NES-hTERT também teria um impacto progressão do ciclo celular das células cancerosas telomerase positivo. Para resolver esta questão, expressa de forma estável

NES-hTERT em SQ20B (carcinoma de células escamosas – câncer de pele) e LNCaP (cancro da próstata) células e seguiu o crescimento em culturas de massa há várias semanas; as células de controlo foram deixadas não infectadas ou infectadas com o vector vazio. Não foram observadas diferenças entre as células infectadas e não-vazia por vectores transduzidas (dados não mostrados). As células foram seleccionadas com antibióticos durante 2 semanas antes do início das experiências. transduções virais foram repetidas pelo menos duas vezes independentes com cada linha de células que mostra resultados reprodutíveis. Todas as experiências aqui apresentadas confiar em dados obtidos com células derivadas a partir de pelo menos duas infecções virais independentes

logo chamou nossa atenção que após a transdução de alterações virais no fenótipo das células ocorreu.; tais mudanças foram observadas, enquanto as células ainda estavam sendo selecionado. Uma fração (~30-50%) de células SQ20B expressando

NES-hTERT tinha achatada e morfologia ampliada com algumas dessas células mostrando vários núcleos (Fig. 1A, painéis superiores), que lembra os efeitos observados nas células primárias [19]. Diferentemente dos fibroblastos primários, sem coloração β-gal positiva foi observada em células SQ20B expressando

NES-hTERT (dados não mostrados), sugerindo que as células senescentes foram aumentados não. Estas células também eram não apoptótica, como eles não eram nem formação de bolhas, nem separar a partir dos pratos (dados não mostrados). morfologia alargada não foi observada em células LNCaP que expressam o mutante hTERT; No entanto, enquanto estas células tendem a crescer em clusters /focos independentemente da sua confluência (ver também ATCC), a expressão de

NES-hTERT suprimiu este fenótipo (Fig. 1A, painéis de média).

(A ) SQ20B (painéis superiores) LNCaP (pains do meio) e seus derivados que expressam estavelmente

NES-hTERT foram plaqueadas em pratos em números iguais e analisadas 72 horas mais tarde. imagens de contraste de fase foram tiradas em um microscópio Olympus IX70. Nota morfologia ampliada de SQ20B

NES-hTERT e células contendo vários núcleos (setas). Clustering é observada em LNCaP (ver caixa), mas não visto em LNCaP

NES-hTERT. painéis inferiores mostram as células HeLa que foram transitoriamente transfectadas com o

NES-hTERT mutante. As imagens foram recolhidas 48 horas após as transfecções. As setas indicam ampliado e células multinucleadas (meio) observada apenas após transfecção com o hTERT mutante. (B) SQ20B, LNCaP e sua

derivados NES-hTERT foram plaqueadas e deixadas crescer durante até 144 horas. Em vários momentos células foram colhidas e contadas utilizando um hemocitómetro. No caso de células LNCaP, as células foram plaqueadas de novo e novamente contadas 72 horas mais tarde. A média de três análises é mostrado, barras de erro representam S.E.M. (* P £ 0,05) (C) Percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi calculada por citometria de fluxo com base na coloração de PI. (D) As células foram privadas de soro durante a noite, em seguida, liberado pela adição de soro. As células foram marcadas com [

3H] -timidina e analisados ​​em intervalos de tempo regulares para a incorporação de timidina. A média de dois experimentos independentes é mostrado, barras de erro são DP

É possível que estas alterações morfológicas simplesmente resultar da integração não específica do

NES-hTERT pBabe vetor. Para descartar essa possibilidade, transitoriamente transfectadas a proteína mutante em células HeLa (adenocarcinoma). As células HeLa foram escolhidas devido à alta eficiência de transfecções transientes (-60%) quando comparado com ambas as células SQ20B e LNCaP (~10-20%; dados não mostrados) e, porque eles também expressam telomerase endógena. Para assegurar que as células foram analisados ​​expressando a proteína mutante,

NES-hTERT foi subclonado no vector pCMV e transfectadas quer sozinho ou co-transfectadas com GFP; os resultados foram comparáveis ​​com as duas abordagens. As células transfectadas com o vector pCMV vazio (+ ou – GFP) foram utilizados como controlos negativos. Como pode ser visto na Fig. 1A (painéis de canto inferior direito), dentro de 48 horas de expressão da proteína mutante, uma fracção de células HeLa mostraram também alargada e achatada morfologia, o que não foi observado em células transfectadas com o controlo de vector (Fig. 1A, o painel inferior esquerdo). Estes dados sugerem que as alterações morfológicas observadas foram associados especificamente com a expressão de

NES-hTERT. Curiosamente, nenhuma mudança no número de células foi detectada pela primeira 96 ​​horas após as transfecções com construção da proteína mutante (dados não apresentados), enquanto que as células HeLa transduzidas com controlo de vector foram de duplicação de 48 h após a transfecção (fig. 1A, o painel inferior esquerdo) .

Em seguida, definimos se

NES-hTERT progressão do ciclo celular alterado de células SQ20B e LNCaP usando três diferentes abordagens. Em primeiro lugar, semeado número semelhante de células que expressam de forma estável ou não a proteína mutante e o seu crescimento seguido por um período de 6 dias. Em cada ponto de tempo (24, 72 e 144 horas) as células foram tripsinizadas e contadas utilizando um hemocitómetro. Como mostrado na Fig. 1B, a expressão de

NES-hTERT alterou a taxa de proliferação de ambos os tipos de células. Sob estas condições, as células SQ20B foram submetidos a uma duplicação da população a cada 28 horas, enquanto SQ20B expressando o mutante hTERT dobrado a cada ~36 horas. Os tempos para a duplicação, no caso das células LNCaP e sua

NES-hTERT derivado foram estimados em 36 e 57 horas, respectivamente (34 horas é o tempo de duplicação de células LNCaP de acordo com o fornecedor (ATCC)). Em seguida, monitorizada a progressão do ciclo celular por citometria de fluxo. As células foram sincronizados por retirada de soro durante 16-18 horas. Às 8 horas após a adição de soro, as células foram recolhidas e incubadas com ARNase A e iodeto de propídio (PI). Os dados na Fig. 1C são representativos de quatro análises independentes; tanto em linhas celulares de expressão de

NES-hTERT aumentou a percentagem de células em G1 enquanto que diminuiu a fracção de células em S (Fig. 1C). Estes dados levou-nos a quantificar especificamente a fracção de células em fase S com base na incorporação de timidina tritiada. populações de células confluentes foram subcultivadas a densidade mais baixa e foram incubadas na presença de [

3H] -timidina. Movimento em fase S foi monitorizada por autorradiografia a vários pontos de tempo até 72 horas após a subcultura. Estas experiências foram reproduzidos duas vezes independentes e mostrou claramente uma redução significativa na percentagem de células na fase S após a expressão da proteína mutante (Fig. 1D), consistente com os resultados obtidos por citometria de fluxo. Em média, por ~20-70 horas após células subcultura, SQ20B e LNCaP expressando

NES-hTERT tinha 40% e 60-80% menos células em fase S, respectivamente, quando comparados com seus respectivos controles.

pode-se argumentar que os altos níveis de hTERT poderia estar dirigindo os efeitos do ciclo celular, como argumentado anteriormente [20]. No entanto, não favorecem esta hipótese como a expressão ectópica de tipo selvagem (WT) ou R3E /R6e hTERT, um hTERT mutante que é incapaz de entrar mitocôndrias [21], não teve nenhum efeito sobre a taxa de proliferação das células (dados não mostrados ). Outros grupos também ectopicamente expressa WT hTERT de forma estável em vários tipos diferentes de células cancerosas e não há defeitos na progressão do ciclo celular foi relatada [22], [23]. Tomados em conjunto, os dados na Fig. 1 mostram que a expressão de

NES-hTERT eficiente e rápida atrasa a progressão das células SQ20B e LNCaP através do ciclo celular.

A superexpressão de

NES-hTERT nas células cancerosas da próstata da pele e diminui o potencial de formação de colónia

in vitro

uma série de transformações são necessárias para as células para se tornar tumorigénica, incluindo o aumento da taxa de crescimento e a capacidade de crescer de uma maneira independente da ancoragem [22] – [24]. A capacidade das células transformadas para formar colónias em ágar mole é um preditor útil em vitro da formação de tumor in vivo [24]. Buscou-se investigar se os efeitos observados na taxa de proliferação após a introdução de

NES-hTERT nas células do câncer de pele e próstata teria um impacto a sua capacidade para formar colónias em agar mole. Para este fim, nós banhado igual número de SQ20B, LNCaP e seu respectivo

derivados NES-hTERT em triplicado em agar mole e permitiu-lhes crescer para até 3 semanas; colónias foram contadas a cada semana usando coloração de cristal violeta. Dada a grande quantidade de colónias formadas nas semanas 2 e 3, em particular nos controles, que marcou o crescimento após 1 semana de crescimento em que as colónias individuais foram ainda facilmente distinguíveis. Os resultados foram reproduzidos duas vezes independentes. painéis superiores na Fig. 2 mostra o número de colónias formadas, painéis inferiores mostram imagens representativas das placas. Em ambos os tipos de células de cancro, a introdução de

NES-hTERT diminuiu significativamente o número de colónias formadas, sugerindo diminuição potencial tumorigénico das células em comparação com os respectivos controlos vazios que expressam vector.

5 × 10

3 células /poço de SQ20B, LNCaP e sua

derivados NES-hTERT foram cultivadas em agar mole por até 3 semanas. o crescimento da colônia foi avaliada a cada semana e colónias contadas com base na coloração violeta cristal. Os gráficos mostram os resultados de colónias contadas em 1 semana, quando as colónias individuais, especialmente nas células de controle, ainda eram facilmente distinguíveis. Colónias foram marcados por dois observadores independentes. Os dados apresentados são a média de duas experiências independentes realizadas em triplicado. As barras representam sd ± média. Imagens representativas das placas são mostrados abaixo de cada gráfico.

A expressão de

NES-hTERT não altera os níveis endógenos de atividade enzimática telomerase, mas aumenta os níveis de telomérica e danos no DNA extra-telomérica

a expressão ectópica de um mutante hTERT cataliticamente inactivo que se comportava como um dominante negativo mostrou inibir eficientemente a actividade enzimática da telomerase, conduzindo à erosão do telómero e diminuição da proliferação de vários tipos de células de cancro. O aumento da apoptose espontânea, reduziu o crescimento das colónias em agar a formação de tumores e diminuiu macio em ratinhos nus foram também observadas [9], [17]. Embora

NES-hTERT é enzimaticamente activo in vitro, não é capaz de alongar os telómeros in vivo [19]. Assim, é possível que na SQ20B telomerase-positivas e células LNCaP,

NES hTERT-se comporta de uma forma negativa dominante, em última análise conduzindo à diminuição da taxa de proliferação notado acima (Fig. 1). Para testar esta possibilidade, foram analisados ​​os níveis de ARNm da hTERT e a actividade da telomerase em extractos celulares integrais de culas que expressam ou não

NES-hTERT utilizando, respectivamente, RT-PCR e o protocolo de repetição telomérica de amplificação (TRAP). Como esperado, os níveis de ARN de hTERT foram aumentados nas células que expressam ectopicamente o mutante (Fig. 3A). No entanto, não há alterações na actividade da telomerase enzimática foram observados por expressão da proteína mutante, tal como avaliado por TRAP (Fig. 3B), indicando que

NES-hTERT não exerce um efeito negativo dominante sobre a proteína endógena, pelo menos, em termos de actividade enzimática.

(A) Níveis de hTERT ARN foram aferidas por RT-PCR. GAPDH foi amplificado e utilizado como controlo de carga. (B) 100 ng de extractos celulares totais foram usadas para executar a TRAP. A seta indica o controlo interno do ensaio. Os controlos positivos e negativos não são mostrados.

Em fibroblastos negativos da telomerase, a expressão de

NES-hTERT leva a telomérica e danos no DNA extra-telomérica [19]. Assim, outra possível explicação para a diminuição da taxa de proliferação é que

NES-hTERT induz danos no ADN nas células cancerosas, que por sua vez, retarda sua capacidade de progredir através do ciclo celular. Testámos esta hipótese através da avaliação da presença da forma fosforilada da variante da histona H2A, γH2AX, e uma proteína (53BP1) 53 de ligação. Nós também detectados danos no DNA directamente no telómeros por imuno-fluorescência de hibridação in situ (imuno-FISH) em células individuais, dano mitocondrial foi avaliada por PCR quantitativo específico para o gene (QPCR) [25] – [27].

a forma de histona H2A fosforilada na serina 139 (S139 de γH2AX) é essencial para o reconhecimento eficiente de locais de DNA dupla vertente Break (DSB). Centenas ou milhares de moléculas γH2AX gerar focos nuclear que pode ser encontrado no local de cada ORL incipiente por imunocoloração com anticorpos para γH2AX [28] – [30]. 53BP1 é activado como parte da resposta a danos no ADN (RDA) e também formar focos [28], [29], [31]. Foram realizadas análises de célula única em SQ20B, células LNCaP e seu respectivo

derivados NES-hTERT como descrito anteriormente [19], [29]. As células foram classificadas como tendo danos no ADN, se eles foram positivos para ambos γH2AX e focos 53BP1. Número e tamanho de focos detectados em cada única célula foram quantificados e são representados na Fig. 4A. Em ambas as linhas celulares a quantidade de focos foi significativamente aumentada pela expressão de

NES-hTERT (

p

= 0,006 para SQ20B e 0,034 para as células LNCaP). É de salientar que a expressão da proteína mutante conduziu a um aumento significativo em células que apresentam focos maiores. Por exemplo, o número de SQ20B

sub-células NES hTERT que mostra seis ou mais focos foi três vezes maior do que em células de controlo (SQ20B

P

= 0,004) (Fig. 4A).

p> (a) células foram imunocoradas com anticorpos contra γH2AX e contra 53BP1. O ADN foi contrastadas com DAPI. O gráfico mostra a percentagem de células positivas para ambos γH2AX e focos 53BP1 e o número e tamanho de focos por célula (representada pelas diferentes cores de acordo com a rotulagem do gráfico). Bares são a média ± S.D. (B) coloração ImmunoFISH para visualizar simultaneamente ADN focos danos e telómeros. DAPI foi utilizado para contracoloração ADN. Gráfico mostra porcentagem de DNA focos danos localizados na telômeros (TIF) por uma única célula. (C) a integridade do mtDNA foi analisada por QPCR em três experiências independentes. Gráfico mostra frequência lesão estimado ± S.E.M.

Em seguida, avaliamos os níveis de focos induzida por telômero (TIF), que têm sido descritos como focos danos no DNA apresentada em locais teloméricas. TIF podem surgir pela erosão dos telômeros gradual devido à proliferação celular contínua ou por danos estocástica DNA telomérico [31] – [34]. Nós adoptado um protocolo que anteriormente descrito [29], e o número de células positivas TIF foi calculada com base no número total de células analisadas. Uma célula foi considerado positivo quando TIF-50% de danos no ADN maior de co-localizada com telómeros. Como mostrado na Fig. 4B, os níveis de células TIF-positivas foram significativamente aumentada através da expressão de hTERT o mutante. Com efeito, as células TIF-positivas aumentou cerca de 2 vezes no fundo enquanto LNCaP em SQ20B esta melhoria foi menos pronunciado (Fig. 4B). Em células SQ20B, o nível basal de TIF foi elevada: cerca de 45% das células eram TIF-positiva. Tão alto nível basal de danos dos telômeros foi inesperada uma vez que estas células expressam telomerase endógeno que presumivelmente mantém seus telômeros. No entanto, a introdução de

NES-hTERT levou a um aumento adicional em TIF que foi detectado em cerca de 70% de todas as células analisadas (Fig. 4B, as barras do lado esquerdo).

Finalmente, analisou-se o mtDNA integridade por qPCR, como anteriormente mostraram que a expressão de

NES-hTERT foi associada com disfunção mitocondrial, incluindo a perda de integridade mtDNA em fibroblastos primários. Tais efeitos foram intimamente ligado ao dano ao DNA nuclear detectado no telomérica e locais extra-telomérica [19].

Assumindo que o dano é distribuída aleatoriamente, QPCR permite uma visão global da integridade do genoma em estudo [25 ] – [27]. O ensaio mede a integridade do ADN, utilizando alvos de PCR longos, neste caso, de 8,9 kb de comprimento, que é de cerca de 2/3 de toda a mtDNA. Dadas as condições idênticas, a partir de ADN de controlo e amostras tratadas amplifique diferente, dependendo do número de lesões presentes no modelo por o tempo da reacção. Por exemplo, o ADN das células expostas a UV amplifica menos de ADN a partir do respectivo controlo não-tratado [35]. A quantidade de danos pode ser expressa como o número de lesões por 10 kb assumindo uma distribuição de Poisson das lesões no modelo. A presença de lesões reflecte que a amostra de interesse amplifica menos do que o seu controlo, enquanto que o número de lesões negativo pode ser observada quando o DNA de uma determinada amostra amplifica melhor do que o respectivo controlo. Para controlar possíveis alterações no número de cópias do mtDNA, um curto fragmento do genoma mitocondrial é também amplificado, a fim de normalizar os dados. limite de sensibilidade da técnica é uma lesão /10

5 bases (para mais detalhes sobre o ensaio, ver referências [25] -.. [27] e [35]

Os dados na Fig 4C refletem a média ± SEM de 3 análises independentes. os níveis basais de lesões nos controlos foram calculados com base na amplificação média das amostras de controlo de cada linha celular, que foi então usada como uma referência para comparar cada controle individual (para mais detalhes ver o secção métodos). Como esperado, tanto na expressão fundos celulares de

NES-hTERT aumentou significativamente os níveis basais de dano mitocondrial (Fig. 4C), sugerindo que a disfunção mitocondrial, também é amplificado em células cancerosas através da expressão da proteína mutante.

Tomados em conjunto, os dados apresentados na Fig. 4 mostram que a expressão de

NES-hTERT de telomerase no SQ20B-positivas e células LNCaP conduz a danos no ADN nos locais de teloméricas e extra-teloméricas, que não são causada por uma diminuição nos níveis de enzima ativa no núcleo, mas pode estar associado a mitocôndrias disfuncionais.

NES-hTERT aumenta a sensibilidade ao estresse genotóxico em células de câncer de pele

expressão de telomerase tem sido associada com a modulação da morte celular induzida por agentes genotóxicos. Sensibilização, promoção e nenhum efeito sobre a apoptose e /ou necrose foram relatados, os quais parecem depender do tipo de células em estudo, o agente genotóxico utilizado e, em particular, sobre o comprimento dos telómeros [17], [36] – [45]. Dado o aumento significativo nos níveis basais de danos nucleares e mtDNA observado aquando da expressão da hTERT mutante, foi investigado se as células seriam ainda sensibilizados ao stress genotóxico. Para estas experiências, foram selecionados células SQ20B, que são conhecidos por serem altamente radiorresistente tanto em termos de danos no ADN e perda de capacidade proliferativa [46], [47].

Num primeiro conjunto de experiências, nós exposta as células a raios y

137Cs. células SQ20B e sua

NES-hTERT derivado foram semeadas em números iguais e foram enriquecidos em G1 durante 48 horas antes da irradiação por manutenção no estado confluentes. Isto é importante porque as células em diferentes fases do ciclo celular diferem na sua sensibilidade à radiação [48]. As células foram expostas a 1 Gray (Gy) de radiação γ- (0,65 Gy /min), e analisou-se o DNA nuclear (DNAn) danos por qPCR imediatamente após a exposição através da monitorização da integridade de um fragmento de 13,5 kb do gene da globina β [ ,,,0],25] – [27]. Os resultados apresentados na Fig. 5A demonstram claramente um aumento significativo na quantidade de danos no ADN γ induzida por raios em SQ20B

sub-células NES hTERT. Considerando que em células SQ20B de controlo, uma lesão é observada em cada 50 kb do genoma, o nível de danos detectados em SQ20B

células NES-hTERT é 5 vezes maior, traduzindo-se uma lesão cada 10 kb de ADN de cadeia dupla ( Fig. 5A).

(danos a) DNA nuclear foi estimado em SQ20B e sua

derivado NES-hTERT imediatamente após a exposição a 1 Gy de radiação gama utilizando QPCR. Os resultados representam a média de três experiências independentes ± S.E.M. (B) As células foram tratadas com 200 uM de H

2O

2 durante 60 minutos e deixou-se recuperar durante 24 horas em meio condicionado. Neste ponto, as células foram colhidas e o número de células apoptóticas, mortas e viáveis ​​foi avaliado por citometria de fluxo utilizando PI e YOPRO-1. Os resultados são representativos de três experiências independentes. (C) A mesma quantidade de células viáveis ​​(500000) foram plaqueadas de novo após o H

2O

2 exposições e a sua taxa de crescimento foi seguido durante 2 semanas. O número de células foi contado utilizando um hemocitómetro em cada 24 horas e as células tornaram-se confluentes tempo depois. Como o número de SQ20B tratados

NES-hTERT não se alterou nas 2 semanas seguintes, apenas os dados por 24 horas pós-tratamento são mostrados. Os resultados são a média de três experiências independentes ± S.E.M. (* P≤0,05).

Em seguida, determinar se as células seriam sensibilizados a outros tipos de estresses. Para este fim, eles expostos a peróxido de hidrogénio (H

2O

2) e analisadas a morte celular por citometria de fluxo. Nós escolhemos H

2O

2 por causa da nossa experiência com este estressor oxidativo; as experiências foram realizadas como descrito por nós anteriormente [21], [49], [50]. Resumidamente, igual número de células SQ20B foi semeada 16 horas antes do H

2O

2 exposições. As células foram tratadas com 200 uM H

2O

2 durante 60 minutos em meio basal na ausência de FBS e foram colhidas, quer imediatamente após a exposição a H

2O

2 ou deixados a recuperar durante 24 horas em meio de crescimento condicionado. Em ambos os pontos, a quantidade de células mortas e apoptóticos foi pontuada com base na captação de iodeto de propídio (PI) e YOPRO-1 coloração. YOPRO-1 é um corante verde fluorescente que detecta especificamente células apoptóticas [51] – [55]. As células foram analisadas por citometria de fluxo para quantificar com maior confiança a percentagem de células viáveis, apoptóticas e mortas. Como não há alterações significativas nestes parâmetros foram observadas imediatamente após o

2O

2 tratamento H, os dados apresentados a seguir referem-se ao ponto de recuperação de 24 horas.

Figura 5B ilustra as experiências que são representativos de 3 análises independentes. Um grande aumento na quantidade de YOPRO-1 e células PI-positivas foi observado no fundo SQ20B tratada expressando o mutante de hTERT (Fig. 5B). A quantificação do número de células viáveis, mortas e apoptóticas revelou que, enquanto um aumento de 2 vezes no número de células mortas (ou PI-positivas apenas ou PI e YOPRO positivo) foi observada em SQ20B 24 horas após os tratamentos, este aumento foi cerca de 5 vezes em SQ20B expressando

NES-hTERT (Fig. 5B). Não há diferenças significativas na taxa basal de células mortas /apoptóticas foram detectadas quando se comparam SQ20B não-tratado com o derivado de-expressando mutante (Fig. 5B, os painéis superiores).

Para estudar os efeitos de longo prazo da tratamentos, que, em seguida, seguiu as taxas de proliferação de controle e SQ20B tratada e SQ20B

NES-hTERT por 2 semanas após o H

2O

2 exposição. Iguais números de controlo e as células tratadas viáveis ​​(0,5 × 10

6) foi preparada e o seu número contadas utilizando um hemocitómetro nas primeiras 24 horas e cada hora células atingiram 100% de confluência em seguida. Enquanto os controlos e tratados SQ20B duplicou em número de pelo menos uma vez nos primeiros 24 horas, não se observou qualquer alteração no número de células em tratados SQ20B

NES-hTERT (Fig. 5C). Notavelmente, estas células permaneceram em repouso durante 2 semanas adicionais quando finalmente iniciado dobrando (dados não mostrados). Estes resultados são particularmente intrigante, considerando que SQ20B abrigar uma p53 mutante que é incapaz de induzir a barreira G1-S a um dano do ADN [46], [47].

Tomados em conjunto, os dados mostrados na Fig. 5 demonstram que a expressão de

NES-hTERT é capaz de sensibilizar SQ20B a radiação y e ao estresse oxidativo causado por H

2O

2.

Discussão

o presente estudo mostrou que a introdução de

NES-hTERT, um mutante que apresente defeitos de vaivém núcleo-citoplasma, em carcinoma espinocelular (SQ20B) e câncer de próstata (LNCaP) células resulta em atrasos significativos na progressão do ciclo celular, diminuição da proliferação e taxa de crescimento independente de ancoragem (figuras 1, 2). Estes efeitos não foram associados com atividade enzimática telomerase endógena diminuído desde a expressão da hTERT mutante não alterou a actividade TRAP (Fig. 3). Observou-se também aumento de danos ao DNA em telomérica e locais extra-teloméricas, e maior número de lesões do mtDNA em condições normais após a expressão de

NES-hTERT (Fig. 4). Notavelmente, o mutante hTERT sensibilizados células SQ20B que de outra forma altamente resistente a danos no DNA induzidos por radiação ionizante e à morte celular induzida por H

2O

2 (Fig. 5). Tomados em conjunto, nossos dados sugerem manipular o NES de hTERT ou vaivém subcelular da telomerase como novo e eficiente significa para neutralizar o crescimento de células tumorais.

NES-hTERT afeta ciclo celular e tumorigenicidade de câncer de células

em