Abstract

O bortezomib inibidor do proteassoma (Velcade) é um agente novo promissor para o câncer de bexiga terapia, mas mecanismos citoprotectores induzíveis podem limitar a sua eficácia potencial. Utilizou-se a expressão do mRNA do genoma completo de perfis para estudar os efeitos de bortezomib sobre a expressão do gene induzida pelo stress num painel de linhas celulares de cancro da bexiga humano. Bortezomib induzida forte regulação positiva da HSP70 inducible isoformas HSPA1A e HSPA1B isoformas de Hsp72 em 253J BV e SW780 (HSPA1A

altos) células, mas apenas induzida a isoforma HSPA1B em UM-UC10 e UM-UC13 (HSPA1A

baixo) células. Bortezomib estimulou a ligação do factor de choque térmico-1 (HSF1) para o promotor HSPA1A em 253JB-V, mas não em células de UM-UC13. -Metilação específica PCR revelou que o promotor HSPA1A foi metilado na HSPA1A

linhas de baixa celulares (UM-UC10 e UM-UC13), e exposição ao agente demetilante cromatina 5-aza-2′-desoxicitidina restaurado expressão HSPA1A. A sobre-expressão de Hsp72 promovido bortezomib resistência nas células de UM-UC10 e UM-UC13, enquanto knockdown transiente de HSPA1B ainda sensibilizados estas células ao bortezomib, e exposição ao inibidor HSF1 química KNK-437 promoveu sensibilidade bortezomib nas células 253J B-V. Finalmente, shRNA mediada knockdown estável de Hsp72 em 253J B-V promoveu sensibilidade ao bortezomib

in vitro Comprar e no tumor xenotransplantes

in vivo

. Juntos, nossos resultados fornecem uma prova de conceito para o uso de inibidores de HSP72 para promover a sensibilidade bortezomib em cancros da bexiga e sugerem que a segmentação seletiva de HSPA1B poderia produzir letalidade sintética em tumores que exibem promotor HSPA1A metilação

Citation:. Qi W , Branco MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) Inibição da Induzível choque térmico Protein-70 (Hsp72) Melhora bortezomib-morte celular induzida em células de câncer de bexiga humana. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10.1371 /journal.pone.0069509

editor: Kevin Robert Kozak, da Universidade de Wisconsin Escola de Medicina e Saúde Pública, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de dezembro de 2012; Aceito: 10 de junho de 2013; Publicação: 18 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Qi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo SPORE MD Anderson Cancer no Genitourinary (P50 CA091846), Cancer Support Center Grant (CA016672), e proteasoma inibição e ER estresse (R01 CA127494). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou perparation do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

estudos recentes têm demonstrado que o aumento da síntese de proteína (tradução) é crucial para a transformação neoplásica. Como consequência deste aumento, as células cancerosas parecem ser particularmente vulneráveis ​​aos agentes que inibem a eliminação de proteínas agregadas ou deformadas produzida como um subproduto da síntese de proteínas normais. O proteassoma desempenha um papel central na depuração de proteínas danificadas, e inibidores de proteassoma induzem a morte de células de tumor em grande parte, através de agregação da proteína e proteotoxicidade. No entanto, os mecanismos citoprotectores são regulados positivamente pela inibição de proteassoma, a limitar o impacto sobre a morte de células de cancro [1], [2], [3]. Portanto, é possível que os tumores que possuem defeito (s) nestes mecanismos citoprotectores irão ser especialmente sensíveis a inibidores de proteassoma. Se os mecanismos citoprotectores relevantes podem ser identificados, pode ser possível identificar esses tumores prospectivamente. Alternativamente, pode ser possível desenvolver abordagens terapêuticas que perturbam estes mecanismos citoprotectores, promovendo assim a sensibilidade inibidor do proteassoma em tumores que seriam resistentes a esta classe de drogas.

O choque térmico também induz a agregação de proteínas e proteotoxicidade com choque térmico proteínas (HSPs) que promovem a tolerância ao calor, impedindo inadequado induzida pelo stress agregação de proteínas, auxiliando na redobragem apropriada de proteínas desnaturadas, e, se necessário, promovendo a sua degradação [4], [5], [6]. Os membros da família Hsp70 estão entre as proteínas mais altamente conservadas na evolução e desempenham papéis críticos nesses processos [7]. A principal membro de tensão-induzível da família Hsp70 chaperone é referido como Hsp72 e é codificada por dois genes, HSPA1A e HSPA1B, que produzem isoformas Hsp72 que partilham todos menos dois aminoácidos e pensa-se ser funcionalmente redundantes [8]. Hsp72 expressão é controlada através da activação rápida de factor de choque térmico-1 (HSF1), um factor de transcrição que se liga a diversos elementos de resposta específicos localizados dentro dos promotores de isoformas Hsp72 e os promotores de outras chaperonas induzida por calor citoprotectores [9]. Hsp72 é altamente homóloga com a proteína de 78 kDa de glucose regulada (HSPA5, GRP78 /BiP) que desempenha um papel central na coordenação da activação da resposta de proteína desdobrada (UPR) e também é induzida por inibidores do proteassoma [10]. Hsp72 é constitutivamente expressa em níveis elevados em tumores malignos de várias origens [11], [12], a promoção de sobrevivência de células de cancro [13], [14]. Importante, Hsp72 também é robustamente induzida por inibidores de proteassoma [15], [16].

Em um estudo anterior, informou que cerca de metade das células de câncer de bexiga humanos são resistentes aos efeitos citotóxicos de bortezomib

em vitro

[17]. Aqui, utilizamos a expressão do gene de perfil para examinar os mecanismos citoprotectores que contribuem para a resistência bortezomib, e descobriram que Hsp72 é um dos genes induzidos mais robusta ao nível do ARNm após exposição bortezomib. No entanto, descobrimos que a expressão de Hsp72 é em um subconjunto de células de cancro da bexiga (UM-UC10 e UM-UC13) como um resultado da metilação do promotor da isoforma específica HSPA1A-isoforma. Estas células apresentam um aumento da expressão da isoforma HSPA1B tal que basal e os níveis de proteína pct72 induzida por bortezomib são semelhantes aos encontrados em linhas de células que expressam ambas as isoformas A1B (253JB-V e SW780) e A1A. Nós também relatam que a supressão da indução de Hsp72 morte celular induzida por bortezomib melhorada em ambos 235JB-V e de UM-UC10, e a sobre-expressão de Hsp72-protegido UM UC10 e células de UM-UC13 a partir citotoxicidade induzida por bortezomib. No geral, independentemente de qual isoforma gera a expressão da proteína Hsp72, os nossos dados mostram que a supressão da indução Hsp72 aumenta bortezomib sensibilidade, e apoiar o desenvolvimento de inibidores HSF1 e Hsp72 para aumentar bortezomib sensibilidade em cancros da bexiga.

Materiais e Métodos

as linhas celulares e reagentes

linhas celulares de cancro da bexiga foram obtidas a partir da linha celular MD Anderson do cancro de bexiga SPORE Repository e mantidos em MEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA). A autenticidade de todos as linhas de células foi confirmada no depósito por impressão digital de ADN, e as suas identidades foram confirmadas rotineiramente durante a experimentação no MD Anderson Caracterizado Linha celular do núcleo [18]. A linha celular 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] e UMUC-13 [20] foram isoladas a partir de pacientes com cancro urotelial. SW780 foi comprado originalmente de American Type Culture Collection (ATCC) em Biocompare.com. Bortezomib foi comprado de ChemieTek (IN, EUA). Para

in vitro

experiências, o bortezomib foi dissolvido em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM, esterilizado por filtração através de um filtro de seringa de 0,22 um, com alíquotas armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. Antes de usar, o estoque foi diluída em meio para as concentrações desejadas. Para a injecção de ratinhos, o bortezomib foi dissolvido em solução salina contendo 10 mg /ml de manitol apenas antes do tratamento.

Viabilidade Celular Ensaios

As células foram expostas ao bortezomib, recolhidas nos pontos de tempo indicados por tripsinização, e ressuspenso em 500 ul de PBS. Cinquenta ul de PBS, pH 7,4, contendo 100 ug /mL de iodeto de propídio (PI) foi adicionado às células ressuspensas, e a absorção de PI (indicativa de morte celular) foram analisadas imediatamente por citometria de fluxo (FACS) em uma Cytomics FC 500 com software CXP (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA

de exclusão de azul de tripano, as células foram recolhidas por tripsinização, coradas com 0,4% de azul de tripano (Invitrogen), e as células foram contadas utilizando um hemocitómetro. A experiência foi conduzida em triplicado.

Análises Microarray

microarrays experimentos foram realizados como descrito anteriormente [21], com modificações menores. o ARN foi isolado a partir de células utilizando o Reagente TRIzol (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY ), seguido por limpeza com kits RNeasy Mini (Qiagen, Germantown, MD). o ARN foi usado para a síntese de ARNc marcado com biotina, o qual foi preparado usando o kit de amplificação de ARN Ilumina (Ambion /Life Technologies), e, em seguida, hibridados com Ilumina Human-HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) fichas. fritas lavadas foram escaneados com BeadStation 500x (Illumina) e as intensidades de sinal quantificadas com BeadStudio (Illumina). O heatmap foi feita utilizando Cluster 3.0 e Java Treeview do laboratório Eisen (https://www.eisenlab.org/eisen/). O conjunto de dados de microarray pode ser encontrado em Gene Expression Omnibus, número de acesso GSE46132.

ARNm Extracção, transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real

extracção de ARNm e a transcrição reversa foram realizadas como descrito anteriormente [22 ]. O ARN foi isolado a partir de células utilizando o Reagente TRIzol (Invitrogen), e síntese de cDNA foi realizada utilizando SuperScript First-Strand III Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen). PCR em tempo real para HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi realizada utilizando um sistema de PCR em tempo real StepOne (Applied Biosystems /Life Technologies). Os conjuntos de iniciadores TaqMan para HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), pan-HSPA1A HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), e para GAPDH (4333764F) foram adquiridos de Applied Biosystems. O protocolo de amplificação consistia de um ciclo a 50 ° C durante 2 min, um ciclo a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s, e os níveis de transcritos foram quantificados usando o comparativo C

método T. Os dados resultantes foram analisados ​​com o software StepOne e expressos como a média das razões de (expressão em relação ao controlo) ± SE e GAPDH serviu como o controlo de carga interna.

tratamento de células com 5-aza-2′ desoxicitidina (5-AzdC)

As células foram plaqueadas a baixa densidade (~ 5 × 10

4 células /cavidade) em placas de 6 poços e deixou-se ligar durante a noite. As células foram então expostas a 5 uM 5-AzdC dissolvido em ácido acético a 50% durante 5 dias. Bortezomib (30 nM) foram então adicionados a cavidades apropriadas 6 horas antes da colheita no dia 5, e as células foram recolhidas para isolamento de ARN. 5-AzdC foi obtido a partir de Sigma.

DNA Metilação Análise

O ADN genómico foi isolado utilizando um kit de isolamento de ADN genómico (Qiagen). ADN (1 ug) foi convertido com bisulfito de sódio usando o EpiTect Bissulfito Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O bissulfito-DNA modificado foi depois submetido a PCR específica para o metilação (MSP). Os iniciadores utilizados para MSP foram concebidos utilizando Methprimer. O conjunto de iniciadores para o ADN metilado foi convertido 5′-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 ‘(directo) e 5′-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3′ (inverso); O conjunto de primers para DNA não metilado convertido foi 5’- TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 ‘(avançar) e 5′- CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3’ (reverso). O protocolo de PCR incluiu uma incubação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 49 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 40 s, seguido de um ciclo de 72 ° C durante 10 min. MSP produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio. Totalmente ADN de controlo e ADN de controlo metilado não metilado foram usadas como controlos.

imunotransferência

As células foram colhidas por tripsinização e foram lisadas em tampão contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na 1 mM

2EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, 1 mM beta-glicerofosfato, 1 mM de Na

3VO4, 1 ug /mL de leupeptina e 1 mM PMSF. extractos de célula inteira (20 ug de proteína total) foram submetidos a dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram sondadas primeiro com um anticorpo monoclonal específico para a Hsp72 (SPA-810, StressGen /Ciências da Vida Enzo, Farmingdale, NY), HSF1 (SPA-901, Stressgen /Enzo) ou beta-actina humana (Sigma, St. Louis , Mo.), e, em seguida, com segundos anticorpos adequados peroxidase de rábano conjugada (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Imunodetecção foi realizada utilizando ECL (Amersham, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante.

Cromatina imunoprecipitação

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) foi realizada com o kit ChIP-IT ™ Expresso enzimática, e chip Kit de Controle -IT ™ (Activo Motif) de acordo com o protocolo do fabricante. As células de controlo e tratados com bortezomib 253JB-V e de UM-UC13 (1,5 × 10

7 cada) foram fixados durante 8 minutos à temperatura ambiente e cortado através de digestão enzimática durante 10 minutos. A cromatina cisalhada produziram bandas entre 200-1500 pb como visualizado por electroforese em gel de agarose. ADN ligado a HSF1 foi precipitado com um anticorpo anti-HSF1 (Stressgen /Enzo, SPA-901). Para amplificar o promotor HSPA1A HSF1-ligado, o ADN precipitado foi submetido a PCR em tempo real usando a Gene Expression TaqMan® Mistura de PCR com o gene Custom TaqMan® iniciadores Expression Assay (ABI) correspondente à região HSF1 de ligação do promotor HSPA1A ( -10 a -180) [23], [24]. PCR em tempo real foi realizado utilizando ABI com StepOne seguintes condições: 5 minutos a 50 ° C; 10 minutos a 95 ° C; depois 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 60 segundos. Os dados apresentados representam resultados de três experiências separadas e ChIP foram normalizados para as reacções realizadas com 1% de entrada. As reacções de PCR de ponto final foram também realizadas como descrito anteriormente [25] para confirmar os resultados de PCR em tempo real. anticorpo IgG normal foi utilizado como um controlo.

Molecular Modulação da Expressão Hsp72

O TRCN0000008762 lentivirais construções à base de pLKO.1 e TRCN0000008757 especificamente como alvo o gene Hsp72 foram adquiridos a Abrir Biosystems, Inc. o vector pLKO.1 vazio foi utilizado como um controlo. Os vírus recombinantes foram produzidas por transfecção com fosfato de cálcio de células HEK293T utilizando protocolos padrão. No dia 2-3 pós-cultura, as células 253J-BV foram incubadas com shRNAs e polibreno (6 ug /ml) para 16~24 horas, e as células transduzidas foram seleccionados em 1 ug /ml de puromicina. Para silenciamento de Hsp72 transiente em células UC10-UM, as células foram incubadas em 6 ou de 24 poços, placas durante 72 horas, com quer não segmentação (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005168-00), ou HSPA1B (L-003501-00) siRNA constrói a partir Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Lipofectamina RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) foi utilizado para melhorar a entrega de siRNA de acordo com as instruções do fabricante. Para a sobre-expressão de Hsp72, o controlo da precisão LentiORF RFP (OHS5832) e de precisão LentiORF clone individual para HSPA1A (OHS5897-100998480) foram adquiridos a Abrir Biosystems, Inc. As células transduzidas foram seleccionados em 5 ug /ml de blasticidina e separação por FACS de células positivas para GFP .

lisossomais Integrity Assays

As células (~1-2 × 10

5) foram semeadas em placas de 6 poços e deixadas a ligar durante a noite. As células foram então expostas ao bortezomib durante 24 h. Após tratamentos com drogas, 100 nM Lyso Tracker Vermelho DND-99 (Molecular Probes Technologies /Life, Grand Island, NY, EUA) foi adicionado às células durante 30 minutos antes da colheita. As células foram tripsinizadas, lavadas uma vez com PBS e ressuspensos em PBS fresco, e a fluorescência foi medida utilizando um fluxo Beckman Coulter FC500 citómetro.

Xenoenxerto Estudos

ratinhos nus atímicos fêmeas foram adquiridos a partir de National Cancer Institute (NCI-Frederick). Os ratos foram alojados e mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em instalações aprovadas pela Associação Americana de Acreditação do Laboratório Animal Care e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura dos EUA, Estados Unidos Departamento de Saúde e Serviços Humanos atuais. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas, M. D. Anderson Cancer Center Animal Care e Use Committee (ACUF Protocolo # 11-00-12734). Os ratos são controlados diariamente, incluindo fins de semana e férias, com a eutanásia realizada utilizando CO2 no caso de qualquer um dos seguintes: tumores maiores do que 1,5 cm, 20% de perda de peso, letargia, incapacidade de obter comida e /ou água, dificuldade respiração, postura arqueada, distensão abdominal equivalente a um rato grávida, ou incapacitado como resultado do crescimento do tumor.

camundongos Nude (NIH, 6 semanas de idade) foram inoculados subcutaneamente (sc) com 2 × 10

253J 6 BV células transduzidas com o constructo HSPA1A shRNA (253JB-V.KDHsp72) ou uma construção de controlo não-direccionamento (253JB-V.NT) (10 ratinhos /grupo). Quando os tumores se tornaram palpáveis ​​(5~7 dias), os ratinhos foram atribuídos aleatoriamente ao controlo ou os grupos de tratamento. Os ratinhos foram tratados i.v. (Através da veia da cauda) quinzenais com 1 mg /kg bortezomib formulado em solução salina contendo 10 mg /ml de manitol num volume de 100 ul com solução salina ou 100 ul contendo 10 mg /ml de manitol como um controlo do veículo. medições de calibre dos maiores diâmetros tumorais perpendiculares foram realizadas duas vezes por semana após o início do tratamento, e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula: W * W * l /2 (em que W e L representado diâmetro transversal, e mais longa longitudinal) . Para H . E a análise, os tumores foram coletadas de ratos 24 horas após o segundo tratamento de drogas e, em seguida, fixado em outubro e 10% de formalina

UCSC Genome Browser de

O navegador UCSC Genome [26] foi usada para identificar a presença de uma ilha de CpG em torno da região promotora do HSPA1A, dentro do navegador do genoma, a enciclopédia de (codificar) base de dados elementos de ADN consórcio [27] foi usada para identificar a presença de metilação em outros tipos de células. O navegador UCSC Genome é publicamente disponível no seguinte site:. https://genome.ucsc.edu/

Estatísticas

As estatísticas foram geradas usando

t

teste de Student funções disponíveis no software GraphPad Prism 5 e Microsoft Excel. Os valores de p 0,05 foram considerados significativos

Resultados

indução diferencial de HSPA1A em células cancerosas da bexiga

Foram selecionados quatro linhas celulares de cancro da bexiga humanos representativos (. 253J BV, SW780, UM-UC10, e UM-UC13) para a caracterização dos mecanismos biológicos moleculares que determinam a capacidade de resposta celular à bortezomib inibidor de proteassoma. Em primeiro lugar, confirmou que as linhas de células eram heterogéneos no que diz respeito às suas sensibilidades à morte celular induzida por bortezomibe como determinado utilizando coloração com iodeto de propidio e análise de FACS (FACS-PI) para medir a perda de integridade da membrana plasmática (Fig. 1A). Em seguida, usamos toda perfil de expressão de mRNA genoma (plataforma Illumina) para identificar os padrões de expressão de genes associados com a sensibilidade e /ou resistência à droga. Bortezomib induzida forte sobre-regulação de ARNm que codifica a principal isoforma indutível da Hsp72 (HSPA1A) na linha de células mais bortezomib-resistente (253J B-V), mas não na linha mais sensível a drogas (UM-UC13) (Fig. S1). Confirmou-se estes resultados usando quantitativo em tempo real de RT-PCR, o que demonstra que o ARNm HSPA1A foi fortemente induzida pelo bortezomib em células 253JB-V e SW780 (~25-60 vezes em relação aos níveis não tratado), enquanto que a expressão induzida aumentou apenas ligeiramente (~2- 4 vezes em relação aos níveis não tratados) em células UM-UC13 UM-UC10 e (Fig. 1B). Notamos também muito baixo basal expressão de mRNA HSPA1A em UM-UC10 e células UM-UC13 (~50-250 vezes menor que 253JB-V e SW780) e estas diferenças foram exacerbadas após a exposição bortezomib tal que os níveis de expressão HSPA1A foram ~1000-3000 vezes mais baixa em células UC13 UM-UM-UC10 e que em 253JB-V e SW780 (Fig. 1B). No entanto, immunoblotting revelou níveis comparáveis ​​de proteína Hsp72 em todas as 4 linhas de células (Fig. 1C).

A. Efeitos de bortezomib sobre a morte celular. linhas celulares de cancro da bexiga (253JB-V, SW780, UM-UC10, UM-UC13) foram incubadas com ou sem o bortezomib 100 nM durante 24 horas e PI /FACS foi utilizada para quantificar a morte celular. Média ± SEM, n = 3. B. Efeitos de bortezomib sobre a expressão de ARNm de Hsp72 isoforma HSPA1A. As células foram expostas a 30 nM para o bortezomib 6 h e HSPA1A foi medido por RT-PCR quantitativo. RQ = quantidade relativa (a GAPDH). Os valores representam a média ± SEM (N≥3) C. Efeitos de bortezomib nos níveis de proteína pct72. As células foram incubadas durante 16-18 h com 30 nM de bortezomib (nM), e os níveis de pct72 foram medidos em lisados ​​de células inteiras por imunotransferência. Borrões são representativos de duas experiências independentes.

HSPA1B de isoformas compensa a perda de HSPA1A Expressão em UM-UC10 e UM-UC13 Cells

Hsp72 é codificada por dois loci genéticos independente (HSPA1A e HSPA1B) que produzem produtos de proteínas altamente homólogas. Nós, portanto, caracterizada expressão HSPA1B nas HSPA1A

células de baixa. Foram utilizados iniciadores específicos para as duas isoformas de Hsp72, HSPA1A e HSPA1B, assim como um iniciador que reconhecia ambas as isoformas (PAN) para comparação. Os dados revelaram que as HSPA1A

células de baixa (UM-UC10, UM-UC13) teve maior expressão da isoforma HSPA1B na linha de base do que as células HSPA1A-altos (253JB-V, SW780) (Fig. 2A). Além disso, a expressão HSPA1B foi mais robusta induzida após exposição bortezomib nas HSPA1A

linhas de células de baixa que faltava a isoforma A1A (Fig. 2B). Importante, expressão medido pelo pan-primário foi semelhante em todas as quatro linhas celulares, corroborando os dados immunoblotting (Fig. 1C). Estes dados sugerem que a expressão aumentada HSPA1B compensou a falta de HSPA1A e representaram a expressão da proteína Hsp72 nas células UM-UC10 e UM-UC13.

A. expressão basal de HSPA1A e HSPA1B isoformas entre as quatro linhas celulares. expressão de HSPA1A e HSPA1B B. bortezomib-induzida entre as quatro linhas celulares. iniciadores específicos para cada uma das isoformas, bem como um pan-iniciador que reconhecia ambas as isoformas, foram utilizados para medir a expressão por RT-PCR quantitativo. Os valores representam a média ± EP (n = 2). RQ = quantidade relativa (a GAPDH).

Falta de HSPA1A inducibilidade em UM-UC10 e Células UM-UC13 é devido a metilação do promotor

O choque térmico factor-1 (HSF1) ativação controla a regulação positiva resposta ao choque térmico e estresse induzido global de Hsp72 [28]. Para testar se a expressão HSF1 estava influenciando diferenças na expressão HSPA1A entre as nossas linhas celulares, medimos mRNA HSF1 e os níveis de proteína na UM-UC13 (HSPA1A

Menor) células 253JB-V (HSPA1A

alto) e. Observamos diferenças modestas no basal e induzida por BZ níveis de mRNA HSF1 entre as células UM-UC13 253JB-V e; Especificamente, 253JB-V mostraram um aumento de duas vezes nos níveis de HSF1 mediante exposição ao fármaco, ao passo que a UM-UC13 mostrou apenas ~1.3 vezes de aumento, mas teve duas vezes mais elevada expressão de mRNA HSF1 na linha de base do que 253JB-V (fig. 3A, painel da esquerda). No entanto, os níveis de proteína apareceu essencialmente igual entre os dois tipos de células (Fig. 3A, painel da direita). Além disso, outros objectivos HSF1 foram fortemente induzido, incluindo a HSPA1B acima mencionado (Fig. 2) e DNAJB1 (Hsp40) (Fig. S2) nas células de UM-UC10 e UM-UC13, sugerindo que não houve defeitos generalizada na activação HSF1 endógeno em estas células. Por isso, concluiu que as células UC10 e de UM-UM-UC13 pode possuir defeito específico (s) na activação mediada por HSF1 do promotor HSPA1A. Consistente com esta ideia, immunoprecipiation cromatina (ChIP) revelou que as células possuíam 253J BV níveis mais elevados de HSF1 que se ligam ao promotor HSPA1A na linha de base e após a exposição do que o bortezomib UM-UC13 (~ 2 vezes e ~ 5 vezes superiores, respectivamente) (Fig. 3B). A dobra-indução de ligação HSF1 pelo bortezomib foi comparada ~ 9 ~ 4-dobra-prega em V e 253JB-UM-UC13, respectivamente. Análise do promotor HSPA1A utilizando o localizador de UCSC genoma revelou que este se encontra dentro de uma ilha de CpG metilada que está em outras linhas de células de cancro (Fig. S3). Usando PCR específicos de metilação, confirmou-se que o promotor HSPA1A foi fortemente metilado na UM-UC10 e UM-UC13 mas não nos 253J B-V ou SW780 células (Fig. 3C), os quais possivelmente responsáveis ​​por indução HSPA1A induzida por bortezomib defeituoso. Para testar esta possibilidade directamente, examinámos os efeitos do inibidor da histona metiltransferase 5-aza-2′-desoxicitidina em níveis de mRNA induzido por HSPA1A bortezomib basal e no UM-UC10 e células de UM-UC13. O inibidor induzido grandes aumentos em ambas as basais e níveis de proteassoma induzida por um inibidor HSPA1A em ambas as linhas celulares sensíveis ao bortezomib (Fig. 3D). Juntos, estes resultados demonstram que a metilação da cromatina é responsável pela indução HSPA1A defeito observado em células UC10 e de UM-UM-UC13.

. Expressão de HSF1. linhas celulares de cancro da bexiga UM-UC13 253J B-V e foram expostos ao bortezomib durante 12 h e ARNm HSF1 (painel da esquerda) e os níveis de proteína (painel direito) foram medidas por RT-PCR quantitativo e imunotransferência, respectivamente. Os valores representam a média ± EP (n = 2); borrões são representativos de pelo menos duas experiências independentes. B. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) análise da HSF1 de ligação ao promotor HSPA1A. Note-se que basal e vinculativa HSF1 induzida por bortezomibe foi muito reduzida nas células UM-UC13 sensível ao bortezomib. Média ± SEM, n = 3. * P 0,05 C. metilação selectiva do promotor HSPA1A em células de cancro da bexiga humano sensível ao bortezomib. -Metilação específica de PCR foi utilizado para avaliar a cromatina metilação em sensível a drogas (UM-UC10, UM-UC13) e linhas de células resistentes a fármacos (253J B-V, SW780), tal como descrito em Materiais e Métodos. m, metilado; u, não metilado. rácios m /u foram calculados utilizando densitometria. Os dados são representativos de pelo menos duas experiências independentes. D. O DNA metiltransferase inibidor de 5-aza-2′-desoxicitidina restaura HSPA1A expressão em células sensíveis à bortezomib. As células foram incubadas com 5 ^ M 5-AzdC durante 5 dias e em seguida incubadas com ou sem o bortezomib 30 nM durante 6 h, e a expressão HSPA1A foi medida quantitativa por PCR em tempo real. Os valores representam a média ± SEM, n = 3. RQ = quantidade relativa (a GAPDH).

Modulação da HSPA1A e HSPA1B Expressão na HSPA1A

baixas células

Desde UM -UC10 e UM-UC13 faltava expressão HSPA1A, examinamos se a substituição da isoforma HSPA1A iria promover bortezomib resistência. Para resolver isso, nós sobre-expresso de forma estável HSPA1A tanto UM-UC10 e -UC13 células usando um vetor lentivírus. a expressão de ARNm foi confirmada utilizando HSPA1A Hsp72 aumentos de proteínas totais por imunotransf erência (Fig. 4A) e de qRT-PCR. HSPA1A que sobre-expressam as células e as células transduzidas vector vazio foram então expostas ao bortezomib e descobrimos que a sobre-expressão significativamente reduzida de morte celular induzida por bortezomib (Fig. 4B). Por outro lado, porque UM-UC10 e -UC13 células parecia estar depender exclusivamente de mRNA HSPA1B para a expressão da proteína Hsp72, a hipótese de que essas células podem ser particularmente suscetíveis a segmentação de HSPA1B. Para testar isso, usamos siRNA para silenciar transitoriamente HSPA1B em células UM-UC10. Análise de eficiências knockdown revelou que o ARNsi disponível comercialmente pode não visam especificamente isoformas individuais (isto é, siHSPA1A silenciados HSPA1B) (fig. 4C). No entanto, uma combinação de sequências siHSPA1A siHSPA1B e obteve-se o melhor (embora não completo) knockdown global da isoforma de A1B, tanto o ARN e proteína de nível (Fig. 4C). Usando essa estratégia, que confirmou que o bloqueio da indução HSPA1B sensibilizados células UM-UC10 ao bortezomib (Fig. 4D).

A. Efeitos da aplicada superexpressão HSPA1A no mRNA HSPA1A e os níveis de proteína total de Hsp72 em UM-UC10 e células UM-UC13. As células foram transduzidas de forma estável com uma construção de expressão de lentivírus HSPA1A, e níveis HSPA1A foram medidas por RT-PCR quantitativo. Média ± SEM, n = 3. RQ = quantidade relativa (a GAPDH). Os níveis de proteína foram medidas através de imunotransferência. Blots são representativos de duas experiências independentes. B. Efeitos da HSPA1A sobreexpressão em morte celular induzida por bortezomib. As células transduzidas com vector vazio (NT) ou com a construção de expressão HSPA1A foram expostas a 30 nM de bortezomib durante 24 h e a integridade da membrana do plasma foi medida pela absorção de azul de tripano. (A presença de SDP na construção de expressão impedido a utilização do ensaio de morte celular /FACS PI.) Média ± SEM, n = 3. *, P 0,02. C. knockdown de HSPA1B em células de UM-UC10. Painel esquerdo, as eficiências de knockdown de ARNsi contra HSPA1A, HSPA1B, ou ambas as isoformas conforme medido por RT-PCR quantitativo após exposição a 30 nM bortezomib durante 6 h. RQ = quantidade relativa (a GAPDH). Painel da direita, correspondente knockdown dos níveis de proteína HSP72 por as sequências de siRNA diferença após exposição a 30 nM BZ durante 14 h. Os dados são representativos de duas experiências independentes. D. Efeito da HSPA1B knockdown na morte celular induzida por bortezomib em células de UM-UC10. Após 72 h knockdown, as células foram expostas a 30 nM de bortezomib, durante 24 h e a morte celular medida por análise de PI /FACS. Os valores representam a média ± EP (n = 3). * P . 0,01

Cell-induzida bortezomib Hsp72 indução inibe a morte

Para determinar mais directamente se induzida por bortezomibe Hsp72 upregulation promovido resistência, que bateu de forma estável para baixo Hsp72 em 253JB-V células resistentes-bortezomib utilizando um vector lentiviral shRNA (Fig. 5A). Os níveis basais HSPA1A ARNm foram reduzidas em mais de 75% nas células, mas a supressão de ARNm HSPA1A (Fig. 5A. painel superior) e a proteína Hsp72 shRNA-mediada (Fig. 5A, painel inferior) foi menos impressionantes após a exposição ao bortezomib, presumivelmente porque o inibidor de proteassoma produziu uma forte sobre-regulação de tais Hsp72. No entanto, estável knockdown Hsp72 melhorado significativamente a perda induzida por bortezomibe da integridade da membrana plasmática tal como medido por absorção de iodeto de propidio (Fig. 5B). Estudos anteriores concluíram que a indução Hsp72 desempenha uma função citoprotectora na resposta ao stress integrada (ISR) por lisossomas estabilizadores [29]. Como tal, foram comparados os efeitos de bortezomib sobre a integridade lisossomal nas células 253JB-V transduzidas com vector de controlo (253JB V-NT) ou o construto shRNA KD9 HSPA1A-específica. Bortezomib teve pouco ou nenhum efeito na integridade lisossomal nas células 253JB V-NT induzida, mas a perda de forte, dependente da concentração da integridade lisossomal nas células 253JB-V-KD9 (Figura 5C). Em conjunto, estes resultados confirmam que as funções de indução de pct72 induzida por bortezomibe para promover a integridade lisossomal e para inibir a morte celular.