Abstract
Usando o nosso conjunto de dados (GSE50760), previamente estabelecido por seqüenciamento RNA, o presente estudo teve por objetivo identificar genes regulados positivamente associados com o colorectal cancer (CRC) metástase hepática (CLM) e verificar o seu comportamento biológico. Os potenciais papéis de genes candidatos em tumores foram avaliados através de ensaios de proliferação celular e invasão. As amostras de tecidos foram coletadas de 18 pacientes de CRC com CLM síncrona e duas linhas celulares de CRC (SW480 e SW620) foram usados para transfecção e clonagem. Os papéis dos genes identificados no CLM foram verificadas utilizando imuno-histoquímica em 48 ratinhos nus após o transplante de células interna do baço CRC. ARNm e expressão de proteína foi determinada em tempo real por RT-PCR quantitativa e western blot, respectivamente. Nove genes foram inicialmente seleccionados de acordo com a relevância da sua função molecular e processo biológico e, por fim,
ALDH1A1
e
IGFBP1
foram escolhidos com base na expressão de mRNA diferencial e uma correlação positiva com a expressão da proteína. A sobre-expressão de ALDH1A1 e IGFBP1 de forma significativa e dependente do tempo diminuiu a proliferação de células (
P
≤ 0,001-0,003) e suprimiu a invasividade por ≥3 vezes sobre células de controlo (
P
0,001) na linha de células SW480, ao passo que tinha um ligeiro efeito sobre a redução da proliferação de células SW620. Os níveis de E-caderina, N-caderina, claudina-1, vimentina e expressão de proteína foram significativamente maiores no CLM do que em tecidos de tumor primário (
P
0,05). No entanto, o interruptor de caderina, nomeadamente, a sobre-expressão de N-caderina com a diminuição da expressão de E-caderina, não foi observada nos tecidos da MAC e células transfectadas CRC. Independentemente da proliferação reduzida e invasão encontrado no
In vitro
ensaios celulares, a sobre-expressão persistente de β-catenina, vimentina, e ZO-1 em células que sobre-expressam IGFBP1 SW480 possivelmente contribuem para o desenvolvimento CLM em ratinhos implantados com IGFBP1 que sobre-expressam células SW480 (ocorrências CLM:. SW480 /
camundongos -transfected IGFBP1
vs
SW480 /vectores e SW480 /
ALDH1A1
-transfected ratos, 4/8
vs
. 0/10,
p
= 0,023). Em conclusão, ALDH1A1 e IGFBP1 são diferencialmente sobre-expressos em CLM e pode desempenhar um papel duplo, funcionando como ambos os supressores de tumor e promotores metástase em CRC
Citation:. Kim JC, Ha YJ, Tak KH, Roh SA, Kim CW, Kim TW, et ai. (2016) Comportamento Complexo de ALDH1A1 e IGFBP1 no fígado metástase de um câncer colorretal. PLoS ONE 11 (5): e0155160. doi: 10.1371 /journal.pone.0155160
editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, United States |
Recebido: 13 de dezembro, 2015; Aceito: 25 de abril de 2016; Publicado em: 06 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Um dado definiu anteriormente gerado pela RNA-Seq e disponível na expressão gênica NCBI Omnibus banco de dados público sob o número de acesso foi utilizada GSE50760
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Korea Research (2013R1A2A1A03070986), Ministério da ciência, TIC e Planejamento Futuro, ea Saúde Korea 21 R D Projeto (HI06C0868 e HI13C1750), Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia
CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
metástases do fígado ocorre frequentemente no cancro colorectal (CRC), resultando na sobrevivência das células tumorais disseminadas no fígado. As células tumorais que escapem do tumor primário e chegar a um local metastático interagir com o microambiente [1]. Em metástases hepáticas de CRC (CLM), o destino das células de tumor é determinada principalmente pelas suas interacções com células sinusoidais /extra-hepáticas sinusoidais [2]. As células estreladas hepáticas desempenham um papel importante na CLM soltando vários factores que promovem CLM, incluindo factores de crescimento [factor de crescimento transformante-β (TGF-β), factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) -I] metaloproteinases e [3]. Os seis membros da família de proteínas de ligação a IGF (IGFBP) foram inicialmente caracterizados como reservatórios passivos de IGF em circulação, mas foram mais tarde demonstrado que desempenham diversos papéis em compartimentos intracelulares e pericelulares na regulação do crescimento e sobrevivência celular [4]. No entanto, estudos anteriores que investigaram as relações entre os níveis de IGFBP soro alterado ea presença de risco de vários cancros tiveram resultados inconclusivos e contraditórios [4,5].
Por outro lado, aldeído desidrogenase 1A1 (ALDH1A1), uma das 19 isoformas ALDH, afeta a atividade ALDH de células-tronco cancerosas (CSCs). níveis ALDH1A1 parecem estar positivamente correlacionada com o prognóstico de vários cancros, apesar de uma avaliação combinada pode melhor melhorar o seu potencial de prognóstico [6]. Ao mesmo tempo, porque ALDH1A1 desempenha um papel particular na desintoxicação agentes quimioterápicos classe ciclofosfamida, supressão ALDH1A1 possivelmente sensibiliza CSCs cólon para estes regimes.
tecnologia de RNA-Seq fornece abundante informação transcriptoma qualitativa. No entanto, conjuntos de dados valiosos precisam ser maximamente usado para extrair moléculas candidatas de acordo com endpoints biológicas específicas, utilizando ferramentas computacionais e experimentais adequadamente estratificadas. Como os dados de ARNm e expressão de proteína são complementares, a medição simultânea de ambos fornece uma melhor compreensão da biologia dos sistemas complexos [7]. Enquanto isso, repetições biológicas são essenciais em experimentos de RNA-Seq para tirar conclusões generalizadas sobre as diferenças entre dois ou mais grupos [8].
Uma vez que alguns genes têm funções duplas, como ambos oncogênicos e tumor-supressor, ele precisa ser biologicamente verificado que moléculas candidatas associados com CLM promover ou inibir a progressão do tumor. Por exemplo, a natureza de protecção de autofagia tem um duplo efeito sobre o cancro, actua como um supressor de tumor nos estágios iniciais de tumorigénese mas suportando a progressão do cancro em tumores estabelecidos [9]. Da mesma forma, a oncoproteína c-Myc podem simultaneamente induzir tumores com alta frequência e massiva de morte celular programada em modelos de ratinho transgénicos mais [10]. sinalização de TGF-β é outro exemplo de uma molécula com um efeito duplo, actuando tanto como supressor de tumor e promotor [11]. Em modelos de ratos, vários cancros sólidos, incluindo CRC, revelou uma função bifásica para TGF-β, pelo que inibe a fase inicial de desenvolvimento de neoplasias, mas posteriormente aumenta a progressão maligna e metástase.
O principal objectivo do nosso estudo foi utilizar a sequenciação de ARN para seleccionar genes significativamente regulada positivamente associados com CLM. Verificamos seu comportamento biológico e determinar se os genes selecionados foram implicados na CLM usando amostras de tecido correspondentes (epitélio normal do cólon, tumor primário e metástases hepáticas) do mesmo assunto e um
in vivo
modelo animal.
Materiais e Métodos
triagem inicial de genes relacionados à CLM a partir dos dados set Online
o protocolo de estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board para genética Humana e Pesquisa Genômica do Asan Medical center, Seoul, Coreia (registro nº. 2014-0150). Todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito. Este estudo também foi analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Instituto Asan para as Ciências da Vida, Seoul, Coreia (registo n. 2014-03-055). A comissão age de acordo com o instituto de Recursos Animais de Laboratório (ILAR) guia. Um conjunto de dados gerado anteriormente pela RNA-Seq e disponível na expressão gênica NCBI Omnibus banco de dados público sob o número de acesso GSE50760 foi utilizado [12]. As amostras de tecidos foram coletadas de 18 pacientes de CRC com CLM síncrona durante o ensaio RNA-Seq e de um adicional de 10 pacientes para o estudo atual (S1 Tabela). Todos os pacientes tiveram CRC com metástase hepática síncrona. Os pacientes foram excluídos se eles tinham uma história prévia de qualquer tipo de câncer, o câncer concorrente, CRC hereditária ou doença inflamatória intestinal. amostras de tecido individuais consistia em epitélio do cólon normal de correspondência (NCE; 5 cm da borda do tumor), CRC primário (PCC), e metástases do fígado (CLM) histologicamente identificadas como adenocarcinoma. A expressão de ARNm foi comparado entre PCC e CLM pela RNA-Seq 998 para seleccionar genes com alterações ≥2-vezes na expressão com base em um teste de rácio de probabilidade GLM (
P
0,001) (Tabela S2) [13 ]. Após a exclusão de 309 genes específicas do fígado com base na base de dados tigre [14], 689 genes foram ainda filtrados para seleccionar genes que 97 foram regulados positivamente de forma consistente em 50% dos pacientes de CRC examinados (Tabela S3). Estes genes foram finalmente reduzida a nove genes de acordo com a relevância da sua função molecular e processo biológico [15], ou seja, o crescimento e proliferação celular, matriz extracelular, a transição epitelial-mesenquimal (EMT), e /ou células-tronco cancerígenas, angiogénese , quimiotaxia e apoptose, conforme determinado pelo gene ontologia Consortium (https://geneontology.org):
IGFBP1
, factor de crescimento de hepatócitos activador (
HGFAC
), ligando de quimiocina 16 (
CCL16
), inibina beta E (
INHBE
), fator ativador de transcrição 5 (
ATF5
), proteoglicanos 4 (
PRG4
), caderina tipo 2 1 (
CDH2
),
ALDH1A1
e ERBB gabarito receptor inibidor 1 (
ERRFI1
) (Fig 1).
Seis genes mostraram diferenças na nível de expressão de mais de 1 vezes na PCC (2
ΔCtPCC-ΔCtNCE) em comparação com CLM (2
ΔCtCLM-ΔCtNCE) (indicando a regulação positiva de genes relevantes). *
p
≤ 0,001 entre PCC e CLM. CLM, metástases hepáticas de câncer colorretal; PCC, cancro colo-rectal primário.
isolamento do ARN e em tempo real a transcrição reversa-PCR
O ARN total foi extraído a partir de amostras de pacientes e linhas celulares utilizando TRIzol
® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total por amplificação utilizando iniciadores aleatórios e SuperScript II RT (Invitrogen). Os iniciadores para genes alvo são listados na Tabela S4. desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (
GAPDH) foi usada como um controlo interno. Em tempo real quantitativo RT-PCR (RT-PCR) foi realizada num LightCycler 96 utilizando o SYBR Green I Mistura de PCR (Roche, Mannheim, Alemanha). A reacção foi iniciada com a ciclagem de pré-incubação a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de amplificação (95 ° C durante 10 seg, a Tm para 10 seg e 72 ° C durante 10 seg). O procedimento de fusão incluiu três condições (95 ° C, 65 ° C, e 97 ° C durante 10 seg), e o arrefecimento foi finalmente realizada a 37 ° C durante 30 seg. O nível relativo de expressão de genes foi determinada utilizando o método -ΔΔCt [16]. O valor Ct foi definido como o ciclo PCR limiar quando o produto amplificado foi detectado pela primeira vez.
linhas de células colorretal, transfecção, e clonagem
As 10 linhas celulares de CRC (DLD-1, HCT116, HCT15, HT29, LoVo, LS174T, RKO, SW480, SW620, e WIDR), duas linhas normais do cólon de células (CCD-18Co e CCD841), e fibroblastos 3T3 foram adquiridos a partir da American Type Tissue Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino e 1% (w /v), penicilina e estreptomicina seguindo as recomendações do fornecedor. As expressões de mRNA relativa de
ALDH1A1
e
IGFBP1
eram insignificantes em comparação com o
GAPDH
expressões em células SW480 (clonados a partir CRC primária) e células SW620 (clonado a partir da linfa metastático nós do mesmo assunto) (S1A FIG).
ALDH1A1
e
IGFBP1
cDNAs (Origene, Rockville, MD) foram amplificadas por PCR e subclonado DDK-marcado pCMV6-entrada para transfecção estável (Origene). transfecção transiente foi realizada em células SW480 e SW620 CRC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). linhas de células de controlo foram estabelecidas através de transfecção com vector vazio. ALDH1A1- ou células que expressam IGFBP1 foram gerados por selecção com G418 durante 10 dias, a selecção de pelo menos dois clones para cada linha celular. expressões estáveis de ALDH1A1 IGFBP1 e foram confirmados por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente [17].
transferência de Western e imuno-histoquímica (IHC)
As proteínas foram extraídas das células cultivadas usando tampão de lise celular ( Cell Signaling, Beverly, MA, EUA). Quantidades iguais de proteínas foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA), os quais foram bloqueados em leite desnatado a 5% em TBST. As membranas foram depois incubadas com anticorpos de anticorpo primário e conjugados com HRP secundário [anti-ALDH1A1, anti-fosfo-FAK (Tyr397), anti-FAK, anti-survivina, anti-β-catenina, anticorpos anti-myc, e EMT amostrador anticorpo kit (Cell Signaling); anti-IGFBP1, anti-IGFBP1, anti-CD44 e anti-CD166 anticorpos (Abcam, Cambridge, UK), anticorpo anti-CD133 (MyBioSource, San Diego, Califórnia, EUA)]. Os complexos específicos foram detectados utilizando um kit de SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Os dados foram quantificados e analisados usando um densitómetro calibrado GS-800 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). valores de intensidade da banda relativos foram calculados através da normalização da intensidade absoluta experimental para que a banda de β-actina correspondente como um controlo de carga. Adicionalmente, cinco amostras CLM em blocos de parafina foram seleccionados aleatoriamente a partir dos 18 pacientes do inicial de ARN-Seq para examinar o grau de contaminação dos tecidos normais do fígado por IHC utilizando Heppar-1 e CK-7 (DAKO, Carpinteria, CA, EUA) anticorpos monoclonais para hepatócitos e células do ducto biliar, respectivamente, como descrito anteriormente [17] (S2 Fig).
proliferação celular e distribuição do ciclo celular ensaios
células controle e tratadas SW480 e SW620 CRC foram semeadas em placas de 96 poços. A taxa de proliferação foi medida diariamente, durante 5 dias, utilizando um kit de ensaio de proliferação celular (CCK-8: Dojindo, Kumamoto, Japão) num leitor de placas de microtítulo ajustado para medir a absorvância a 450 nm (Tecan, Melbourne, Austrália). Por citometria de fluxo, ensaios, 5 × 10
5 células foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS), fixadas com etanol a 70% durante 1 h, e foram incubadas com solução de iodeto de propídio (50 ug /mL) (Sigma , St Louis, MO, EUA) durante 30 min. Após lavagem com PBS, 10.000 células fluorescentes para cada amostra foram analisadas pelo sistema FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) utilizando o software do sistema de citometria de fluxo (Becton Dickinson).
Os ensaios de invasão e zimografia
Controle e tratada SW480 e SW620 CRC células (2 x 10
5 células cada) foram semeadas na câmara superior de placas de cultura de 24 poços para ensaios matrigel invasão (BD Biocoat
™: BD Biosciences, San Jose , CA, EUA), de acordo com as orientações do fabricante. O meio de fibroblastos 3T3-condicionado foi colocada na câmara inferior como um quimioatractor. Após incubação a 37 ° C durante 24 h, as células na superfície superior do filtro foram completamente eliminada e os filtros foram corados com violeta de cristal a 0,2% durante 10 min. As células ligadas a três campos diferentes foram contadas sob um microscópio de luz (100 ×), e todos os ensaios foram realizados em triplicado. metaloprotease de matriz (MMP) -2 e MMP-9 actividades no meio de cultura foram examinadas por zimografia em gelatina. Alíquotas de 10 × meios condicionados concentrados foram misturadas com tampão de amostra e sujeito a electroforese num gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% com 0,1% de gelatina (Invitrogen) incorporado como um substrato para as proteases gelatinolíticas sob condições não redutoras, a 125 V durante 2 horas. Os géis foram incubados a 37 ° C durante 16 horas num tampão de desenvolvimento fresco e coradas com 0,5% de azul brilhante de Coomassie R-250 (Bio-Rad). Bandas sobre os géis foram quantificados usando um densitômetro.
In vivo
transplante, crescimento e metástase de células CRC
Foram utilizados oito camundongos (BALB 6 semanas de idade /c-SLC-nu:.. Japan SLC, Shizuoka, Japão) para cada um dos seis grupos com transplante de células diferentes CRC,
i
e
, SW480 /vetor, SW480 /ALDH1A1 , SW480 /IGFBP1, SW620 /vector, SW620 /ALDH1A1, SW620 e /IGFBP1. Um total de 5 × 10
6 células de CRC foram transplantadas para o baço, e os ratinhos foram criados durante 12 semanas, após o que a metástase do fígado foi identificado por imagiologia PET-MRI utilizando um sistema sequencial de imagens animais (NanoScan PET /RM: Mediso , Budapeste, Hungria). Os animais foram sacrificados para examinar tumores transplantados e metastáticos, simultaneamente medida usando paquímetro digital (Mitutoyo, Kanagawa, Japão). Todas as amostras foram histologicamente identificado por hematoxilina e eosina (H E). Coloração
Análise Estatística
características demográficas e biológicas entre os dois grupos e ocorrências CLM entre o
in-vivo grupos de transplante
foram adequadamente comparadas pelo teste exato ou de Student não pareado
t
-teste, conforme apropriado de Fisher. teste de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a relação entre expressões de mRNA e proteína. expressões diferenciais de mRNA e ensaios de atividade celular entre os dois grupos foram comparados por Mann-Whitney
u
-teste. A significância estatística foi atribuído quando os
p
-Valores foram 0,05. Todos os cálculos foram realizados utilizando o software SPSS (ver.21, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
Resultados
genes candidatos possivelmente associado com CLM
O parente a expressão de ARNm dos genes candidatos nove foi avaliada em 10 pacientes com LMC CRC síncrono (Fig 1). A expressão de ARNm relativa era significativamente maior em CLM (2
ΔCtCLM-ΔCtNCE) do que em PCC (2
ΔCtPCC-ΔCtNCE) das amostras, e a expressão de seis genes diferiram por 1 vezes (indicando a regulação positiva de relevante genes) (
p
≤ 0,001-0,003). Entre esses seis genes, os níveis de expressão de mRNA
ALDH1A1
e
IGFBP1
estavam estreitamente correlacionada com os seus valores de expressão de proteína na PCC e tecidos CLM no respectivo paciente (
r
= 0,496 e
p Art 0,001, respectivamente) e ao mesmo tempo apresentou maior expressão na CLM que os tecidos do PCC (
p Art ,001-0,05) (Fig 2). Assim, ALDH1A1 IGFBP1 e foram seleccionados para mais ensaios biológicos. As nossas amostras mostraram CLM homogeneidade célula tumoral 97-99% em IHC, e a média vezes aumenta em ALDH1A1 IGFBP1 e após a normalização para a p-actina expressão foram 6,2 e 3,1, respectivamente, em relação aos tecidos adjacentes normais do fígado (Fig S2) .
Os níveis de
ALDH1A1
(a) e
IGFBP1
(B) foram maiores no CLM do que em tecidos PCC (especificamente em 4 pacientes expressão: # 30, 38 , 43, 47). *
p Art 0,001-,05 entre PCC e CLM. NCE (N), epitélio cólica normal; PCC (P), cancro colo-rectal primário; CLM (M), metástases hepáticas de câncer colorretal.
A superexpressão de ALDH1A1 e IGFBP1 inibe a proliferação celular CRC
ALDH1A1- e células CRC-superexpressão IGFBP1 foram gerados por transfecção cDNA para adquirir a menos dois clones e foram subsequentemente utilizados para medir os efeitos destas proteínas na proliferação de células de CRC (Fig 3). Superexpressão de
ALDH1A1
e
IGFBP1
reduziu drasticamente a taxa de proliferação de células SW480 de uma forma dependente do tempo, que se tornou evidente após entre 4 e 5 dias (
p
0,05). Da mesma forma, ALDH1A1-sobre-expressando células SW620 apresentaram uma taxa de proliferação reduzida no dia 5. Foram examinados os efeitos de ALDH1A1 e IGFBP1 sobre a distribuição do ciclo celular. Consistente com os resultados de ensaios de proliferação, as células SW480 e ALDH1A1- que sobre-expressam IGFBP1 mostrou diminuição da acumulação de células na S e G2 /M fases, em comparação com células SW480 não tratados, ao passo que as diferenças não foram significativas em células SW620.
ALDH1A1and IGFBP1 diminuir especificamente a proliferação de células de CRC (coluna da esquerda) e a acumulação de células na S e G2 /M fases (coluna da direita) em células SW480 (a e C) e as células SW620 (B e D). As taxas de proliferação celular foram medidos utilizando o ensaio de proliferação de células CCK8 e expressas como taxa de proliferação diária. fases do ciclo celular foram medidos num citómetro de fluxo com coloração com iodeto de propídio. *
p Art 0,05 entre o vetor e clone # 1, e
p Art 0,05 ** entre vector e clone # 2, respectivamente.
ALDH1A1 e IGFBP1 inibir a invasão e migração de células CRC
Invasividade foi medido utilizando o número de células CRC invadir a câmara Transwell e expressos como a variação de dobragem entre as células que sobre-expressam e de controlo (Figura 4A). As células SW480 que sobre-expressam IGFBP1 e SW620 apresentaram um número significativo 3,0-5,7 vezes mais baixa de células invasoras do que as células de controlo (
P
0,05). ALDH1A1 que sobre-expressam células SW480 apresentaram de modo semelhante uma redução de 2 vezes na capacidade invasiva (
P
0,05), e que sobre-expressam ALDH1A1 células SW620 mostrou uma tendência para a invasividade reduzida em comparação com células de controlo. O efeito de ALDH1A1 e IGFBP1 na actividade de MMP foi medida por zimografia de gelatina (Figura 4B), que mostrou que as actividades relativas de MMP-2 e MMP-9, em que sobre-expressam ALDH1A1 SW480 e SW620 clones foram significativamente reduzidos em 1,4-3,9 vezes em comparação com as respectivas células de controlo (
P
0,05). As densidades relativas de MMP-2 e MMP-9 bandas de actividade foram significativamente reduzidos em células SW480 que sobre-expressam IGFBP1, mas não na linha celular SW620. Caso contrário, tanto a quinase de adesão focal (FAK) e fosfo-FAK (p-FAK) foram underexpressed em células SW480 que sobre-expressam IGFBP1, e a tendência reversa foi visto em células SW620 (S3A FIG).
Invasividade foi medido pelo número de células de CRC invadindo para a câmara inferior no poço (a e C) e por a actividade gelatinolítica da MMP-2 e MMP-9 (B e D). Todas as células tratado foi significativamente menor invasão nestes ensaios, exceto as células SW620-superexpressão IGFBP1 em zimografia. *
p Art 0,05 * entre vector e clone # 1 e **
p Art 0,05 entre o vetor e clone # 2, respectivamente.
A expressão de moléculas associadas com a transição epitelial-mesenquimal e células-tronco CRC
Nós avaliamos a expressão de transição de 12 epitelial-mesenquimal (EMT ) /moléculas relacionadas com a CSC, utilizando amostras disponíveis de tecidos, células tratadas com vetor e ALDH1A1- e células-superexpressão IGFBP1 (Fig 5). Os níveis de E-caderina, N-caderina, claudina-1, vimentina e expressão foram significativamente maiores do que em CLM nos tecidos PCC (
P
0,05), enquanto bandas correspondentes a caracol, lesma, ZEB1, CD133 e não foram detectados em qualquer uma das amostras de tecido correspondentes. As manifestações de β-catenina, vimentina, e ZO-1 foram significativamente maiores ou mantidos em células SW480 que sobre-expressam IGFBP1 do que em células SW480 ALDH1A1 que sobre-expressam e de controlo, respectivamente (
P
0,05). Caso contrário, a expressão dos quatro marcadores incluindo claudina-1, ZO-1, e CD166 foram significativamente maiores ou mantidos em células que sobre-expressam IGFBP1 do que nas células que sobre-expressam ALDH1A1 e de controlo SW620, respectivamente, (
P
0,05). A expressão de CD44 não foi detectada em células SW620, enquanto a expressão de CD133 não foi identificada em células SW480
.
CRC pacientes com LMC (A), vector, ALDH1A1- e células que sobre-expressam IGFBP1 CRC (B). *
p Art 0,05 entre PCC e CLM ou entre o vector e ALDH1A1- ou clones que sobre-expressam IGFBP1. NCE (N), epitélio cólica normal; PCC (P), cancro colo-rectal primário; CLM (M), metástases hepáticas de câncer colorretal.
IGFBP1 promove metástase hepática em ratos transplantados com células SW480
Após a exclusão de 8 ratos que morreram de causas de tumor-relacionado, primária baço tumores (site de transplante) e metástases hepáticas foram identificadas grosseiramente e histologicamente em 40 camundongos (Fig 6). Os tumores primários foram implantados com sucesso e cresceu em 20-50% em todos os grupos. metástase hepática exclusivamente ocorreu em camundongos implantados com células SW480-superexpressão IGFBP1, ao passo que não foi identificado em ratos de controle ou camundongos implantados com células SW480-superexpressão ALDH1A1 (4/8 ratinhos
vs
. 0/10 ratos,
p
= 0,023). Por outro lado, a metástase do fígado ocorreu nos murganhos tratados com células SW620 de controlo (08/02 ratos), ao passo que não foi identificada em ratos tratados com ALDH1A1- ou células SW620 que sobre-expressam IGFBP1. O diâmetro longo dos CLMS estava na gama de 2.0-16 mm. Independentemente de se utilizaram células SW480 ou SW620, os ratinhos transfectados com vector não expressou IGFBP1 no baço ou do fígado, enquanto que foi sobre-expresso no baço e fígado de
IGFBP1
-transfected ratos xenoenxerto SW480 com CLM (S1B FIG). Caso contrário, ALDH1A1 foi sobre-expressa no fígado, independentemente de linhas celulares. Nós reanalisadas β-catenina e as suas moléculas alvo, tais como c-myc e survivina nos xenoenxertos de IGFBP1- ALDH1A1 e que sobre-expressam células SW480. O ex-heteróloga com CLM mostrou superexpressão concomitante de β-catenina e c-Myc, e este último um sem CLM também expressou eles, exceto para c-Myc no baço (Fig S3B).
Arrows tumores indicados (o baço e fígado foram fixados nas partes superiores e inferiores, respectivamente) e vistas histológicos (H e, × 100; fotomicrografias de baço e de fígado foram fixados nos lados esquerdo e direito, respectivamente, a partir de amostras quadrados vermelhos). CLM, metástases hepáticas de câncer colorretal. Os ratos com CLM estava em ordem (à direita e para baixo), com diâmetro muito tempo: A, não CLM; B, não CLM; C, nº 2 (2,7 mm) # 3 (2-5,3 mm) # 5 (4,4-6,6 mm) # 7 (4,4 mm); D, # 1 (16.0 mm) # 2 (2,2-8,0 mm); E, não CLM; F, não CLM.
Discussão
Vários grupos de genes podem ser eficientemente colhida a partir de um único dados de RNA-Seq definidos de acordo com as ferramentas específicas objectivo e bioinformática utilizados. Nós inicialmente selecionados 998 genes que mostram expressão diferencial ≥2 vezes em tecidos PCC e CLM. A reprodutibilidade dos genes seleccionados foi re-examinada de acordo com a sua pontuação de RNA-Seq utilizando RT-PCR quantitativo e Western blotting numa segunda coorte. genes do núcleo selecionados de acordo com a expressão diferencial usando necessidade RNA-Seq para ser validado em um segundo coorte utilizando critérios rigorosos, que incluem a sua reprodutibilidade e algumas mudanças pós-transcricional [18]. Foram excluídos os genes específicas do fígado devido a sua expressão tende a ser lábil e é afectado por alterações metabólicas e danos tóxicos nos hepatócitos, independentemente da presença de CLM. Nós ainda mais reduzida a selecção de nove genes com base em associação funcional com o processo metastático de CRC. Dois genes,
ALDH1A1
e
IGFBP1
, foram finalmente selecionado para examinar as interações biológicas relacionadas com o CLM porque foram extremamente regulada nos tecidos CLM e ao mesmo tempo mostrou poucas mudanças pós-transcricional e pós-translacionais. Em relação à especificidade destes genes em tumores metastáticos, os níveis de expressão ALDH1A1 e IGFBP1 foram aumentados de 15,6% e 6,3%, respectivamente, em comparação com tecidos normais do fígado, considerando-se uma taxa de contaminação de 3%. No entanto, foi considerado o efeito parácrino de ALDH1A1 e IGFBP1 a partir de tecidos do fígado contaminados, mesmo que fosse fraco.
ALDH1A1 mRNA e expressão de proteínas foram significativamente maiores no CLM que os tecidos do PCC dos nossos pacientes com CLM síncrona. Um estudo relatou que IHC uma relação mais baixa do nível ALDH1A1 na mucosa adjacente à do tecido tumoral (RA /C 1) correlacionada positivamente com capacidade de invasão tumoral e metástase [19]. Inesperadamente, ALDH1A1 superexpressão reduziu a proliferação e invasão de células de CRC e diminuição da actividade de MMP-2 e MMP-9 no nosso estudo. MMP-2 e MMP-9 desempenham papéis importantes na degradação da matriz extracelular e membrana basal, que promovem a invasão tumoral e metástase [20]. Estes resultados sugerem que a sobre-expressão em ALDH1A1 CLM pode actuar como um inibidor de metástases em vez de um indutor de metástase. Se considerarmos a actividade de ALDH de ser marca registrada da CSCs, possuindo proliferação indefinida e potencial metastático [21], a sobre-expressão em tecido CLM dificilmente parece explicar a proliferação reduzida e invasão de células que sobre-expressam ALDH1A1. ALDH1A1 pode ser uma causa ou consequência do trabalho CLM e mais é necessário para determinar o seu papel exacto.
Apesar da falta de provas cabais que justifiquem a estimulação do crescimento do tumor e migração por IGFBP1, o mRNA e os níveis de proteína de IGFBP1 foram significativamente maiores em CLM que os tecidos do PCC em nosso estudo. Em contraste, as células SW480 que sobre-expressam IGFBP1 mostraram taxas inferiores de proliferação e invasão de células não tratadas nos nossos ensaios de células. IGFBP1 tem efeitos inibitórios independentes sobre o crescimento de células de câncer e metástase em estudos pré-clínicos, tanto directamente como através de modulação local dos outros componentes do eixo IGF [4,22]. O outro estudo observacional relatou que os níveis mais elevados de plasma peptídeo C e menores níveis de plasma IGFBP-1 a ao rastreio foram associados com o aumento da mortalidade em pacientes com não-metastático CRC [5].
EMT /CSC é uma evento crítico no início CRC invasão e metástase, e caracteriza-se pela presença de marcadores específicos para cada fenótipo [23]. CD133, CD44, CD166, ALDH1A1 e Lgr5 são marcadores de células-tronco CRC [6]. EMT desencadeia reversão para um fenótipo CSC-like. Nos quatro pacientes com CCR com CLM incluídos no estudo atual, as expressões de E-caderina, N-caderina, claudina-1, e vimentina foram significativamente maiores em CLM de tecidos NCE e PCC, enquanto caracol, lesma, ZEB1 e CD133 mostrou nenhuma expressão detectável em tecidos CLM. Além disso, o chamado “interruptor caderina”, que consiste de sobre-expressão de N-caderina e redução da expressão de E-caderina e é um componente integral da EMT [24], não foi detectada em tecidos ou células de CRC CLM. Os marcadores de sobre-expressa variada dependendo dos genes transfectados e as células, mesmo que os seus clones foram derivados a partir do mesmo paciente (SW480 e SW620). Tomados em conjunto, todas as expressões de marcador /CSC EMT diferiam no respectivo clone e, assim, parece desempenhar diversas funções durante a progressão da CRC. a expressão de CD44 foi significativamente reduzida em células SW620, enquanto a expressão de CD133 foi reduzida em células SW480. Knockdown de CD44 resultou na formação de colónias limitada e reduzida formação de tumores em xenoenxertos, indicando fortemente um papel funcional de CD44 no CRC tumorigênese [25]. CD133 tem sido considerada um marcador de CSCs do cólon e um indicador da agressividade e metástase [20]. Downregulation destes marcadores CSC pode afetar a proliferação e invasão de células SW480 e SW620 transfectadas.
As metástases hepáticas exclusivamente ocorreu em ratos com injecção interna do baço de células SW480-superexpressão IGFBP1, o que pode ser parcialmente explicado pela expressão persistente de